專利名稱：一種內(nèi)生枯草芽孢桿菌的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物領(lǐng)域，更具體的說是涉及一種內(nèi)生枯草芽孢桿菌。
背景技術(shù)：
胡椒(Piper nigrum L.)是胡椒科胡椒屬多年生常綠攀緣藤本植物，是世界重要的熱帶特色香辛料作物，為人們最常用、最喜愛的調(diào)味品之一，在食品、醫(yī)療保健等領(lǐng)域用途廣泛。胡椒瘟病是一種氣候依賴性病害，常在雨季時發(fā)生，它是由疫霉菌感染而引起的一種傳染力很強的土傳性病害。自引種胡椒以來，胡椒瘟病就一直是危害我國胡椒生產(chǎn)的首要病害，病情嚴(yán)重時胡椒園損失達90%以上，甚至全園毀滅，給我國胡椒種植業(yè)帶來不可估量的損失，為此我國對胡椒瘟病的防治技術(shù)進行了較為深入的研究。目前，對胡椒瘟病的防治主要依賴化學(xué)防治技術(shù)，如噴施甲霜靈霜 霉威WP。雖然化學(xué)防治能夠達到較好的防治效果，但長期使用化學(xué)農(nóng)藥不僅會產(chǎn)生農(nóng)藥殘留，降低胡椒品質(zhì)，而且還會隨著化學(xué)農(nóng)藥的長期頻繁使用引起胡椒瘟病病菌的抗藥性，致使胡椒瘟病近年來有逐年加重之勢。因此，有效、安全、生態(tài)地防治胡椒瘟病就成為胡椒種植業(yè)的首要目標(biāo)。生物防治是現(xiàn)階段提出的一種防治胡椒瘟病的技術(shù)手段，它以胡椒瘟病菌株為指示菌，從土壤中中篩選出能夠抑制胡椒瘟病菌株的微生物進行生物防治，這種方法有效避免了利用化學(xué)防治技術(shù)所帶來的抗藥性以及環(huán)境污染問題。然而，胡椒瘟病菌株的組成類群十分復(fù)雜，而現(xiàn)有篩選時以典型或單一的胡椒瘟病菌株為指示菌，故篩選出的微生物具有一定局限性，其防治效果遠不如化學(xué)防治效果。此外，現(xiàn)有篩選出的微生物隨著傳代次數(shù)的增加，其對胡椒瘟病病菌孢子的抑制活性逐漸降低，遺傳穩(wěn)定性較差。

發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種內(nèi)生枯草芽孢桿菌，使得該菌株防治胡椒溫病的效果與化學(xué)防治胡椒瘟病的效果無明顯差別，且具有較高的遺傳穩(wěn)定性。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種從胡椒葉片中分離得到的內(nèi)生菌，命名為菌株 Z，菌株Z在NA培養(yǎng)基上菌落呈圓形邊緣不整齊，乳白色，不透明，表面粗糙，有皺褶，無光澤。培養(yǎng)至36h，菌體均以休眠體芽孢的形式存在，菌落呈淺黃色。顯微觀察菌體為單細胞， 桿狀，單生或雙生，有時成鏈。革蘭氏染色陽性，芽孢卵圓形，中生，周生鞭毛。美藍染色，原生質(zhì)著色均勻。石蕊牛奶不產(chǎn)酸。接觸酶、V. P.反應(yīng)、淀粉水解、硝酸鹽還原反應(yīng)、檸檬酸鹽利用、明膠液化均為陽性。M. R、苯丙氨酸脫氨酶試驗、脲酶試驗、丙酸鹽的利用均為陰性。 可以在含 % NaCl和ρΗ5. 7的NA培養(yǎng)基上生長。此外，經(jīng)16S DNA檢測分析，與菌株Z同源性高的50個菌株均是芽孢桿菌，同源性高達100%，結(jié)合生理生化特征，鑒定其為枯草芽孢桿菌。本發(fā)明所述內(nèi)生枯草芽孢桿菌已于2011年5月12日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，保藏編號為CGMCC No. 4844。本發(fā)明所述內(nèi)生枯草芽孢桿菌傳代培養(yǎng)的第1代、第10代、第20代、第30代、第 40代對胡椒瘟病病菌孢子的抑制試驗顯示，所述內(nèi)生枯草芽孢桿菌從第1代至第40代抑制胡椒瘟病病菌孢子萌發(fā)的EC5tl無顯著差異，且均在5. 5%以下，表明本發(fā)明所述內(nèi)生枯草芽孢桿菌具有較好的抑制效果，且遺傳穩(wěn)定性較高，不會隨傳代次數(shù)的增加而降低對胡椒瘟病病菌孢子的抑制活性。本發(fā)明所述內(nèi)生枯草芽孢桿菌與甲霜靈霜·霉威WP對胡椒瘟病防效試驗結(jié)果顯示，兩者的防效相當(dāng)，無明顯差異。表明本發(fā)明所述內(nèi)生枯草芽孢桿菌防效較高，達到化學(xué)防治的效果，能夠應(yīng)用在防治胡椒瘟病以及制備防治胡椒瘟病制劑中。本發(fā)明還提供一種生防制劑，包括保藏編號為CGMCC No. 4844的內(nèi)生枯草芽孢桿菌。本發(fā)明所述生防制劑可以在胡椒移栽前噴霧使用，也可以做成堆肥使用，或者稀釋后在移栽時灌根使用。本發(fā)明所述所述生防制劑的制備方法如下將保藏編號為CGMCC No. 4844的內(nèi)生枯草芽孢桿菌于PDA培養(yǎng)液中培養(yǎng)，然后過濾并調(diào)節(jié)菌液孢子數(shù)為IO8-IOki個/mL，即得生防制劑成品。其中，所述培養(yǎng)的溫度優(yōu)選為^_28°C，更優(yōu)選為27°C，所述培養(yǎng)的pH值優(yōu)選為 7-9，更優(yōu)選為8。由以上技術(shù)方案可知，本發(fā)明所述內(nèi)生枯草芽孢桿菌傳代至40代仍然具有較高抑制胡椒瘟病菌株孢子的活性，具有較高的遺傳穩(wěn)定性，同時其防治胡椒瘟病的效果達到化學(xué)防治的效果，且不污染環(huán)境，生態(tài)、安全，能夠廣泛應(yīng)用在胡椒瘟病的防治以及制備防治胡椒瘟病制劑中。生物保藏說明分類命名枯草芽孢桿菌，Bacillus subtil is.于2011年5月12日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，保藏編號為CGMCC No. 4844。
具體實施例方式本發(fā)明公開了一種內(nèi)生枯草芽孢桿菌，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進工藝參數(shù)實現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明所述內(nèi)生枯草芽孢桿菌已經(jīng)通過較佳實施例進行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對本文所述的方法和應(yīng)用進行改動或適當(dāng)變更與組合，來實現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。下面結(jié)合實施例，進一步闡述本發(fā)明。實施例1 本發(fā)明所述內(nèi)生枯草芽孢桿菌的分離方法從胡椒瘟病發(fā)病重區(qū)采回生長健康的葉片，用無菌手術(shù)刀切成約2cmX2cm規(guī)格的組織塊，無菌水沖洗數(shù)次，在75%的酒精中浸泡lmin，滅菌水沖洗3次，將組織塊置于無菌研缽中，用剪刀剪碎后加無菌水研磨，靜置30min，稀釋成IO-1UO-2UO-3 3個梯度，分別移取最后1次沖洗液和研磨液各0. 3mL，涂抹于PDA培養(yǎng)基平板上，最后1次沖洗液作為CK，于下培養(yǎng)，逐日觀察。選擇CK中無菌落，而研磨液中長出菌落的菌株，并根據(jù)菌落形態(tài)、顏色等特征挑取單菌落，純化編號后，在平皿內(nèi)對峙培養(yǎng)檢測其對胡椒瘟病病菌的抑制作用，選擇形成抑菌帶的菌株，命名為菌株Z。實施例2 本發(fā)明所述內(nèi)生枯草芽孢桿菌生理生化以及16S DNA序列的測定1、生理生化檢測檢測菌株Z在NA平板上的生長情況、菌落形態(tài)與顏色、革蘭氏染色、芽孢染色和鞭毛染色等，方法參照方仲達主編的《植病研究方法》182頁的方法進行。檢測菌株Z的的生理生化特性，包括石蕊牛奶、接觸酶、V. P.反應(yīng)、淀粉水解、硝酸鹽還原反應(yīng)、明膠液化反應(yīng)、氧化酶、M. R、苯丙氨酸脫氨酶、檸檬酸鹽利用、脲酶試驗、丙酸鹽的利用、是否可以在含NaCl和pH5. 7的培養(yǎng)基上生長等試驗，方法參照東秀珠、蔡妙英主編的《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》353-385頁的方法。檢測結(jié)果如下在NA培養(yǎng)基上菌落呈圓形邊緣不整齊，乳白色，不透明，表面粗糙，有皺褶，無光澤。培養(yǎng)至36h，菌體均以休眠體芽孢的形式存在，菌落呈淺黃色。顯微觀察菌體為單細胞， 桿狀，單生或雙生，有時成鏈。革蘭氏染色陽性，芽孢卵圓形，中生，周生鞭毛。美藍染色，原生質(zhì)著色均勻。石蕊牛奶不產(chǎn)酸。接觸酶、V. P.反應(yīng)、淀粉水解、硝酸鹽還原反應(yīng)、檸檬酸鹽利用、明膠液化均為陽性。M. R、苯丙氨酸脫氨酶試驗、脲酶試驗、丙酸鹽的利用均為陰性。 可以在含 % NaCl和ρΗ5. 7的NA培養(yǎng)基上生長。2、16S DNA序列的測定參照Ausubel的細菌基因組DNA制備方法，用細菌通用引物27F和1492R進行PCR 擴增。PCR 反應(yīng)體系為 25 μ 1，其中 10XPCR Buffer 2. 5 μ 1，Primer27F 和 Primer 1492lU25pmoL)各 1 μ l，dNTP Mixture 0· 5 μ IJaq DNA Polymerase (5U/μ 1)0. 5 μ LddH2O 17. 5 μ 1，DNA 模板 2 μ 1。PCR 擴增反應(yīng)條件95°C 4min ；95°C lmin,55°C 40s, 72°C 2min，共 30 個循環(huán)；然后 72°C保持 7min。PCR 產(chǎn)物用 EZ-10 SpinColum DNA Gel Extraction Kit 回收試劑盒進行回收，并委托寶生物工程(大連)有限公司進行測序。測得的基因序列用BLAST軟件進行序列比對分析，并與GenBank中已知的16S rDNA進行同源性比較。檢測結(jié)果如下將該PCR擴增產(chǎn)物在GenBank中(登錄號JF74722》進行BLAST比對。結(jié)果表明，與Z菌株同源性高的50個菌株均是芽孢桿菌屬(Bacillus sp.)，其同源性達100%，其中表1所示為與菌株Z的16S rDNA同源性最高的10個菌株，由此可推斷菌株Z屬于芽孢桿菌屬(Bacillus sp.)。表116S rDNA同源性比較
序列登錄號菌株同源性HM107809. 1Bacillus amyloliquefaciens strain 16100%
權(quán)利要求
1.一種內(nèi)生枯草芽孢桿菌，其特征在于，保藏編號為CGMCC No. 4844。
2.權(quán)利要求1所述內(nèi)生枯草芽孢桿菌在防治胡椒瘟病中的應(yīng)用。
3.權(quán)利要求1所述內(nèi)生枯草芽孢桿菌在制備防治胡椒瘟病制劑中的應(yīng)用。
4.一種生防制劑，其特征在于，包括保藏編號為CGMCC No. 4844的內(nèi)生枯草芽孢桿菌。
5.權(quán)利要求4所述生防制劑在防治胡椒瘟病中的應(yīng)用。
6.一種生防制劑的制備方法，其特征在于，將保藏編號為CGMCC No. 4844的內(nèi)生枯草芽孢桿菌于PDA培養(yǎng)液中培養(yǎng)，然后過濾并調(diào)節(jié)菌液孢子數(shù)為IO8-IOki個/mL，即得生防制劑成品。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述制備方法，其特征在于，所述培養(yǎng)的溫度為2618°C。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述制備方法，其特征在于，所述培養(yǎng)的溫度為27°C。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述制備方法，其特征在于，所述培養(yǎng)的pH值為7-9。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述制備方法，其特征在于，所述培養(yǎng)的pH值為8。
全文摘要
本發(fā)明涉及微生物領(lǐng)域，具體公開了一種內(nèi)生枯草芽孢桿菌。本發(fā)明所述內(nèi)生枯草芽孢桿菌保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No.4844。本發(fā)明所述內(nèi)生枯草芽孢桿菌傳代至40代仍然具有較高抑制胡椒瘟病菌株孢子的活性，具有較高的遺傳穩(wěn)定性，同時其防治胡椒瘟病的效果達到化學(xué)防治的效果，且不污染環(huán)境，生態(tài)、安全，能夠廣泛應(yīng)用在胡椒瘟病的防治以及制備防治胡椒瘟病制劑中。
文檔編號A01P3/00GK102250816SQ20111020558
公開日2011年11月23日 申請日期2011年7月21日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月21日
發(fā)明者劉愛勤, 孫世偉, 桑利偉, 譚樂和, 鄔華松 申請人:中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院香料飲料研究所