專利名稱：一種微生物谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及酶工程領(lǐng)域，具體涉及一種微生物谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶(MicrobialTransglutaminase,簡(jiǎn)稱 MTG)及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶(Transglutaminase, EC 2.3.2. 13,簡(jiǎn)稱TG)可以催化?；D(zhuǎn)移反應(yīng)，催化蛋白內(nèi)谷氨酰胺Y-甲?；c賴氨酸的e-氨基交聯(lián)。在原核生物和真核生物中均存在TG。而微生物谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶(MTG)由于其不依賴于鈣的活性，自從被發(fā)現(xiàn)以后就被廣泛應(yīng)用于工業(yè)，在食品、化工、醫(yī)藥等行業(yè)均有廣泛使用。
微生物谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶(microbial transglutaminase縮寫(xiě)MTG)與凝血因子FACTOR XIII同屬于一個(gè)家族的酶，具有與其類似的作用效果，很多研究表明了其在凝血反應(yīng)中的作用。利用MTG可以交聯(lián)明膠，形成良好的多空物或者網(wǎng)狀物，可以在多方面應(yīng)用，例如交聯(lián)I型膠原蛋白，形成抗高溫的膠(Nomura Y, Toki S，Ishii Y, ShiraiK. Biosci Biotechnol Biochem. 2001Apr; 65 (4) :982-5), MTG 與明膠作用形成的膠不會(huì)受熱溶解(Chen T, Embree HD, Brown EM, Taylor MM, Payne GF. , Biomaterials. 2003Aug;24(17) :2831-41，美國(guó)專利5，834，232)并可用于細(xì)胞固定(Chen T, Small DA, McDermottMK, Bentley WE, Payne GF.，Biomacromolecules. 2003Nov_Dec; 4 (6) : 1558-63)，生物支架(Broderick EP,0’Halloran DM, Rochev YA, Griffin M, Collighan RJ, Pandit AS. J BiomedMater Res B Appl Biomater. 2005Jan 15;72(I):37-42. ；Chen RN, Ho HO, Sheu MT. Biomaterials. 2005Jul; 26 (20) :4229-35)?？梢杂肕TG增加明膠的交聯(lián)，以提高其強(qiáng)度和黏性，從而用于制作止血材料、止血敷料或止血用密封材料(McDermott MK, Chen T, WilliamsCM, Markley KM, Payne GF. Biomacromolecules. 2004 Jul-Aug; 5 (4) : 1270-9 ;中國(guó)專利200980131973. 6 和 200780051215. 4 ;美國(guó)專利8, 133，484 ；歐洲專利TO2012017415、W02011132153、BRPI0718328、ZA200904470、EP2303344、EP2303341 及 CN102124058)。對(duì)于醫(yī)療產(chǎn)品來(lái)說(shuō)，酶的穩(wěn)定性十分重要，特別是對(duì)于常溫保存的產(chǎn)品來(lái)說(shuō)更是如此。但是MTG的最佳反應(yīng)溫度一般在50°C _55°C左右，在常溫(25°C )時(shí)酶活只有最佳反應(yīng)溫度的20%左右，即使是在體溫(37°C )左右，酶活也只有最佳酶活的一半左右(BuettnerK, Hertel TC, Pietzsch M, Amino Acids. 2012,42(2-3):987-96. ；Marx CK,HertelTC, Pietzsch M, J Biotechnol. 2008 Sep 10; 136 (3-4) : 156-62.) 此外，MTG 酶的熱穩(wěn)定性比較差，60°C 10分鐘可以導(dǎo)致MTG酶活損失80%左右(Marx CK, Hertel TC, Pietzsch M,J Biotechnol. 2008 SeplO;136 (3-4):156-62.) 有文獻(xiàn)報(bào)道具有熱穩(wěn)定性MTG的突變位點(diǎn)包括2位的絲氨酸突變?yōu)槔野彼幔?3位的絲氨酸突變?yōu)槔i氨酸或酪氨酸，24位的酪氨酸突變?yōu)樘於０罚?94位的賴氨酸突變?yōu)榱涟彼峄虍惲涟彼幔?01位的絲氨酸突變?yōu)楦彼幔?50位的甘氨酸突變位有氨酸，157位的甘氨酸突變?yōu)榻z氨酸。本發(fā)明提出一種新的微生物谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶，其氨基酸序列結(jié)構(gòu)不同于已經(jīng)文獻(xiàn)報(bào)道，突變位點(diǎn)具有特定的組合，且最佳活性溫度向較低溫度偏離，還具有較好熱穩(wěn)定性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明克服現(xiàn)有技術(shù)以上缺陷，提出了一種新的微生物酰胺轉(zhuǎn)氨酶，其氨基酸序列如SEQ ID No. 3所示，其中，第10位上的氨基酸為絲氨酸、組氨酸或蘇氨酸；第241位上的氨基酸為甘氨酸、蘇氨酸或丙氨酸；第284位上的氨基酸為纈氨酸、酪氨酸或丙氨酸。進(jìn)一步地，所述第10位上的氨基酸為絲氨酸或者蘇氨酸；所述第241位上的氨基酸為丙氨酸或者甘氨酸；所述第284位上的氨基酸纈氨酸或者酪氨酸。進(jìn)一步地，本發(fā)明的第10位氨基酸還可以是谷氨酰胺、脯氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、絲氨酸、組氨酸或者蘇氨酸；第241位氨基酸還可以是谷氨酰胺、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、組氨酸、甘氨酸、蘇氨酸或者丙氨酸；第284位氨基 酸還可以是谷氨酰胺、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、組氨酸、甘氨酸、纈氨酸、酪氨酸或者丙氨酸。本發(fā)明中，所述微生物酰胺轉(zhuǎn)氨酶活性的反應(yīng)溫度在25-75攝氏度之間。優(yōu)選地，其酶活性的反應(yīng)溫度在25-45攝氏度之間。更優(yōu)選地，其酶活性為在25攝氏度時(shí)所述酶活性仍然不低于35U。本發(fā)明微生物酰胺轉(zhuǎn)氨酶的制備方法，包括以下步驟合成如SEQ ID NO. 8所示序列，將其克隆到大腸桿菌表達(dá)載體pET-32a并將其轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21中，得到基因工程菌。將該基因工程菌發(fā)酵表達(dá)，并破碎菌體，用親和層析含有突變的MTG的融合蛋白。向融合蛋白溶液中按照融合蛋白的質(zhì)量加入1/10質(zhì)量的分散酶，37攝氏度作用30分鐘，用DEAE離子交換法純化。最終可以獲得突變MTG蛋白。本發(fā)明還提供了一種微生物酰胺轉(zhuǎn)氨酶的應(yīng)用，是將如權(quán)利要求I所述的微生物酰胺轉(zhuǎn)氨酶在10-75攝氏度下交聯(lián)明膠。優(yōu)選地，在25-45攝氏度下交聯(lián)明膠。更優(yōu)選地，在室溫(25攝氏度)下將微生物酰胺轉(zhuǎn)氨酶與明膠組合應(yīng)用。本發(fā)明微生物酰胺轉(zhuǎn)氨酶在室溫下催化明膠交聯(lián)的效率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于野生型的微生物酰胺轉(zhuǎn)氨酶。所述微生物酰胺轉(zhuǎn)氨酶用于催化明膠交聯(lián)，還可用于制備止血?jiǎng)?。本發(fā)明微生物谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶(MTG)，可通過(guò)紫外誘變篩選得到，在70°C高溫條件處理后該MTG仍然體現(xiàn)了很高的殘余酶活。研究表明，本發(fā)明微生物谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶的最佳活性溫度為40°C -50°C，優(yōu)選為40°C，而野生型MTG的最佳活性溫度為55°C，可見(jiàn)，本發(fā)明微生物谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶的最佳活性溫度明顯較低，且在常溫及室溫如25V _37°C時(shí)其比酶活顯著高于野生型MTG。通過(guò)DNA測(cè)序結(jié)果顯示，與野生型MTG相比，本發(fā)明微生物谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶(MTG)發(fā)生了突變，例如，突變?yōu)榈?0位的丙氨酸或絲氨酸、第241位的脯氨酸或丙氨酸、第284位的絲氨酸或纈氨酸。發(fā)生了突變變異的本發(fā)明MTG在常溫下交聯(lián)蛋白的能力大大提高，從而可以在常溫高效粘合蛋白，可有效用于明膠制品的交聯(lián)。本發(fā)明微生物谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶(MTG)具有新的氨基酸結(jié)構(gòu)及新性能，在常溫及偏低溫度下具較好比酶活及最佳酶活性。本發(fā)明微生物谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶的純化過(guò)程涉及蛋白質(zhì)工程相關(guān)技術(shù)，可以在包括但不限于醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域中作為包括但不限于輔助材料、藥物或者添加劑等應(yīng)用。


圖I表示實(shí)施例I的本發(fā)明微生物谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶的酶活測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖2表示實(shí)施例2中部分誘變菌株的篩選結(jié)果示意圖。圖3表示實(shí)施例3中誘變菌株MTG基因的PCR產(chǎn)物電泳圖。圖4表示誘變的茂源鏈霉菌MTG基因與野生型MTG基因的核苷酸序列對(duì)比。圖5表示實(shí)施例6中純化的微生物谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶蛋白電泳圖。圖6表示本發(fā)明微生物谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶與野生型MTG在不同溫度下的酶活。
具體實(shí)施方式
結(jié)合以下具體實(shí)施例及附圖，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明。實(shí)施本發(fā)明的過(guò)程、條件、試劑、實(shí)驗(yàn)方法等，除以下專門提及的內(nèi)容之外，均為本領(lǐng)域的普遍知識(shí)和公知常識(shí)，本發(fā)明沒(méi)有特別限制內(nèi)容。實(shí)施例I酶活測(cè)定I)測(cè)酶活試劑配制A 液(0. 5L):將 0. 015mol (5. 06g)底物 Na-CBZ-Gln-Gly,0. 05mol (3. 475g)鹽酸羥胺、0. 005mol (I. 536g)還原型谷胱甘肽加入400ml蒸懼水于燒杯中，用磁力攪拌器攪拌20分鐘后，加入0. Imol (12. llg))Tris，用6mol/L(或lmol/L)鹽酸調(diào)pH至6. 0，將溶液移至500ml容量瓶中，用蒸餾水洗滌燒杯3次倒入容量瓶中，定容至500ml。B 液3mol/L HCl,12% 三氯乙酸(W/V)、5% 三氯化鐵(W/V，溶于 0. lmol/L 鹽酸，再過(guò)濾)按I: I: I的體積比混合。2)酶活測(cè)定放線菌發(fā)酵液過(guò)濾，取濾液稀釋5倍。實(shí)驗(yàn)組取0.2ml稀釋液，加2ml A液37V溫育10分鐘，再加2ml B液。對(duì)照組取0. 2ml稀釋液，加2ml B液37°C溫育10分鐘，再加2mlA液。于525nm測(cè)定吸光值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖I所示酶活測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線，橫坐標(biāo)為酶活單位(U/mL)，縱坐標(biāo)為酶反應(yīng)液在525nm處的吸光值，圖I表明該曲線的線性較好，相關(guān)系數(shù)大于99%。實(shí)施例2野生菌株的誘變野生型MTG菌株為茂源鏈霉菌(Streptomyces mobaraensis) STK4菌株。野生型MTG的核苷酸序列如SEQ ID NO. 6所示，氨基酸序列如SEQ ID NO. 7所示。培養(yǎng)基配置高氏一號(hào)培養(yǎng)基(g/L):可溶性淀粉20，KN031, MgS04 7H20 0. 5，K2HP04 3H20 0. 5，NaCl 0. 5，F(xiàn)eS04 7H20 0. 01，瓊脂 20，pH 7. 2-7. 4。發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):甘油 20，酵母膏 6，魚(yú)粉蛋白胨 25，MgS04 7H20 2，K2HP04 3H20 2，pH 7.4。向高氏一號(hào)培養(yǎng)基中加入IOml冷無(wú)菌水，用接種針充分刮取表面菌絲，打散孢子，無(wú)菌濾紙過(guò)濾。操作在紅燈或避光條件下進(jìn)行，提前0. 5h開(kāi)紫外燈，使光源穩(wěn)定。取濃度約為107個(gè)孢子/mL的孢子懸浮液3ml置于直徑為6cm滅菌平皿中，利用磁力攪拌子攪拌，在紫外燈功率15W條件下，不同輻照距離，紫外輻照不同的時(shí)間進(jìn)行誘變。避光Ih后，暗環(huán)境中將不同稀釋度的孢子懸液涂布于高氏培養(yǎng)基上。30°C培養(yǎng)7天。
挑取單菌落，在發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時(shí)，分別測(cè)定37°C時(shí)候選菌株和野生菌株的酶活。部分篩選結(jié)果如圖2所示，其中，WT表示未經(jīng)誘變的野生型菌株的發(fā)酵酶活；1#-5#分別是5株不同的誘變菌株的發(fā)酵酶活。MTG的酶活(U/mL)為發(fā)酵液的酶活，測(cè)定酶活的反應(yīng)溫度為37°C。圖2表明2#菌株的酶活較野生菌株高。實(shí)施例3突變體MTG基因的獲取基因組抽提將實(shí)施例2中液體培養(yǎng)的2#突變菌株的新鮮菌絲體接種于新鮮培養(yǎng)基，培養(yǎng)24小時(shí)左右；離心收集IOml菌體；新鮮菌體于研缽(一 20°C預(yù)冷)中，反復(fù)液氮研磨至細(xì)粉狀，迅速平均分裝至2個(gè)I. 5mL離心管中；加TE Buffer 550 y L，加65°C預(yù)熱的20% SDS溶液30 u L，漩渦振蕩5S，加20mg/mL蛋白酶K 20 u L,輕輕混勻，37°C保溫Ih ;加等體積Tris飽和酹/氯仿/異戍醇(25 24 I)抽提,輕微顛倒混勻，IOOOOr / min離心IOmin ;小心吸取上清至新離心管中,加等體積氯仿/異戍醇(24 I)抽提,IOOOOr / min,離心5min ;吸取上清液與等體積異丙醇(4°C預(yù)冷)混勻,然后IOOOOr / min離心5min,棄上清。沉淀用lmL70%乙醇(4°C預(yù)冷)洗漆(顛倒、離心Imin),自然風(fēng)干,加入40uL TE溶解，-20°C保存?zhèn)溆谩?引物設(shè)計(jì)設(shè)計(jì)了一對(duì)引物可以通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)獲取MTG基因的全序列，如SEQ ID NO. I、SEQ ID NO. 2 所示Pf:CTCAACGAAAGCGCTCCGGCCGCTTC ；Pr:CGCTCACATCACGGCCAGCCCTGC。PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件將上述獲得的基因組DNA和引物混合，按如下條件進(jìn)行PCR 反應(yīng)=Taq 酶反應(yīng)液(2 倍濃度)25 y L、引物 Pf (2. 5mmol/mL) 2 y L、引物 Pr (2. 5mmol/mL) 2 ii L、DNA2 u L及無(wú)菌水。94°C變性I分鐘、55 °C退火30秒、72°C 2分鐘，一共40個(gè)循環(huán)。電泳檢測(cè)PCR純度，結(jié)果如圖3所示，左邊泳道是分子量標(biāo)準(zhǔn)DNA，右邊泳道為PCR片段電泳結(jié)果。PCR片段大小在IOOObp與2000bp之間，與理論值1058bp —致。實(shí)施例4突變MTG基因的測(cè)序向?qū)嵤├?中的PCR產(chǎn)物中加入2倍體積的無(wú)水乙醇，混勻，室溫放置5分鐘。12000rmp離心10分鐘，棄盡上清；用70%的乙醇洗沉淀一次。干燥，用50 y L無(wú)菌水溶解沉淀。按如下體系反應(yīng)無(wú)菌水溶解的PCR產(chǎn)物I y L、pUC19-T載體(Takara公司)0. 5 y L、連接酶0. 5 u L、緩沖液(10倍濃度)5 ii L及無(wú)菌水43 u L，混勻，16°C反應(yīng)20分鐘。將上述反應(yīng)后的產(chǎn)物取5 iiL，加入到IOOii L大腸桿菌DH5 a感受態(tài)細(xì)胞(Takara公司)，4°C反應(yīng)30分鐘，42°C反應(yīng)90秒，加入LB培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)I小時(shí)，將菌液涂布與LB平板上。待菌落形成后，送測(cè)序公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果如圖4所示，與野生型MTG基因相比較，實(shí)驗(yàn)獲得的2#突變株的MTG基因發(fā)生了突變，其中，第28位的G突變?yōu)門，第721位的C突變?yōu)镚，第850位的A突變?yōu)镚，第851位的G突變?yōu)門，如SEQ ID NO. 4所示。這些突變直接導(dǎo)致了 MTG氨基酸序列中第10位氨基酸Xaa由丙氨酸突變?yōu)榻z氨酸，第241位氨基酸Yaa由脯氨酸突變?yōu)楸彼?，?84位氨基酸Zaa由絲氨酸突變?yōu)槔i氨酸，如SEQ ID NO. 5所示。實(shí)施例5MTG蛋白的一般純化發(fā)酵培養(yǎng)基和菌株同實(shí)施例2，將茂源鏈霉菌孢子接種到裝有30mL發(fā)酵培養(yǎng)基的，培養(yǎng)28小時(shí)。在4°C離心機(jī)中12000rmp離心30分鐘，去除菌體和固體雜質(zhì)，獲得20mL培養(yǎng)基上清。加入40mL無(wú)水乙醇，4°C放置I小時(shí)。4°C離心機(jī)中12000rmp離心30分鐘，棄盡上清，收集沉淀。將沉淀置于安倍瓶，冷凍干燥機(jī)中凍干36小時(shí)，即得到初步提純的野生型MTG蛋白。
將突變的茂源鏈霉菌孢子接種到裝有30mL發(fā)酵培養(yǎng)基的，培養(yǎng)24小時(shí)。其他操作步驟同上，純化得到突變MTG蛋白。實(shí)施例6本發(fā)明突變MTG蛋白的精細(xì)純化將實(shí)施例5中得到的蛋白利用離子交換柱進(jìn)行蛋白精細(xì)純化。填料為DEAE-825，平衡液為0. 05M的tris緩沖液，pH7. 4。流動(dòng)相為pH6. 0的0. lmol/L磷酸二氫鈉緩沖液。收集各個(gè)組分，電泳檢測(cè)，得到純度較好的MTG蛋白。將該組分脫鹽后凍干。電泳結(jié)果如圖5所示，左邊泳道顯示的是分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)，右邊泳道顯示的是純化后的MTG蛋白。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示該蛋白大小與預(yù)期37. 9kDa的分子量大小一致，而且純度很高，電泳只有單一的條帶，純度大于99%。實(shí)施例6不同溫度下突變MTG蛋白的比活性測(cè)定 將純化得到的野生型MTG蛋白和本發(fā)明突變MTG蛋白分別在25 °C、37 °C >45 V、55°C、75°C下測(cè)定酶活。測(cè)定酶活所用方法同實(shí)施例I所述。測(cè)活使用的溶液在反應(yīng)前分別在對(duì)應(yīng)的溫度下預(yù)熱2分鐘。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6所示，在不同反應(yīng)溫度下，本發(fā)明突變MTG的比酶活表現(xiàn)出了與野生型MTG完全不同的走勢(shì)。本發(fā)明突變MTG最佳反應(yīng)溫度在45°C左右，而野生型MTG最佳反應(yīng)溫度在55°C左右，本發(fā)明MTG最佳反應(yīng)溫度明顯低于野生型MTG0而且，在25°C _75°C下，本發(fā)明MTG比酶活均顯著高于野生型。在37°C時(shí)本發(fā)明MTG比酶活達(dá)到了 41U/mg，比野生型MTG酶活高了 51. 9%。此外，在55°C以上的高溫條件下野生型MTG活性急劇下降而本發(fā)明MTG仍保留較高酶活。65°C _75°C時(shí)本發(fā)明MTG仍保留較高酶活，而此時(shí)野生型MTG幾乎已經(jīng)失活?？梢?jiàn)，比野生型MTG相比較，本發(fā)明突變MTG具有顯著良好的酶活力以及耐熱穩(wěn)定性。實(shí)施例7本發(fā)明突變MTG蛋白與明膠的作用(I)不同濃度的本發(fā)明MTG和野生型MTG與明膠的相互作用將含有20%低熔點(diǎn)明膠的溶液加熱至60°C并劇烈攪拌，然后將溶液置于37°C保溫過(guò)夜備用，制備得到明膠溶液。在50mL上述明膠溶液中分別加入0. lmg、ImgUOmg野生型MTG (對(duì)照組)、本發(fā)明MTG (實(shí)驗(yàn)組)，測(cè)定粘度。粘度測(cè)試在每次粘度計(jì)測(cè)試中，將上述加入MTG的明膠溶液置于燒杯中，追蹤混合的明膠-MTG溶液經(jīng)歷膠凝時(shí)的粘度。通過(guò)記錄每個(gè)測(cè)試組達(dá)到最大粘度的30%和90%所需的時(shí)間來(lái)比較不同的測(cè)試組，所述最大粘度能夠在比速下且具有用于那個(gè)測(cè)試的特定轉(zhuǎn)自的粘度計(jì)記錄。本實(shí)驗(yàn)采用具有T-E“t-bar”轉(zhuǎn)子的DV II+PR0數(shù)字粘度計(jì)(Brolkfield公司)轉(zhuǎn)子最大可記錄粘度是10 X 106cP,因此，30%和90%點(diǎn)分別為3 X 106cP和9 X 106cP。整個(gè)反應(yīng)過(guò)程測(cè)試溶液都浸沒(méi)在37°C水浴中。NT表示10分鐘后仍未達(dá)到預(yù)定粘度。結(jié)果如表I所示，在相同MTG酶濃度下本發(fā)明突變MTG的膠凝效果遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于野生型MTG，且隨著酶濃度提高，凝膠效果也隨之極大地提高。實(shí)驗(yàn)結(jié)果還表明，在較低濃度(0. Img)時(shí)，本發(fā)明仍然可以使明膠凝固，而野生型不能使明膠凝固。表I本發(fā)明突變MTG和野生型MTG對(duì)凝膠時(shí)間的影響
權(quán)利要求
1.一種微生物酰胺轉(zhuǎn)氨酶，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID No. 3所示，其中，第10位上的氨基酸為絲氨酸、組氨酸或蘇氨酸；第241位上的氨基酸為甘氨酸、蘇氨酸或丙氨酸；第284位上的氨基酸為纈氨酸、酪氨酸或丙氨酸。
2.如權(quán)利要求I所述的微生物酰胺轉(zhuǎn)氨酶，其特征在于，所述第10位上的氨基酸為絲氨酸或蘇氨酸；所述第241位上的氨基酸為丙氨酸或甘氨酸；所述第284位上的氨基酸為纈氨酸或酪氨酸。
3.如權(quán)利要求I所述的微生物酰胺轉(zhuǎn)氨酶，其特征在于，其酶活性的反應(yīng)溫度在25-75攝氏度之間。
4.如權(quán)利要求3所述的微生物酰胺轉(zhuǎn)氨酶，其特征在于，其酶活性的反應(yīng)溫度在25-45攝氏度之間。
5.如權(quán)利要求3所述的微生物酰胺轉(zhuǎn)氨酶，其特征在于，其酶活性為在25攝氏度時(shí)的酶活性不低于35U。
6.一種微生物酰胺轉(zhuǎn)氨酶的應(yīng)用，其特征在于，將如權(quán)利要求I所述的微生物酰胺轉(zhuǎn)氨酶在25-75攝氏度下交聯(lián)明膠。
7.如權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，將所述微生物酰胺轉(zhuǎn)氨酶在25-45攝氏度下交聯(lián)明膠。
8.—種微生物酰胺轉(zhuǎn)氨酶的應(yīng)用，其特征在于，將如權(quán)利要求I所述的微生物酰胺轉(zhuǎn)氨酶與明膠交聯(lián)用于止血。
全文摘要
本發(fā)明提供一種新的微生物谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶(MTG)，其氨基酸序列如SEQ ID No.3所示，其中，第10位上的氨基酸為絲氨酸、組氨酸或蘇氨酸；第241位上的氨基酸為甘氨酸、蘇氨酸或丙氨酸；第284位上的氨基酸為纈氨酸、酪氨酸或丙氨酸。所述微生物谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶在常溫下具有強(qiáng)比活力，用于交聯(lián)明膠，可用作止血材料。
文檔編號(hào)C12R1/465GK102719411SQ201210202170
公開(kāi)日2012年10月10日 申請(qǐng)日期2012年6月18日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月18日
發(fā)明者劉明耀, 金明飛, 高紅亮 申請(qǐng)人:華東師范大學(xué)