專利名稱：定量檢測大腸桿菌rna的方法及其專用標準品和應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種定量檢測大腸桿菌RNA的方法及其專用標準品和應用。
背景技術：
大腸桿菌(Escherichia coli)是一種食源性致病菌,會引起腹灣、惡心、出血性結腸炎等癥狀。近年來，由大腸桿菌引發(fā)的感染性疾病在許多國家都相繼報道，已經成為世界性的環(huán)境安全性問題。目前，大腸桿菌的傳統(tǒng)檢測方法是培養(yǎng)法。然而，近年的研究發(fā)現(xiàn)，細菌在環(huán)境壓力(如高溫)下可以進入“具有活性但不可培養(yǎng)(viable but nonculturable, VBNC)”的狀態(tài)，無法用常規(guī)培養(yǎng)法檢出，但仍然保持代謝活性和致病性，能夠在環(huán)境壓力解除的條件下恢復其可培養(yǎng)性，引發(fā)嚴重的微生物安全風險。已經有研究表明，大多數(shù)革蘭氏陰性菌(包括大腸桿菌)也可以進入這樣的狀態(tài)。因此，傳統(tǒng)培養(yǎng)法無法檢測到處于VBNC狀態(tài)的大腸桿菌而得到假陰性的結果。PCR技術可以快速、靈敏的檢測到目標菌。然而有研究表明，經過熱處理后，盡管細菌已經喪失細胞活性，但作為PCR擴增模板的DNA仍可以存在數(shù)天，因此常規(guī)PCR技術無法區(qū)分活性菌與非活性菌。與DNA相比，大多數(shù)mRNA較不穩(wěn)定，其半衰期較短(僅幾分鐘)，可以更好的作為活性菌存在的分子信標。已有大量研究證實，細菌體內mRNA的存在與其細胞活性之間存在顯著關系。又有研究表明，處于VBNC狀態(tài)的細菌仍具有轉錄活性，其體內仍可以檢測到一定量的mRNA。實時熒光定量PCR和反轉錄(又稱逆轉錄)為定量檢測樣品中的RNA提供了技術手段。有研究者使用基因組DNA或者質粒DNA片段作為反轉錄實時熒光定量PCR (RT-qPCR)檢測實際樣品中RNA的標準品?？墒牵褂肈NA作為標準品并沒有考慮到反轉錄中的效率問題，從而導致檢測到的RNA與實際相比減少了 84%-98. 6%。因此，以DNA作為檢測RNA的標準品會大大低估樣品中實際的RNA的含量。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種定量檢測大腸桿菌RNA的方法及其專用標準品和應用。本發(fā)明提供了一種定量檢測大腸桿菌RNA的方法，包括如下步驟(I)按照如下方法制作標準曲線；將RNA標準品配制成各個濃度的標準品稀釋液，然后將各個標準品稀釋液反轉錄為cDNA，以cDNA為模板進行實時熒光定量PCR，以實時熒光定量PCR體系中的cDNA對應的RNA拷貝數(shù)(也可對拷貝數(shù)進行數(shù)據處理，如拷貝數(shù)以10為底的對數(shù))和Ct值制作標準曲線方程；(2)提取大腸桿菌的總RNA并反轉錄為cDNA，以cDNA為模板進行實時熒光定量PCRJf Ct值代入所述標準曲線方程，得到大腸桿菌的RNA含量。所述RNA標準品可為所述大腸桿菌的部分核酸片段。
所述步驟(I)的所述實時熒光PCR和所述步驟(2)中的所述實時熒光PCR的反應體系和反應條件均可相同。所述RNA標準品具體可為序列表的序列6所示的單鏈RNA分子。
所述實時熒光PCR采用的引物對具體可為序列表的序列4所示DNA片段和序列表的序列5所示DNA片段組成的引物對。所述標準曲線具體為一元線性回歸曲線。所述實時熒光定量PCR的退火溫度具體可為55. 5° C。以上任意所述方法均可應用于檢測大腸桿菌活菌數(shù)(一個拷貝數(shù)的RNA可以代表一個活菌)。所述檢測大腸桿菌活菌數(shù)具體可為檢測水樣中的大腸桿菌活菌數(shù)。本發(fā)明還保護序列表的序列6所示的單鏈RNA分子。本發(fā)明還保護序列表的序列I所示的雙鏈DNA分子。本發(fā)明還保護定量檢測大腸桿菌RNA的特異引物對，由序列表的序列4所示DNA片段和序列表的序列5所示DNA片段組成。本發(fā)明還保護一種定量檢測大腸桿菌RNA (或檢測大腸桿菌活菌數(shù))的試劑盒，包括標準品和特異引物對；所述標準品為序列表的序列6所示的單鏈RNA分子；所述特異引物對為序列表的序列4所示DNA片段和序列表的序列5所示DNA片段組成的引物對。本發(fā)明還保護標準品和/或特異引物對在制備定量檢測大腸桿菌RNA的試劑盒(或制備檢測大腸桿菌活菌數(shù)的試劑盒)中的應用；所述標準品為序列表的序列6所示的單鏈RNA分子；所述特異引物對為序列表的序列4所示DNA片段和序列表的序列5所示DNA片段組成的引物對。本發(fā)明還保護序列表的序列6所示的單鏈RNA分子和/或特異引物對在檢測大腸桿菌活菌數(shù)中的應用；所述特異引物對為序列表的序列4所示DNA片段和序列表的序列5所示DNA片段組成的引物對。由于細菌的RNA較不穩(wěn)定，半衰期短，因此可以作為活性菌的分子信標。本發(fā)明提供的方法中，將RNA用作定量RNA拷貝數(shù)的標準品(標準品和待測RNA —樣進行了反轉錄，從而扣除了反轉錄效率的影響)，可以更準確的定量大腸桿菌RNA，從而更準確的檢測待測樣本中的大腸桿菌數(shù)量。本發(fā)明采用的標準品具有廣譜識別和特異性相結合的特點，敏感性高，制備方法簡便，可以長期保存，純度好，線性檢測范圍寬，可以用于環(huán)境樣品中大腸桿菌的快速定量檢測。定量PCR具有快速、靈敏的優(yōu)點。因此，本發(fā)明的方法可用于快速檢測環(huán)境中少量的大腸桿菌，為快速檢測活性大腸桿菌提供技術支持。


圖I為采用各個退火溫度得到的PCR擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳圖。圖2為采用引物對乙進行特異性驗證中的PCR擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳圖。圖3為采用各個稀釋液反轉錄的cDNA為模板的PCR擴增曲線圖。圖4為標準曲線圖。圖5為采用各個稀釋液反轉錄的cDNA為模板的溶解曲線圖。
圖6為采用各個稀釋液反轉錄的cDNA為模板的瓊脂糖凝膠電泳圖。圖7為實施例5中的溶解曲線圖。
具體實施例方式以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設置三次重復實驗，結果取平均值。大腸埃希氏桿菌(Escherichia coli),又稱大腸桿菌中國普通微生物菌種保存管理中心(網址為 http://www. cgmcc. net/), CGMCC 編號為 I. 2385。鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium):美國模式培養(yǎng)物集存庫(ATCC,網址為 www. atcc. org/), ATCC 編號為 14028。 恥垢分枝桿菌(Mycobacterium smegmatis):中國普通微生物菌種保存管理中心(網址為 http://www. cgmcc. net/), CGMCC 編號為 CGMCC I. 562。實施例I、引物的合成與標準品的制備一、引物的設計與合成對大腸桿菌的基因組DNA進行分析，選取UidA基因的部分序列，根據該序列設計兩對引物(引物對甲和引物對乙)。引物對甲由uidA-T7_F和uidA-T7_R組成，靶序列為序列表的序列I所示的雙鏈DNA 分子，為 92 Ibp。uidA-T7-F (序列 2) :5，_taatacgactcactataggggcgttacaagaaagcc_3，；uidA-T7-R (序列 3) :5_gcatctcttcagcgtaagggtaatgcga_3，。引物對乙由UidA-F和UidA-R組成，靶序列為序列表的序列I自5’末端第257至443位核苷酸所示的雙鏈DNA分子，為187bp。uidA-F (序列 4) :5，_cgatgtcacgccgtatgttatt_3，；uidA-R (序列 5) :5，-ggtgtagagcattacgctgcg-3，。分別合成以上各條引物。二、標準品的制備I、提取大腸桿菌的基因組DNA。2、以步驟I提取的基因組DNA為模板，采用引物對甲進行PCR擴增，得到PCR擴增產物。3、將步驟2的PCR擴增產物進行2%瓊脂糖凝膠電泳，利用TaKaRa切膠回收試劑盒(TaKaRa Code DV805A)回收約 921bp 的 DNA 片段。4、采用promega體外轉錄試劑盒(promega Code P1320)將步驟3回收的DNA片段進行體外轉錄，獲得與所述DNA片段對應的RNA片段(標準品)。二、標準品的測序I、將步驟二獲得的標準品進行反轉錄，獲得與其對應的cDNA。2、采用天根DNA純化回收試劑盒(Code DP214)回收純化步驟I得到的cDNA。3、將步驟2得到的cDNA進行測序，測序結果如序列表的序列I所示(序列I中，自5’末端第I至20位核苷酸為T7啟動子)。測序結果表明，步驟二得到的標準品為序列表的序列6所示的單鏈RNA。實施例2、標準品的梯度稀釋檢測RNA拷貝數(shù)的方法利用超微量核酸蛋白測定儀(NanoDrop ND-2000C，美國)測定RNA濃度，然后按照如下公式計算RNA拷貝數(shù)
權利要求
1.一種定量檢測大腸桿菌RNA的方法，包括如下步驟 (1)按照如下方法制作標準曲線^fRNA標準品配制成各個濃度的標準品稀釋液，然后將各個標準品稀釋液反轉錄為cDNA，以cDNA為模板進行實時熒光定量PCR，以實時熒光定量PCR體系中的cDNA對應的RNA拷貝數(shù)和Ct值制作標準曲線方程； (2)提取大腸桿菌的總RNA并反轉錄為cDNA，以cDNA為模板進行實時熒光定量PCR，將Ct值代入所述標準曲線方程，得到大腸桿菌的RNA含量。
2.如權利要求I所述的方法，其特征在于所述RNA標準品為所述大腸桿菌的部分核酸片段；所述步驟(I)的所述實時熒光PCR和所述步驟(2)中的所述實時熒光PCR的反應體系和反應條件相同。
3.如權利要求2所述的方法，其特征在于所述RNA標準品為序列表的序列6所示的單鏈RNA分子。
4.如權利要求3所述的方法，其特征在于所述實時熒光PCR采用的引物對為序列表的序列4所示DNA片段和序列表的序列5所示DNA片段組成的引物對。
5.權利要求I所述方法在檢測大腸桿菌活菌數(shù)中的應用。
6.序列表的序列6所示的單鏈RNA分子或序列表的序列I所示的雙鏈DNA分子。
7.定量檢測大腸桿菌RNA的特異引物對，由序列表的序列4所示DNA片段和序列表的序列5所示DNA片段組成。
8.一種試劑盒，包括標準品和特異引物對；所述標準品為序列表的序列6所示的單鏈RNA分子；所述特異引物對為序列表的序列4所不DNA片段和序列表的序列5所不DNA片段組成的引物對；所述試劑盒的功能為定量檢測大腸桿菌RNA或檢測大腸桿菌活菌數(shù)。
9.標準品和/或特異引物對在制備試劑盒中的應用；所述標準品為序列表的序列6所示的單鏈RNA分子；所述特異引物對為序列表的序列4所示DNA片段和序列表的序列5所示DNA片段組成的引物對；所述試劑盒的功能為定量檢測大腸桿菌RNA或檢測大腸桿菌活菌數(shù)。
10.序列表的序列6所示的單鏈RNA分子和/或權利要求7所述特異引物對在檢測大腸桿菌活菌數(shù)中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種定量檢測大腸桿菌RNA的方法及其專用標準品和應用。本發(fā)明提供的方法包括如下步驟(1)按照如下方法制作標準曲線；將RNA標準品配制成各個濃度的標準品稀釋液，然后將各個標準品稀釋液反轉錄為cDNA，以cDNA為模板進行實時熒光定量PCR，以實時熒光定量PCR體系中的cDNA對應的RNA拷貝數(shù)(也可對拷貝數(shù)進行數(shù)據處理，如拷貝數(shù)以10為底的對數(shù))和Ct值制作標準曲線方程；(2)提取大腸桿菌的總RNA并反轉錄為cDNA，以cDNA為模板進行實時熒光定量PCR，將Ct值代入所述標準曲線方程，得到大腸桿菌的RNA含量。本發(fā)明的方法可用于快速檢測環(huán)境中少量的大腸桿菌，為快速檢測活性大腸桿菌提供技術支持。
文檔編號C12Q1/06GK102936619SQ20121020218
公開日2013年2月20日 申請日期2012年6月15日 優(yōu)先權日2012年6月15日
發(fā)明者何苗, 林怡雯, 李丹, 吳舒旭 申請人:清華大學