專利名稱：：卵巢細(xì)胞微囊的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種卵巢細(xì)胞微囊。技術(shù)背景卵巢是女性重要的生殖內(nèi)分泌器官，有明顯的年齡性變化。卵巢功能的衰退始于30歲，并于絕經(jīng)期開始，卵巢功能迅速下降，雌激素分泌銳減(絕經(jīng)后雌激素水平可比高峰期下降90%),從而導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)一系列器官功能紊亂現(xiàn)象，特別是與雌激素關(guān)系密切的心血管、骨骼、大腦和皮膚等，在絕經(jīng)后容易發(fā)生疾病。隨著人類壽命的延長和生活水平的提高，人類生存的目標(biāo)不僅是"活著"，而且要"活好"。因此臨床上使用激素替代療法糾正因卵巢功能衰退(卵巢早衰，更年期)造成的機(jī)體功能紊亂。激素替代療法能有效地預(yù)防因性激素分泌不足而引發(fā)的一些疾病(如骨質(zhì)疏松、女性絕經(jīng)后綜合征等)，但同時發(fā)現(xiàn)女性雌激素水平由于受下丘腦-腺垂體的調(diào)節(jié)，不僅有著明顯的周期性變化，而且還有明顯的個體差異，激素替代療法很難做到個體化。由于外源性雌激素在體內(nèi)呈非生理性釋放，可產(chǎn)生一些較為嚴(yán)重的副反應(yīng)，如增加心腦血管疾病的死亡率和乳腺癌、靜脈血栓等的發(fā)生率，因此，近年來對應(yīng)用激素替代療法預(yù)防絕經(jīng)前后婦女慢性病的方法出現(xiàn)了爭議。目前只有那些有絕經(jīng)期癥狀和存在有與絕經(jīng)相關(guān)的生活質(zhì)量逆向改變的婦女，首選激素替代治療，并且使用最低的有效劑量和短療程治療。隨著器官移植技術(shù)的進(jìn)一步成熟和完善，人們希望當(dāng)機(jī)體性腺功能衰退時，進(jìn)行異體性腺移植，將能還機(jī)體一個置身于自體神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)控之下，適合于宿主本身內(nèi)分泌水平的有功能的器官。卵巢移植的目的是為卵巢早衰、雙側(cè)卵巢切除或絕經(jīng)期婦女，提供一種內(nèi)源性雌性激素。目前主要有卵巢自體移植、胚胎卵巢移植、同種異體移植。卵巢自體移植由于供體卵巢來源充足，無免疫排斥，手術(shù)操作簡單，臨床上主要用于卵巢原位發(fā)生病變需放化療的患者(卵巢組織冷凍用于自體異位移植已成為可能)。胚胎卵巢細(xì)胞有較強(qiáng)的分化能力，被移入異體內(nèi)可生長發(fā)育至成熟，并有內(nèi)分泌功能，而且還能接受上級器官-垂體激素的調(diào)控，雖然目前胚胎卵巢被認(rèn)為是比較理想的供體，但仍存在排異反應(yīng)和來源問題。同種異體移植可為供體來源提供又一渠道，但面臨的最大問題是免疫排斥反應(yīng)。微囊技術(shù)起源于20世紀(jì)60年代，是組織工程的一個分支，是將外源性的細(xì)胞或組織包埋在半透性人工膜中進(jìn)行體內(nèi)移植，目的是通過微囊的免疫隔離作用，提高移植物在異體的存活率。釆用微囊包埋技術(shù)進(jìn)行細(xì)胞固定和移植要求所制備的微囊需具有透過性，以保證囊內(nèi)細(xì)胞分泌產(chǎn)生的特定因子可通過囊膜進(jìn)入細(xì)胞外間隙。APA生物微膠囊被認(rèn)為是較好的微囊制備材料，海藻酸鈉(ALG)是由海藻中提出的聚陰離子多糖，在多價陽離子如Ca"存在時形成凝膠。多聚賴氨酸(PLL)是聚陽離子大分子，與ALG可形成大分子復(fù)合物。目前已有胰島細(xì)胞、多巴胺細(xì)胞、甲狀旁腺等分泌含氮類激素細(xì)胞的微囊包裹及移植實(shí)驗取得可喜研究進(jìn)展的報道，提示內(nèi)分泌腺是微囊技術(shù)的適應(yīng)組織，也證實(shí)微囊技術(shù)具有廣泛的應(yīng)用前景。但雌激素的合成與分泌具有特殊性與復(fù)雜性，即需要卵泡膜細(xì)胞和卵泡顆粒細(xì)胞共同協(xié)作完成，并受下丘腦-垂體-性腺軸的調(diào)控，呈周期性分泌。體外培養(yǎng)卵巢細(xì)胞是否能持續(xù)性分泌雌激素，應(yīng)用微囊技術(shù)將卵巢細(xì)胞微囊化后是否能持續(xù)性分泌雌激素，以及移植入小鼠腹腔后是否能持續(xù)性分泌雌激素，同時是否能有效地預(yù)防機(jī)體各個生命必需器官的衰退(這是當(dāng)前的激素替代療法無法解決的難題)，國內(nèi)外尚未見報道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種卵巢細(xì)胞微囊，實(shí)現(xiàn)補(bǔ)充體內(nèi)性激素個性化；本發(fā)明的另一個目的在于提供上述卵巢細(xì)胞微囊的制備方法及應(yīng)用。本發(fā)明的卵巢細(xì)胞微囊是應(yīng)用海藻酸鈉-多聚賴氨酸-海藻酸鈉(APA)包裹卵巢細(xì)胞，制備成內(nèi)含卵巢細(xì)胞的微囊。微囊中的卵巢細(xì)胞是卵巢組織去除卵細(xì)胞外的其余細(xì)胞，包括具有內(nèi)分泌功能的卵巢顆粒細(xì)胞和卵泡膜細(xì)胞；未分化的卵巢內(nèi)間充質(zhì)細(xì)胞和結(jié)締組織細(xì)胞。APA卵巢細(xì)胞微囊為圓球型，表面光滑透明。微囊膜屬于生物半透膜，能阻止大分子物質(zhì)進(jìn)入膜內(nèi)，小分子物質(zhì)、細(xì)胞因子、性激素、02、C02等可以自由通過微囊膜。上述微囊內(nèi)的卵巢細(xì)胞是取卵巢組織，剪碎后制備成細(xì)胞懸液，經(jīng)體外增殖培養(yǎng)獲得。卵細(xì)胞在培養(yǎng)過程中自然去除。本發(fā)明的卵巢細(xì)胞微囊的制備方法包括如下步驟1)將經(jīng)體外增殖培養(yǎng)后的卵巢細(xì)胞消化后制成細(xì)胞懸液；2)將步驟l)細(xì)胞懸液與1.5%(質(zhì)量g/體積L)海藻酸鈉混合制成終密度為2xl(^個/ml細(xì)胞懸液。3)將細(xì)胞懸液滴入輕微攪動的1.1%(質(zhì)量/體積)CaCl2中(20-25°C),使其形成凝膠珠，傾去CaCl2溶液，加入0.05%(質(zhì)量/體積)多聚賴氨酸作用6min。4)用l呢CaCl2清洗凝膠珠2次，再加入0.15%海藻酸鈉，作用5min。5)先后用l呢CaCl2和生理鹽水清洗凝膠珠，加入0.05mol/L枸椽酸鈉(pH7.4,相對分子質(zhì)量249.1),作用6min(液化囊心)，即得到卵巢細(xì)胞微囊。每個微囊直徑約2mm，含大約2xl(^個卵巢細(xì)胞。用生理鹽水清洗后，用培養(yǎng)液清洗數(shù)次，加入D/F12全培養(yǎng)液，37°。5%0)2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，備用?；?qū)⑶逑磾?shù)次后的微囊進(jìn)行凍存，待需要時，經(jīng)融解后使用。卵巢是產(chǎn)生卵子和分泌性激素的器官，是腦垂體前葉分泌的促性腺激素的靶器官之一，它不僅參與生殖并維持性周期，還對機(jī)體的內(nèi)分泌功能和新陳代謝起著重要的調(diào)節(jié)作用，在生殖生理研究中占有重要地位。卵巢在性周期和妊娠期均發(fā)生形態(tài)及生化變化。在卵巢發(fā)生這些變化的過程中，不僅卵泡和黃體的形態(tài)及功能發(fā)生改變，而且卵巢間質(zhì)細(xì)胞的增殖及內(nèi)分泌功能也發(fā)生改變。雌激素的合成與分泌具有特殊性與復(fù)雜性，即需要卵泡膜細(xì)胞和卵泡顆粒細(xì)胞共同協(xié)作完成，并受多種細(xì)胞因子及下丘腦-垂體-性腺軸的調(diào)控，呈周期性分泌。目前主要有卵巢自體移植、胚胎卵巢移植、同種異體移植，均為組織塊移植，尚未見分離卵巢細(xì)胞移植。實(shí)驗表明分離純化的卵泡膜細(xì)胞或卵泡顆粒細(xì)胞培養(yǎng)，細(xì)胞很快死亡。用分離的混合卵巢細(xì)胞移植，可以制成卵巢細(xì)胞微囊，而且保證了卵泡膜細(xì)胞和卵泡顆粒細(xì)胞的相互作用，并且移植入體內(nèi)后，可受下丘腦-垂體分泌激素的調(diào)節(jié)，和細(xì)胞因子的作用，卵巢間質(zhì)細(xì)胞可以不斷分化補(bǔ)充形成具有分泌功能的卵泡膜細(xì)胞和卵泡顆粒細(xì)胞。因而微囊化的卵巢細(xì)胞具有一段時間分泌性激素的功能。本發(fā)明的卵巢細(xì)胞微囊可以使用種植/注入或移植的方法移入體內(nèi)。其可以種植在異體的各個部位如腹腔、四肢和皮下組織內(nèi)；或者移植到異體的各種組織內(nèi)，如結(jié)締組織和肌組織內(nèi)。將本發(fā)明的微囊進(jìn)行異體種植，其可在體內(nèi)不斷地分泌性激素，并且其分泌功能可置身于受體自身的神經(jīng)內(nèi)分泌的調(diào)控之下，達(dá)到個性化補(bǔ)充性激素分泌不足的目的。具體地說，其如下功能1)治療卵巢早衰；2)防治女性更年期綜合征；3)防治機(jī)體的退行性病變包括①骨質(zhì)疏松；②心血管疾患(包括高血壓)；③調(diào)節(jié)胰島素和胰高血糖素的分泌；④老年性癡呆；老年性尿失禁；⑥泌尿生殖系統(tǒng)萎縮等；4)女性美容。圖l是體外培養(yǎng)的卵巢細(xì)胞；圖2是用APA技術(shù)制備的卵巢細(xì)胞微囊；圖3是小鼠腹腔內(nèi)微囊狀態(tài)；圖4是正常小鼠脛骨松質(zhì)骨結(jié)構(gòu)；圖5是正常小鼠脛骨上段成骨細(xì)胞(osteoblast,OB)、骨細(xì)胞結(jié)構(gòu)；圖6是去卵巢小鼠脛骨松質(zhì)骨結(jié)構(gòu)；圖7是去卵巢小鼠脛骨上段OB、骨細(xì)胞結(jié)構(gòu)；圖8是移植組小鼠脛骨松質(zhì)骨結(jié)構(gòu)；圖9是移植組小鼠脛骨上段OB、骨細(xì)胞結(jié)構(gòu)；圖IO是正常小鼠脛骨骺軟骨細(xì)胞堿性磷酸酶(alkalinephosphatase,ALP)的表達(dá)；圖ll是去卵巢小鼠脛骨骺軟骨細(xì)胞ALP的表達(dá)；圖12是移植組小鼠脛骨骺軟骨細(xì)胞ALP的表達(dá)；圖13是正常小鼠脛骨上段軟骨細(xì)胞、OB和破骨細(xì)胞(osteoclast，OC)的間質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrixmetalloproteinases,MMP-9)表達(dá)；圖14是移植組小鼠脛骨上段軟骨細(xì)胞、OB和OC的MMP-9表達(dá)；圖15是去卵巢小鼠脛骨上段軟骨細(xì)胞、OB和OC的MMP-9表達(dá)；圖16是胰腺HE染色，其中A為正常對照組，B為去卵巢組，C為微囊移植組；圖17是免疫組織化學(xué)標(biāo)記高血糖素，其中A為正常對照組，B為去卵巢組，C為微囊移植組；圖18免疫組織化學(xué)標(biāo)記胰島素，其中A為正常對照組，B為去卵巢組，C為微囊移植組；圖19免疫組織化學(xué)標(biāo)記胰島素受體-a,其中A為正常對照組，B為去卵巢組，C為微囊移植組；圖20免疫組織化學(xué)標(biāo)記胰島素受體底物II，其中A為正常對照組，B為去卵巢組，C為微囊移植組。具體實(shí)施方式下面是實(shí)施例用于對本發(fā)明的進(jìn)一步說明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例l卵巢細(xì)胞的離體培養(yǎng)無菌條件下取小鼠雙側(cè)卵巢，去除周圍脂肪組織，冷PBS沖洗，剪碎卵巢組織，加入消化液(0.2%膠原酶1與0.25%胰蛋白酶，以1:1的比例混合)，置于37"C恒溫水洛搖床消化，30min后加入含10呢FBSD/F12培養(yǎng)液終止消化，179g離心10min，去除上清液，以無血清培養(yǎng)液清洗2次(離心，179gl0min)，輕輕吹打，制成細(xì)胞懸液，經(jīng)60目細(xì)胞篩過濾，濾液以lxl(^的密度接種于25cir^培養(yǎng)瓶，加入D/F12(HyClone公司)全培養(yǎng)液(D/F12培養(yǎng)液內(nèi)添加10%FBS，1%青-鏈霉素，pH7.2~7.4)，置于37°C5%C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)。待細(xì)胞長滿融合后，以0.25%胰蛋白酶與0.02%EDTA1:1混合消化液消化，將消化后的細(xì)胞懸液繼續(xù)培養(yǎng)。實(shí)施例2微囊化卵巢細(xì)胞的制備將傳12代的卵巢細(xì)胞(其內(nèi)不含生殖細(xì)胞)與1.5%海藻酸鈉混合制成細(xì)胞懸液，細(xì)胞終密度為2x106。用4號針頭將細(xì)胞懸液滴入輕微攪動的1.1免CaCl2中，使其形成凝膠珠，加入0.05%多聚賴氨酸作用6min。1%CaCl2清洗凝膠珠2次，再加入0.15%海藻酸鈉，作用5min。先后用1%CaCl2和生理鹽水清洗凝膠珠，加入0.05mol/L枸椽酸鈉(pH7.4，相對分子質(zhì)量249.1)，作用6min液化囊心。生理鹽水清洗后，用培養(yǎng)液清洗數(shù)次，加入D/F12全培養(yǎng)液，37匸5%(302培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待用。每個微囊直徑約2mm,含大約2><104個卵巢細(xì)胞。實(shí)施例3微囊化卵巢細(xì)胞內(nèi)分泌功能的測定應(yīng)用放射免疫檢測方法(使用天津九鼎醫(yī)學(xué)生物工程有限公司孕酮、雌激素放射免疫分析試劑盒，按照說明書進(jìn)行操作)測定體外培養(yǎng)的卵巢細(xì)胞和微囊化卵巢細(xì)胞分泌的性激素水平。結(jié)果體外培養(yǎng)的卵巢細(xì)胞(圖l)有內(nèi)分泌功能，微囊化卵巢細(xì)胞(圖2)的分泌量與同期體外培養(yǎng)的卵巢細(xì)胞相比沒有差異(表1),說明此微囊的通透效果良好，微囊內(nèi)卵泡膜細(xì)胞和卵泡顆粒細(xì)胞仍能繼續(xù)維持協(xié)同作用，合成和分泌雌激素、孕激素。將包入微囊內(nèi)的卵巢細(xì)胞破壁再培養(yǎng)，從微囊內(nèi)釋放的卵巢細(xì)胞仍能迅速貼壁，生長良好，也表明卵巢細(xì)胞在APA微囊內(nèi)可以成活。表i體外培養(yǎng)卵巢細(xì)胞與微簾化卵巢細(xì)胞培養(yǎng)液中E2和孕酮值比較(x±s)組另u雌二醇(ng.i;1)孕酮(JAg.L-1)培養(yǎng)組190.56±90.67187.40±33.17微囊組133.52±15.43*158.26±40.57**P>0.05vs培養(yǎng)組實(shí)施例4微囊化卵巢細(xì)胞的體內(nèi)移植及內(nèi)分泌功能檢測微囊化卵巢細(xì)胞的體內(nèi)移植摘除小鼠卵巢制成去卵巢小鼠模型，一組常規(guī)飼養(yǎng)3個月，造成骨質(zhì)疏松，另一組去卵巢后即用微囊化的卵巢細(xì)胞移植入小鼠腹腔，設(shè)正常組作對照。術(shù)后(去卵巢組、微囊化的卵巢細(xì)胞移植組)90d，斷頭取血處死所有動物。觀察腹腔內(nèi)微囊化卵巢細(xì)胞的生長狀態(tài)。內(nèi)分泌功能的測定應(yīng)用放射免疫檢測方法(使用天津九鼎醫(yī)學(xué)生物工程有限公司孕酮、雌激素放射免疫分析試劑盒，按照說明書操作)測定小鼠血清雌二醇(E2)水平。表2小鼠血清E2放射免疫檢測結(jié)果(^±*)<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>結(jié)果腹腔為自然生理環(huán)境，體液條件適合細(xì)胞生長，微囊化的卵巢細(xì)胞在移植鼠腹腔中的生長狀態(tài)(圖3)和小鼠血清Ea濃度(表2),說明微囊壁有良好的通透性，微囊化的卵巢細(xì)胞在移植鼠體內(nèi)仍能分泌雌激素，囊內(nèi)細(xì)胞分泌產(chǎn)生的特定因子可透過囊膜進(jìn)入受體細(xì)胞外間隙，同時囊內(nèi)細(xì)胞也可能受到受體體液因子的作用。實(shí)施例5體內(nèi)移植徵囊化卵巢細(xì)胞的效果檢測預(yù)防骨質(zhì)疏松的作用實(shí)驗方法取小鼠右側(cè)脛骨，經(jīng)HE染色進(jìn)行組織學(xué)觀察，VanGieson染色觀察骨基質(zhì)中膠原纖維變化，免疫組織化學(xué)檢測ALP和MMP-9的表達(dá)，應(yīng)用圖像分析儀行脛骨上段骨小梁形態(tài)計量學(xué)測定及分析免疫組織化學(xué)染色結(jié)果；取小鼠左側(cè)股骨和第五腰推體，用萬能電子實(shí)驗機(jī)進(jìn)行骨生物力學(xué)測試；將左側(cè)股骨水解，酶標(biāo)儀測水解液羥脯氨酸、鈣、磷含量(使用南京建成生物工程研究所羥脯氨酸、鈣、磷含量測定試劑盒，按照說明書操作)。實(shí)驗結(jié)果HE染色脛骨形態(tài)(圖4-9)計量學(xué)測定(表3)，骨小梁體積、平均骨小梁厚度去卵巢組顯著低于正常組；移植組與正常組之間無差異。平均骨小梁間距去卵巢組顯著高于正常組；移植組與正常組之間無差異。結(jié)點(diǎn)末端比去卵巢組顯著低于正常組；移植組低于正常組。免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果脛骨骺軟骨細(xì)胞ALP(圖10-12)的平均光密度值(表4),移植組與正常組之間無差異，去卵巢組低于正常組；MMP-9陽性(圖13-15)軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞的比值(表5)，移植組與正常組之間無差異，去卵巢組顯著低于正常組。小鼠股骨三點(diǎn)彎曲試驗的生物力學(xué)參數(shù)(表6)顯示各組間、組內(nèi)均數(shù)無差異。小鼠腰推壓縮實(shí)驗的生物力學(xué)參數(shù)(表7)顯示，破壞載荷去卵巢組顯著低于正常組，移植組低于正常組；彈性模量去卵巢組低于正常組，移植組與正常組之間無差異；能量吸收去卵巢組顯著低于正常組，移植組與正常組之間無差異。小鼠股骨羥脯氨酸、鈣、磷測定結(jié)果(表8)顯示，去卵巢組低于正常組，移植組與正常組之間無差異。表3各組別小鼠右側(cè)脛骨上段骨小梁形態(tài)計量結(jié)果(i±s)組另'J骨小梁體積(％)平均骨小梁厚度(Hm)平均骨小梁間距(nm)結(jié)點(diǎn)末端比正常組去卵巢組移植組11.60±3.394.85±1.23***9.81±2.0749.95±8.1330.18±9.51***52.98±6.74150.71±26.114.88±2.05235.92±43.38***0.61±0.26***142.99±22.632.91±1.83*P〈0.05vs正常組，***P<0.001vs正常組表4各組別小鼠脛骨骺軟骨細(xì)胞ALP平均光密度值的比較(^土s)組別正常組去卵巢組移植組ALP0.798±0.0710.740±0.0170.755±0.040*P<0.05vs正常組表5各組別小鼠脛骨上段MMP-9陽性軟骨細(xì)胞、OB與OC個數(shù)的比值(i±s)組別正常組去卵巢組移植組軟骨細(xì)胞和OB/OC8.5±1.8523.38±1.302***8.38±2.204***P<0.001vs正常組表6各組別小鼠左側(cè)股骨三點(diǎn)彎曲試驗結(jié)果(^±s)組別最大載荷(N)彈性模量(GPa)彈性載荷(N)剛度系數(shù)(KN)正常組19.00±4.847.90±3.0116.00±33415.60±5.94~~去卵巢組18.50±6.21*7.24±2.49*14.88±3.80*14.28±4.92*移植組18.13±2.70*7,54±3.07*15.38±2.07*13.44±5.49**P>0.05vs正常組表7各組別小鼠第5腰椎壓縮試驗的生物力學(xué)參數(shù)結(jié)果(；±s)H1破壞載荷(N)彈性模量(MPa)~最大能量吸收(J/mm3)正常組去卵巢組74.88±11.2248.13±10.60*"148.18±66.2498.63±41.49*29.93±7.9618.71土5.26"移植組62.50±8.26*_149.61±29.43_26.66±4.44_*P<0.05vs正常組，**P<0.01vs正常組，***P<0.001vs正常組表8各組別小鼠左側(cè)股骨干重、骨礦物質(zhì)和有機(jī)質(zhì)含量(^土s)組別干重(g)錦(mmol/g)磷(mmol/g)羥脯氨酸(mgT^T正常組0.060±0.0080.622±0.1200.405±0.1062艦±0.276去卵巢組0.064±0.0050.498±0.073*0.280±0.087*1.656±0.19*移植組0.061±0.0090.563±0.0930.385±0.0781.925±0.292*P<0.05vs正常組實(shí)施例6對胰島細(xì)胞(a細(xì)胞與e細(xì)胞)功能活性的影響實(shí)驗方法處死小鼠取出胰腺組織，經(jīng)Bouin液固定，制成石蠟切片，進(jìn)行HE染色，用抗胰島素單克隆抗體，兔抗胰高血糖素多克隆抗體，兔抗胰島素受體-(x多克隆抗體，兔抗胰島素受體底物-2多克隆抗體進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。光學(xué)顯微鏡行組織病理學(xué)觀察，采用圖像分析儀對染色陽性部位進(jìn)行光密度值的測量。實(shí)驗結(jié)果HE染色去卵巢組小鼠胰腺外分泌部細(xì)胞嗜酸性染色較正常對照組增強(qiáng)，細(xì)胞周圍的嗜堿性物質(zhì)減少甚至消失，移植組與對照組無明顯差別(圖16)。免疫組織化學(xué)染色高血糖素、胰島素、胰島素受體-a及胰島素受體底物-2的陽性表達(dá)產(chǎn)物均呈棕黃色顆粒狀。高血糖素陽性細(xì)胞主要分布在胰島周圍。胰島素，胰島素受體-a及胰島素受體底物-2的陽性細(xì)胞主要分布在胰島中央部(圖17-20)。平均光密度值測量結(jié)果顯示(表912):去卵巢組胰高血糖素、胰島素顯著高于對照組，微囊移植組與對照組比較無明顯差異；去卵巢組胰島素受體-a和胰島素受體底物-2顯著低于對照組，移植組與對照組比較無明顯差異。*尸>0.05表示差異無統(tǒng)計學(xué)意義，**尸<0.01為差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義。表9各組高血糖素陽性產(chǎn)物平均光密度值結(jié)果(；±s)<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>移植組**移植組0.965±0.0947去卵巢組*'表10各組胰島素陽性產(chǎn)物平均光密度值結(jié)果(^±s)組另寸胰島素OD值比較組別表11各組胰島素受體-a陽性產(chǎn)物平均光密度值結(jié)果(^土s)組別胰島素受體-aOD值比較組別正常組1.099±0.0977去卵巢組0.929±0.1419移植組1.035±0.0528表12各組胰島素受體底物一2陽性產(chǎn)物平均光密度值結(jié)果(；±s)組別胰島素受體底物-20D值比較組別正常組1.135±0.0692去卵巢組0.891±0.1175移植組1.127±0.1039結(jié)論微囊化的異體卵巢細(xì)胞在去卵巢小鼠腹腔內(nèi)能夠生存，并且具有分泌性激素的功能，能減緩骨量丟失，對防治骨質(zhì)疏松起積極的作用；同時能影響胰島a細(xì)胞和p細(xì)胞的生物活性，調(diào)節(jié)胰島胰島素和胰高血糖素的分泌。去卵巢組**移植組*正常組**移植組***正常組*去卵巢組***去卵巢組**移植組*正常組**移植組**正常組*去卵巢組**正常組0.822±0.0903去卵桌組'去卵巢組1.0234±0.0547移植組0.858±0.0838去卵巢組^b組組1植常植常移正移正權(quán)利要求1.一種卵巢細(xì)胞微囊，其特征在于，所述微囊是應(yīng)用海藻酸鈉-多聚賴氨酸-海藻酸鈉包裹卵巢細(xì)胞制備成的微囊。2、如權(quán)利要求l所述的卵巢細(xì)胞微囊，其中所述卵巢細(xì)胞包括卵巢顆粒細(xì)胞、卵泡膜細(xì)胞、間充質(zhì)細(xì)胞和結(jié)締組織細(xì)胞。3、如權(quán)利要求1或2所述的卵巢細(xì)胞微囊，其中所述卵巢細(xì)胞通過如下方法獲得取卵巢組織，制成細(xì)胞懸液，經(jīng)體外增殖培養(yǎng)后獲得。4、如權(quán)利要求3所述的卵巢細(xì)胞微囊，其中所述的卵巢細(xì)胞通過如下方法獲得取卵巢組織，剪碎后，加入消化液置于37"C恒溫水浴搖床消化，30min后加入含10呢FBS培養(yǎng)液終止消化，179g離心10min，去除上清液，以無血清培養(yǎng)液清洗后制成細(xì)胞懸液，經(jīng)60目細(xì)胞篩過濾，以106的密度接種于培養(yǎng)瓶內(nèi)，加入D/F12全培養(yǎng)液，置于37。C5%0)2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待細(xì)胞長滿融合后，以0.25%胰蛋白酶與0.02%EDTA1:1混合消化液消化，將消化后的細(xì)胞重新制備成細(xì)胞懸液，進(jìn)行繼代增殖培養(yǎng)。5、一種制備權(quán)利要求14所述卵巢細(xì)胞微囊的方法，其包括如下步驟1)將經(jīng)體外增殖培養(yǎng)后的卵巢細(xì)胞消化后重新制備成細(xì)胞懸液；2)將步驟1)的細(xì)胞懸液與1.5%海藻酸鈉混合制成終密度為2xl(^個/ml的細(xì)胞懸液。3)將細(xì)胞懸液滴入輕微攪動的1.1%CaCl2中，使其形成凝膠珠，加入0.05%多聚賴氨酸作用6min。4)用l呢CaCl2清洗凝膠珠2次，再加入0.15%海藻酸鈉，作用5min。5)先后用l呢CaCl2和生理鹽水清洗凝膠珠，加入0.05mol/L枸椽酸鈉pH7.4，作用6min。6、如權(quán)利要求5所述的方法，其中步驟l)所述卵巢細(xì)胞通過如下方法獲得取卵巢組織，剪碎后，加入消化液置于37匸恒溫水浴搖床消化，30min后加入含10呢FBS培養(yǎng)液終止消化，179g離心10min,去除上清液，以無血清培養(yǎng)液清洗后制成細(xì)胞懸液，經(jīng)60目細(xì)胞篩過濾，以106的密度接種于培養(yǎng)瓶內(nèi)，加入D/F12全培養(yǎng)液，置于37。C5%<:02培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待細(xì)胞長滿融合后，以0.25%胰蛋白酶與0.02%EDTA1:1混合消化液消化，將消化后的細(xì)胞重新制備成細(xì)胞懸液，進(jìn)行繼代增殖培養(yǎng)。7、如權(quán)利要求1~2任一項所述的卵巢細(xì)胞微囊在制備治療卵巢早衰生物制劑中的應(yīng)用。8、如權(quán)利要求1~2任一項所述的卵巢細(xì)胞微囊在制備防治女性更年期綜合征的生物制劑中的應(yīng)用。9、如權(quán)利要求1~2任一項所述的卵巢細(xì)胞微囊在制備防治機(jī)體的退行性病變的生物制劑中的應(yīng)用。10、如權(quán)利要求1~2任一項所述的卵巢細(xì)胞微囊在女性美容的生物制劑中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明提供了一種卵巢細(xì)胞微囊，其是應(yīng)用海藻酸鈉-多聚賴氨酸-海藻酸鈉(APA)包裹卵巢細(xì)胞，制備成內(nèi)含卵巢細(xì)胞的微囊。微囊中的卵巢細(xì)胞包括具有內(nèi)分泌功能的卵巢顆粒細(xì)胞和卵泡膜細(xì)胞；未分化的卵巢內(nèi)間充質(zhì)細(xì)胞和結(jié)締組織細(xì)胞。將本發(fā)明的微囊進(jìn)行異體種植，微囊內(nèi)的內(nèi)分泌細(xì)胞可在體內(nèi)不斷地分泌性激素，并且其分泌功能可置身于受體自身的神經(jīng)內(nèi)分泌的調(diào)控之下，達(dá)到個性化補(bǔ)充性激素分泌不足的目的。應(yīng)用卵巢細(xì)胞微囊異體種植可對機(jī)體退行性病變起到積極地防治作用。實(shí)驗證明能減緩骨量丟失，對防治骨質(zhì)疏松起積極的作用；同時能影響胰島α細(xì)胞和β細(xì)胞的生物活性，調(diào)節(jié)胰島素和胰高血糖素的分泌。文檔編號C12N5/08GK101229192SQ20071006311公開日2008年7月30日申請日期2007年1月26日優(yōu)先權(quán)日2007年1月26日發(fā)明者史小林,梁元晶,靜翁,晴許,欣路,郭曉霞申請人:首都醫(yī)科大學(xué)