一種植物內生短小芽孢桿菌及其菌劑、制法與應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種植物內生的短小芽孢桿菌及其菌劑、制法與應用。該植物內生的短小芽孢桿菌J14-1（BacilluspumilusJ14-1），保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No.9601。菌株J14-1及其菌劑在提高作物耐鹽能力中應用，菌株可以定殖到作物體內，顯著提高玉米等作物的耐鹽能力，從而可以顯著提高玉米等作物的發(fā)芽率和生物量，解決了在鹽堿化土壤中玉米等普通作物耐鹽能力較差而導致的糧食減產等問題。
CGMCC No.9601
2014.08.26
【專利說明】一種植物內生短小芽孢桿菌及其菌劑、制法與應用

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種植物內生的短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus)，還涉及利用該芽 孢桿菌生產的微生物菌劑，以及所述植物內生短小芽孢桿菌與菌劑在提高作物耐鹽能力中 的應用。

【背景技術】
[0002] 鹽堿土是指土壤含鹽量太高（超過0. 3% )的土壤，土壤的鹽堿化會增加農業(yè)生產 成本，甚至導致土地荒廢。據統(tǒng)計，我國的鹽堿地資源面積約5. 27億畝，其中鹽堿耕地0. 88 億畝，主要分布在華北、西北和東北地區(qū)。土壤鹽堿化使我國每年造成大量的糧食減產，農 田土壤鹽堿化導致的糧食減產不但造成了嚴重的經濟損失，還對國家的糧食安全構成了嚴 重威脅。
[0003] 治理鹽堿地改良措施有物理、化學和生物以及農業(yè)耕作措施等，包括水利改良措 施（灌溉、排水、放淤、種稻、防滲等）；農業(yè)改良措施（平整土地、改良耕作、施客土、施肥、 播種、輪作、間種套種等）；生物改良措施（種植耐鹽植物和牧草、綠肥、植樹造林等）；化學 改良措施（施用改良物質，如石膏、磷石膏、亞硫酸鈣等），以及利用從土壤中篩選的微生物 菌株形成的肥料來改善土壤性質等。
[0004] 在自然界的植物體內存在大量的內生細菌、真菌和放線菌，這些菌株不但不會引 起宿主植物的疾病，反而可以通過與植物的相互作用，提高宿主植物自身抗逆境條件的能 力。開發(fā)這些植物內生微生物資源對工農業(yè)生產具有重要的現實意義。


【發(fā)明內容】

[0005] 本發(fā)明主要從具有較強鹽堿耐受能力的植物體內，篩選自身耐鹽能力強并可以提 高作物耐鹽堿能力的細菌，以期提高普通作物的耐鹽能力。與改良土壤實現鹽堿地改良的 微生物肥料相比，植物內生細菌可以進入作物根或莖內，與植物形成互利共生關系，通過改 變植物的生理狀態(tài)，提高作物自身的耐鹽能力，本發(fā)明的植物內生細菌及其菌劑的使用操 作簡便、成本低。
[0006] 本發(fā)明解決的第一技術問題是克服土壤鹽堿化的不良影響，提供一種植物內生芽 孢桿菌，能提高作物自身耐鹽能力，改善在鹽堿化土壤中玉米等普通作物耐鹽能力較差而 導致的糧食減產。
[0007] 本發(fā)明解決的第二技術問題是提供一種含有上述植物內生芽孢桿菌的微生物菌 齊[J，可以在鹽堿土壤中使用，提高普通作物的耐鹽能力及作物在鹽堿土壤中的生長。本發(fā)明 提供的菌株和菌劑可以作為微生物肥料在鹽堿化農田中使用，提高作物在中的發(fā)芽率、生 物量或糧食產量。
[0008] 本發(fā)明解決的第三技術問題是植物內生短小芽孢桿屬細菌和菌劑在提高作物耐 鹽能力的應用。
[0009] 具體來說，本發(fā)明提出了如下技術方案。
[0010] 本發(fā)明的第一方面，提供了一種植物內生的短小芽孢桿菌J14-1 (Bacillus pumilus J14-1;以下簡稱菌株J14-1)，菌株的保藏編號為CGMCC No.9601。本發(fā)明提供的 菌株J14-1，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（CGMCC)，地址：北京 市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所，保藏編號為CGMCC No. 9601，保藏 日期為2014年8月26日。
[0011] 菌株J14-1在提高作物耐鹽能力中應用。優(yōu)選的，所述J14-1菌株應用于鹽堿土 壤，所述鹽堿土壤是指含可溶性鹽濃度為〇?2. 0%的土壤。所述短小芽孢桿菌菌株J14-1 能夠定殖到作物體內。優(yōu)選的，所述作物是玉米。
[0012] 本發(fā)明的又一方面，一種微生物菌劑，其利用上述菌株J14-1生產得到，其活性成 分為上述植物內生短小芽孢桿菌菌株J14-1。
[0013] 該微生物菌劑在提高作物耐鹽能力中應用。優(yōu)選的，所述微生物菌劑應用于鹽堿 土壤，所述鹽堿土壤是指含可溶性鹽濃度為0?2. 0%的土壤。
[0014] 本發(fā)明的又一方面，該微生物菌劑通過包括下述步驟的制備方法得到：
[0015] 1)斜面種培養(yǎng)：將權利要求1所述的短小芽孢桿菌菌株J14-1活化后接種于試管 斜面上；
[0016] 2)搖瓶種培養(yǎng)：步驟1)的得到的試管菌種接種于肉湯培養(yǎng)基中，恒溫震蕩培養(yǎng)至 對數生長期；
[0017] 3)種子罐接種培養(yǎng)：將步驟2)得到的搖瓶菌種按照10%接種量（體積比）接種 于種子罐中培養(yǎng)至對數生長期；
[0018] 4)生產罐培養(yǎng)：將步驟3)得到的種子罐菌種按10%接種量（體積比）接種于生 產罐中，溫度控制在30?35°C進行培養(yǎng)，得到菌劑。
[0019] 本發(fā)明提供的植物內生短小芽孢桿菌J14-1及其菌劑可以應用于含可溶性鹽濃 度為0?2. 0 %的土壤（鹽堿土壤），菌株可以定殖到作物體內，顯著提高玉米等作物的耐 鹽能力，從而可以顯著提高玉米等作物發(fā)芽率，并明顯提高作物的生物量。使用本發(fā)明植物 內生芽孢桿菌J14-1及其菌劑可以擴大玉米的種植范圍，提高作物的種植面積。

【具體實施方式】
[0020] 本發(fā)明主要從具有較強鹽堿耐受能力的植物體內，篩選自身耐鹽能力強并可以提 高作物耐鹽堿能力的細菌，以期提高普通作物的耐鹽能力。本發(fā)明提供的植物內生短小芽 孢桿菌J14-1及其菌劑本身能在含鹽（NaCl)量為16%的LB培養(yǎng)基等培養(yǎng)基中生長，在含 0.5%、1.0%和2.0%的鹽（NaCl)濃度的水溶液中，可以顯著提高玉米種子發(fā)芽率。將種子 放到本發(fā)明菌劑中浸泡4小時后，種植到含鹽量為1. 0%的土壤中，可以顯著提高玉米等作 物發(fā)芽率，并明顯提高作物的生物量。在含2. 0%可溶鹽的土壤中使用菌株J14-1，可以提 高玉米等作物的成活率。
[0021] 保藏信息
[0022] 本發(fā)明提供的植物內生的芽孢桿菌屬（Bacillus)短小芽孢桿菌菌株 J14-1 (Bacillus pumilus J14-1)，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物 中心（CGMCC)，地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，郵編 100101 ;保藏編號為CGMCC No. 9601，保藏日期為2014年8月26日。
[0023] 本發(fā)明的T14-1菌株具有如下件質:
[0024] 1.形態(tài)特征：菌體為桿狀。
[0025] 2.生理生化特征：革蘭氏染色反應陽性，硝酸鹽還原陰性、精氨酸水解陰性；接觸 酶、氧化酶、酯酶陽性；不產生H 2S、吲哚，利用阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖，不利用鼠李糖、棉 子糖；在LB培養(yǎng)基培養(yǎng)3天后，形成直徑0. 5mm、白色、不透明、表面干燥、邊緣不規(guī)則的菌 落。
[0026] 3· 1防rDNA序列鑒定
[0027] 采用如下引物：8F(5 ' -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，），1492R(5 ' -TACCTTGTTA CGACTT-3 ^ )，進行PCR擴增，從菌株J14-1中擴增到16S rDNA基因片段，將所獲得16S rDNA克隆到pGEM T-easy載體后送北京博艾遠上生物科技有限公司測序。16S rDNA的部 分序列見序列表SEQ ID No : 1所示的堿基序列，與GenBank中的序列比對發(fā)現，J14-1菌株 的16S rDNA序列與短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus)菌株序列的同源性最高，達99%以 上。
[0028] 具體步驟：
[0029] 取翅堿蓬植株一株，將翅堿蓬根系剪為數段，然后對植物表面消毒（優(yōu)選采用次 氯酸鈉和70 %乙醇），用無菌水沖洗干凈，并收集沖洗水涂布于LB培養(yǎng)基平板上，經檢測表 面無菌后，用無菌研缽碾碎，收集植物組織殘渣，用無菌水稀釋后在含2%鹽濃度的LB培養(yǎng) 基（酵母粉5.0g/L、蛋白胨10.0g/L、NaCl 20g/L，瓊脂粉20g/L，用水定容至lL，pH 7.0左 右）平板上涂布，培養(yǎng)7天后，挑取單菌落劃線純化后保存。
[0030] 本發(fā)明還公開了利用上述J14-1菌株生產的微生物菌劑，其活性成分為J14-1菌 體。
[0031] 所述微生物菌劑的制備方法如下所述：
[0032] 生產菌劑的工藝為：斜面種一搖瓶種一種子罐一生產罐一產品，所述產品的包裝 劑型為液體菌劑或固體吸附菌劑。
[0033] 在一個優(yōu)選的實施方式中，所述菌劑的制備具體可采用如下步驟：
[0034] (1)斜面種培養(yǎng)：將菌株J14-1 (原種）在高鹽LB培養(yǎng)基（成分如下：酵母粉5g/ L，蛋白胨10g/L，NaCl 160g/L，瓊脂粉20g/L，pH 7. 0?7. 2)平板上培養(yǎng)，備用。
[0035] (2)搖瓶種培養(yǎng)：將試管種接種于200ml肉湯培養(yǎng)基（牛肉膏3. Og/L，蛋白胨 10. Og/L，NaCl 5. Og/L，其他為水，pH 7. 0?7. 2)中，恒溫振蕩培養(yǎng)至對數生長期，準備接 種種子罐。
[0036] (3)種子罐接種培養(yǎng)：配制發(fā)酵培養(yǎng)基，其組分及重量百分比為：葡萄糖0.8%、 (NH 4)2S041%、K2HP040. 2%、MgS040. 05%、NaCl 0· 01%、CaC030. 3%、酵母粉 0· 02%，其余為 水，pH值7. 2?7. 5,將400L發(fā)酵培養(yǎng)基加入500L種子罐，121°C高壓濕熱滅菌，冷卻至30°C 后，將將步驟2)得到的搖瓶菌種按10% (體積百分含量）的接種量接種入種子罐，培養(yǎng)至 對數生長期，攪拌速度為220轉/分，無菌空氣通入量為1 :0. 8 (空氣和培養(yǎng)液的體積比）。
[0037] (4)生產罐培養(yǎng)：生產罐（生產罐容量5噸）所用培養(yǎng)基成分與發(fā)酵培養(yǎng)基相同 (投料量4. 5噸），投料后的生產罐在1. lkg/cm2的壓力下，121°C高壓濕熱滅菌，滅菌后冷 卻至30°C以下，通無菌空氣保持無菌狀態(tài)備用；將到達對數期的種子液按10% (體積百分 含量）的接種量接入生產罐，接種后的生產罐溫度控制在30?35°C，生產罐的培養(yǎng)過程中 無菌空氣的通氣量為1 : (0. 6?1. 2)(空氣和培養(yǎng)液的體積比），攪拌速度為180?240轉 /分（可優(yōu)選為240轉/分），整個工藝流程培養(yǎng)時間為48?60小時；發(fā)酵結束后菌體數 量達到10億個/ml以上。
[0038] (5)發(fā)酵完成后，培養(yǎng)液出罐直接用塑料包裝桶或包裝瓶分裝成液體劑型或采用 泥炭吸附用包裝袋分裝成固體菌劑劑型。
[0039] 內生菌與宿主之間存在選擇性，一種特定的內生菌基因型需要找到正確的宿主基 因型才能成功建立共生關系。目如有關于巨大芽抱桿菌和地衣芽抱桿菌提商作物的耐鹽能 力的報道，然而適用作物僅限于小麥，并不能應用于玉米。另外，目前并沒有報道短小芽孢 桿菌能提高作物耐鹽能力，特別的，沒有報道短小芽孢桿菌能提高玉米的耐鹽能力。
[0040] 本發(fā)明能提高作物耐鹽能力的植物內生芽孢桿菌J14-1和微生物菌劑具有生產 使用成本低、使用方便的優(yōu)點，可以顯著提高玉米等作物的耐鹽能力。本發(fā)明提供的菌株和 菌劑可以作為微生物肥料在鹽堿化農田中使用，提高作物在鹽堿土壤中的發(fā)芽率、生物量 或糧食產量。使用該菌劑可以擴大玉米的種植范圍，提高作物的種植面積。
[0041] 以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗 方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自 常規(guī)生化試劑商店購買得到的，具體如表1所示，所用玉米種子為常規(guī)玉米種子。以下實驗 均設置三次重復，結果取平均值。以下實施例中所指的含鹽量，如無特殊說明，均為質量百 分含量，所指的鹽為NaCl。
[0042] 表1各試劑的商購來源信息表
[0043]

【權利要求】
1. 一種植物內生的短小芽孢桿菌1114-1(沒<3<^77^51/^--7^/ >5]14-1)，保藏于中國微生 物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No. 9601。
2. 權利要求1所述的植物內生的短小芽孢桿菌J14-1在提高作物耐鹽能力中的應用。
3. 根據權利要求2所述的植物內生的短小芽孢桿菌J14-1在提高作物耐鹽能力中的應 用，其特征在于，所述植物內生的短小芽孢桿菌J14-1應用于鹽堿土壤，所述鹽堿土壤是指 含可溶性鹽濃度為(Γ2. 0%的土壤。
4. 根據權利要求2或3所述的植物內生的短小芽孢桿菌J14-1在提高作物耐鹽能力中 的應用，其特征在于，所述短小芽孢桿菌J14-1定殖到作物體內。
5. 根據權利要求2-4任一項所述的植物內生的短小芽孢桿菌J14-1在提高作物耐鹽能 力中的應用，其特征在于，所述作物是玉米。
6. -種微生物菌劑，其特征在于，其利用權利要求1所述的植物內生的短小芽孢桿菌 J14-1生產得到，其活性成分為權利要求1所述的植物內生的短小芽孢桿菌J14-1。
7. 根據權利要求6所述的微生物菌劑，其含有權利要求1所述的植物內生的短小芽孢 桿菌J14-1為10億個/ml以上，該菌劑利用權利要求1所述的植物內生的短小芽孢桿菌 J14-1和發(fā)酵培養(yǎng)基生產得到，所述發(fā)酵培養(yǎng)基以質量計含有如下組分：葡萄糖0. 7~1. 0%、 (NH4)2S04 0· 8?1. 2%、Κ2ΗΡ04 0?廣0· 3%、MgS04 0· 03?0· 07%、NaCl 0· 005?0· 015%、CaC03 0· 2?0· 4%、酵母粉0· 01?0· 03%，其余為水，pH值7. 2?7. 5。
8. 權利要求6或7所述的微生物菌劑在提高作物耐鹽能力中的應用。
9. 權利要求8所述的微生物菌劑在提高作物的耐鹽能力中的應用，其特征在于，所述 微生物菌劑應用于鹽堿土壤，所述鹽堿土壤是指含可溶性鹽濃度為(Γ2. 0%的土壤。
10. 根據權利要求8或9所述的微生物菌劑在提高作物的耐鹽能力中的應用，其特征在 于，所述活性成分短小芽孢桿菌J14-1定殖到作物體內。
11. 根據權利要求8-10任一項所述的微生物菌劑在提高作物的耐鹽能力中的應用，其 特征在于，所述作物是玉米。
12. 權利要求6或7所述的微生物菌劑的制備方法，其特征在于，其通過包括下述步驟 的制備方法得到： 1) 斜面種培養(yǎng)：將權利要求1所述的短小芽孢桿菌菌株J14-1活化后接種于試管斜面 上； 2) 搖瓶種培養(yǎng)：步驟1)的得到的試管菌種接種于肉湯培養(yǎng)基中，恒溫震蕩培養(yǎng)至對數 生長期； 3) 種子罐接種培養(yǎng)：將步驟2)得到的搖瓶菌種按照10%(體積比）的接種量接種于種 子罐中培養(yǎng)至對數生長期； 4) 生產罐培養(yǎng)：將步驟3)得到的種子罐菌種按10%(體積比）的接種量接種于生產罐 中，溫度控制在3(T35°C進行培養(yǎng)，得到菌劑。
【文檔編號】C12N1/20GK104232532SQ201410436926
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2014年8月29日 優(yōu)先權日:2014年8月29日
【發(fā)明者】孫紀全, 劉敏, 徐蓮, 吳曉磊 申請人:北京大學工學院包頭研究院