一種能感染中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞病毒適應(yīng)株及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于病毒學(xué)領(lǐng)域；更具體地，本發(fā)明涉及一種能感染中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞病 毒適應(yīng)株及其在疫苗開(kāi)發(fā)方面的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 腸道病毒EV71型屬于小RNA病毒科腸道病毒屬，感染者主要為學(xué)齡前兒童，主要 引起手足口病，同時(shí)還可以引起無(wú)菌性腦膜炎，腦炎，脊髓灰質(zhì)炎樣麻痹等神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)的 并發(fā)癥。1974年首次報(bào)道以來(lái)，已在世界范圍內(nèi)引起多次爆發(fā)與流行。1997年開(kāi)始在亞太 地區(qū)大規(guī)模流行并呈上升趨勢(shì)，已經(jīng)成為一種嚴(yán)重的公共健康問(wèn)題。1998年我國(guó)臺(tái)灣地區(qū) EV71大爆發(fā)，129106例發(fā)生手足口病和紅斑疹，405例為嚴(yán)重的中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染，死亡78 例。
[0003] 2008年，我國(guó)安徽阜陽(yáng)手足口病疫情爆發(fā)，其中23例死亡，隨后，北京、上海、浙 江、廣東等地區(qū)也相繼有EV71感染的報(bào)道。2009年繼河南省明泉縣報(bào)道手足口病感染并有 十例病人死亡后，相繼在山東、北京、四川、廣西、云南、甘肅、貴州等多個(gè)省市流行，患病人 數(shù)和死亡人數(shù)超過(guò)2008年近兩倍。2010年我國(guó)內(nèi)地共有1，774, 669個(gè)報(bào)告病例，造成905 例死亡和超過(guò)2. 1萬(wàn)例重癥。死亡原因主要為由中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染而導(dǎo)致的腦干腦炎，肺 水腫和出血。
[0004] EV71感染后的治療藥物包括干擾素（IFN-α)、靜脈注射丙種球蛋白（IV I G)和 一種新藥Pleconaril。盡管有EV71滅活疫苗主動(dòng)免疫制止感染的流行以及基因工程亞單 位疫苗成功地用于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的報(bào)道，但目前尚沒(méi)有被公認(rèn)是十分有效的疫苗。因此，研制出 有效的抗EV71病毒的疫苗迫在眉睫，對(duì)保障兒童的生命安全和健康成長(zhǎng)有重要意義。
[0005] 目前開(kāi)展的EV71疫苗研究種類(lèi)包括滅活全病毒疫苗，減毒活疫苗，病毒樣顆粒疫 苗（桿狀病毒表達(dá)的VLP疫苗），DNA疫苗和大腸桿菌表達(dá)的VPl亞單位疫苗等。其中減毒 活疫苗不破壞病毒的構(gòu)象表位，并可誘導(dǎo)產(chǎn)生具有保護(hù)作用的中和抗體，且具有一定的交 叉保護(hù)能力。但減毒EV71還具有一定的毒力，有毒力恢復(fù)的危險(xiǎn)，存在一定的安全隱患。
[0006] 桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的VLP可以誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生細(xì)胞和體液免疫，對(duì)小鼠具有一 定的保護(hù)能力，但是還缺乏VLP交叉保護(hù)的研究。其他VPl亞單位疫苗及DNA疫苗誘導(dǎo)機(jī) 體產(chǎn)生的中和抗體滴度較低，尚難以作為疫苗開(kāi)發(fā)，需進(jìn)行進(jìn)一步研究。
[0007] EV71全病毒滅活疫苗有較好的免疫原性，生產(chǎn)工藝成熟，是研發(fā)進(jìn)展最快的疫苗。 2013年3月中國(guó)自主研發(fā)的EV71滅活疫苗III期臨床試驗(yàn)順利完成，為EV71疫苗上市從 而有效預(yù)防EV71型手足口病提供了科學(xué)依據(jù)。
[0008] 利用遺傳進(jìn)化上跟人類(lèi)比較遠(yuǎn)的蒼鼠 CHO-K細(xì)胞生產(chǎn)EV71全病毒滅活疫苗理論 上比MDCK細(xì)胞和CHO-K細(xì)胞更加安全。但是，目前本領(lǐng)域還沒(méi)有在CHO-K細(xì)胞上進(jìn)行研制 的EV71病毒疫苗。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明的目的在于提供一種能感染中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞病毒適應(yīng)株及其應(yīng)用。
[0010] 在本發(fā)明的第一方面，提供一種腸道病毒71突變株，其基因組編碼結(jié)構(gòu)蛋白VP1、 VP2、VP3、VP4及非結(jié)構(gòu)蛋白2A、2B、2C、3A、3B、3C、3D ;其中，VPl的第36位氨基酸為Asn，第 258位氨基酸為Val ;2A的第77位氨基酸為T(mén)hr ;2C的第171位氨基酸為Met，第305位氨 基酸為Ala。
[0011] 在一個(gè)優(yōu)選例中，所述的VP4的氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示；所述的VP2的氨 基酸序列如SEQ ID NO: 3所示；所述的VP3的氨基酸序列如SEQ ID NO: 4所示；所述的VPl 的氨基酸序列如SEQ ID N0:5所示；所述的2A的氨基酸序列如SEQ ID N0:6所示；所述的 2B的氨基酸序列如SEQ ID NO: 7所示；所述的2C的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示；所述 的3A的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示；所述的3B的氨基酸序列如SEQ ID NO: 10所示； 所述的3C的氨基酸序列如SEQ ID NO: 11所示；或所述的3D的氨基酸序列如SEQ ID NO: 12 所示。
[0012] 在另一優(yōu)選例中，所述的腸道病毒71突變株，其基因組編碼的蛋白的氨基酸序列 如 SEQ ID NO: 13 所示。
[0013] 在另一優(yōu)選例中，所述的腸道病毒71突變株的基因組具有SEQ ID NO: 1所示的核 苷酸序列。
[0014] 在本發(fā)明的另一方面，提供所述的腸道病毒71突變株的用途，用于基于CHO細(xì)胞 建立腸道病毒71病毒反向遺傳學(xué)技術(shù)；或用于克隆、進(jìn)一步改造腸道病毒71病毒以增強(qiáng)病 毒擴(kuò)增能力或者降低其對(duì)人的細(xì)胞的感染性，或者改變腸道病毒71病毒對(duì)宿主親嗜性。
[0015] 在本發(fā)明的另一方面，提供所述的腸道病毒71突變株的用途，用于制備減毒EV71 活疫苗或滅活疫苗；或
[0016] 用于預(yù)防腸道病毒71以及其它引起手足口病的腸道病毒的感染。
[0017] 在本發(fā)明的另一方面，提供所述的腸道病毒71突變株的用途，用于制備腸道病毒 71感染的細(xì)胞模型，或用于評(píng)價(jià)疫苗的保護(hù)效果或安全性，或用于減毒EV71活疫苗或滅活 疫苗的研究；較佳地，所述的細(xì)胞是CHO細(xì)胞。
[0018] 在一個(gè)優(yōu)選例中，所述的腸道病毒71感染的細(xì)胞模型用于抗腸道病毒71感染藥 物的篩選、藥效研究。
[0019] 在本發(fā)明的另一方面，提供一種試劑盒，其中包含容器，以及裝于容器中的所述的 腸道病毒71突變株。
[0020] 在一個(gè)優(yōu)選例中，所述的試劑盒用于制備腸道病毒71感染的細(xì)胞模型，或用于評(píng) 價(jià)疫苗的保護(hù)效果或安全性，或用于減毒EV71活疫苗或滅活疫苗的研究。
[0021] 本發(fā)明的其它方面由于本文的公開(kāi)內(nèi)容，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn) 的。
【附圖說(shuō)明】
[0022] 圖UMAVS573盲傳 CHO-K細(xì)胞系篩選獲得的使CHO-K出現(xiàn)明顯病變的CHO-K適應(yīng) 株（CAVS)。
[0023] 圖2、病毒滴度（TCID50)測(cè)定。
[0024] 圖3、CAVS-5#對(duì)于CHO-K細(xì)胞的感染圖，其中MOCK為正常CHO-K細(xì)胞。
[0025] 圖4、CAVS-5#，MAVS，F(xiàn)Y573病毒分別在不同細(xì)胞系CHO-K，RD，SK-N-SH上的生長(zhǎng) 曲線(xiàn)。
[0026] 圖5、將MAVS573分別感染CHO-K和RD，然后做生長(zhǎng)曲線(xiàn)，分析感染情況。
[0027] 圖6、將病毒CAVS-5#，F(xiàn)Y573，MAVS感染RD，CH〇-K，SK-N-SH細(xì)胞系，觀察細(xì)胞上的 病變情況。
【具體實(shí)施方式】
[0028] 本發(fā)明經(jīng)過(guò)廣泛的研究，獲得了一株EV71的CHO-K適應(yīng)株（CAVS-5#)，能有效感染 CHO-K細(xì)胞，其在RD細(xì)胞上的感染力低于CHO細(xì)胞適應(yīng)株MAVS573和人EV71毒株FY573， 有一定的減毒作用，對(duì)該適應(yīng)株進(jìn)行測(cè)序及序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)了 5個(gè)氨基酸突變位點(diǎn)。本發(fā)明 的突變病毒株可被應(yīng)用于制備減毒EV71活疫苗或滅活疫苗等。
[0029] 病毒蛋白及編碼基因
[0030] 本發(fā)明所述的EV71病毒突變株包括結(jié)構(gòu)蛋白VP1、VP2、VP3和VP4,非結(jié)構(gòu)蛋白包 括2A、2B、2C及3A、3B、3C和3D ;編碼這些蛋白的基因在病毒基因組中如下排列：VP4-VP2-V P3-VPI-2A-2B-2C-3A-3B-3C-3D。
[0031] 進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，EV71病毒突變株中，VP1、2A、2C中的一些氨基酸突變貢獻(xiàn)了 該EV71病毒株的CHO細(xì)胞適應(yīng)性，使之對(duì)于CHO細(xì)胞的感染能力顯著增強(qiáng)。所述位點(diǎn)如 下：VPl的第36位氨基酸為Asn，第258位氨基酸為Val ;2A的第77位氨基酸為T(mén)hr ;2C的 第171位氨基酸為Met，第305位氨基酸為Ala。
[0032] 本發(fā)明還包括上述各突變型病毒蛋白的片段、衍生物和類(lèi)似物。如本文所用，術(shù)語(yǔ) "片段"、"衍生物"和"類(lèi)似物"是指基本上保持本發(fā)明的突變型病毒蛋白相同的生物學(xué)功能 或活性的多肽。本發(fā)明的多肽片段、衍生物或類(lèi)似物可以是（i)有一個(gè)或多個(gè)保守或非保 守性氨基酸殘基（優(yōu)選保守性氨基酸殘基）被取代的多肽，而這樣的取代的氨基酸殘基可 以是也可以不是由遺傳密碼編碼的，或（ii)在一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基中具有取代基團(tuán)的 多肽，或（iii)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽（如前導(dǎo)序列或分泌序 列或用來(lái)純化此多肽的序列或蛋白原序列，或融合蛋白）。根據(jù)本文的定義這些片段、衍生 物和類(lèi)似物屬于本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員公知的范圍。但是，所述的片段、衍生物和類(lèi)似物中， 對(duì)應(yīng)于前段所述貢獻(xiàn)CHO細(xì)胞適應(yīng)性的位點(diǎn)的氨基酸是保守的。
[0033] 本發(fā)明還提供了編碼本發(fā)明突變型病毒蛋白的多核苷酸序列。本發(fā)明還涉及上述 多核苷酸的變異體，其編碼與本發(fā)明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、類(lèi)似物和 衍生物。此多核苷酸的變異體可以是天然發(fā)生的等位變異體或非天然發(fā)生的變異體。這些 核苷酸變異體包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如本領(lǐng)域所知的，等位變異體是 一個(gè)多核苷酸的替換形式，它可能是一個(gè)或多個(gè)核苷酸的取代、缺失或插入，但不會(huì)從實(shí)質(zhì) 上改變其編碼的多肽的功能。
[0034] 本發(fā)明的編碼突變型多肽的多核苷酸序列通?？梢杂肞CR擴(kuò)增法、重組法或人工 合成的方法獲得。對(duì)于PCR擴(kuò)增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開(kāi)的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開(kāi)放閱 讀框序列來(lái)設(shè)計(jì)引物，并用市售的cDNA庫(kù)或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的 cDNA庫(kù)作為模板，擴(kuò)增而得有關(guān)序列。當(dāng)序列較長(zhǎng)時(shí)，常常需要進(jìn)行兩次或多次PCR擴(kuò)增， 然后再將各次擴(kuò)增出的片段按正確次序拼接在一起。
[0035] 此外，還可用人工合成的方法來(lái)合成有關(guān)序列，通常，通過(guò)先合成多個(gè)小片段，然 后再進(jìn)行連接可獲得序列很長(zhǎng)的片段。
[0036] 病毒突變株
[0037] 本發(fā)明通過(guò)EV71病毒株的分離，培養(yǎng)，細(xì)胞篩選等技術(shù)手段得到了能有效感染 CHO-K產(chǎn)生適應(yīng)性突變的病毒株，為EV71引起的手足口病的疫苗研發(fā)提供有力的支持。
[0038] 首先，本發(fā)明運(yùn)用ICR小鼠適應(yīng)性毒株573通過(guò)病毒感染實(shí)驗(yàn)，獲得了能夠高效感 染CHO-K的適應(yīng)性毒株。
[0039] 其次，通過(guò)空斑克隆篩選進(jìn)一步純化該CHO-K適應(yīng)性毒株5# (CHO-K adapted virus strain5#, CAVS-5#)〇
[0040] 第三，為了進(jìn)一步確認(rèn)CAVS-5#基因特征，發(fā)明人對(duì)其基因和氨基酸序列進(jìn)行了 比對(duì)，確定了氨基酸突變位點(diǎn)，為工程化疫苗提供改造方案。
[0041] 因此，本發(fā)明提供了一種EV71病毒突變株，相對(duì)于野生型出發(fā)菌株其感染CHO細(xì) 胞的能力大大增強(qiáng)。所