一種甲基營(yíng)養(yǎng)芽孢桿菌及其制備生物型肥料增效劑的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)一種甲基營(yíng)養(yǎng)芽孢桿菌及其制備生物型肥料增效劑的方法。來(lái)源于味精廠排口土壤中分離、選育的谷氨酸依賴型甲基營(yíng)養(yǎng)芽孢桿菌(Bacillus?methylotrophicus)，已于2013年10月9日，經(jīng)中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心鑒定為甲基營(yíng)養(yǎng)芽孢桿菌(Bacillus?methylotrophicus)菌株BT1301；已保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC?M2013462。以此菌株為發(fā)酵菌株，通過(guò)斜面菌種活化、菌種液體搖瓶活化和液體深層發(fā)酵三級(jí)培養(yǎng)，發(fā)酵液經(jīng)無(wú)機(jī)鹽穩(wěn)定處理，制成γ-聚谷氨酸生物型肥料增效劑劑，制成的生物復(fù)合肥對(duì)多種蔬菜病害具有較強(qiáng)的拮抗作用，降低病原菌發(fā)病率，對(duì)蔬菜生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用。
【專利說(shuō)明】一種甲基營(yíng)養(yǎng)芽孢桿菌及其制備生物型肥料增效劑的方法【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及農(nóng)業(yè)生物技術(shù)和肥料【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種甲基營(yíng)養(yǎng)芽孢桿菌及其制備生物型肥料增效劑的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]y -PGA的全名是Y-Polyglutamic acid,是一種微生物發(fā)酵產(chǎn)生的細(xì)胞外陰離子型多聚氨基酸，由D-和L-谷氨酸通過(guò)α-氨基酸和Y-羧基酰胺鍵連接而高分子聚合物，Y -PGA通常由5000個(gè)左右的谷氨酸單體組成，相對(duì)分子質(zhì)量一般在100KD~1000KD，呈直鏈纖維狀，在Y-聚谷氨酸的分子鏈上具有大量的活性較高的游離羧基。除了其對(duì)人體無(wú)毒、生物可降解性和其降解產(chǎn)生對(duì)環(huán)境友好的終產(chǎn)物谷氨酸等優(yōu)點(diǎn)外，還包括其具有高吸水性及保水性、良好的控制釋放能力、螯合金屬離子、與鐵、鈣、鎂鋅等形成同離子復(fù)合體以獲得更佳的營(yíng)養(yǎng)生物可用性，以及良好的抗植物病原活性，刺激作物及其種子生長(zhǎng)以及保護(hù)其免受植物病原菌影響，整合植物營(yíng)養(yǎng)、提供土壤中難溶養(yǎng)分有效性、調(diào)整土壤PH等獨(dú)特功能，使Y-聚谷氨酸在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用具有較好前景。
[0003]專利CN102268389，公開(kāi)了一種甲基營(yíng)養(yǎng)芽孢桿菌及其發(fā)酵生產(chǎn)Y-聚谷氨酸的方法。該甲基營(yíng)養(yǎng)芽孢桿菌培養(yǎng)時(shí)不需要谷氨酸，但產(chǎn)率過(guò)低，約17g/L。制得的發(fā)酵液經(jīng)離心去除菌體，上清液加入2~4倍體積的無(wú)水乙醇、甲醇或丙酮沉淀聚谷氨酸，4°C靜置過(guò)夜，用有機(jī)溶劑洗滌，去離子水透析除去鹽，最后冷凍干燥，得到Y(jié)-聚谷氨酸。步驟復(fù)雜，其中還需使用大量化學(xué)溶劑洗滌沉淀，時(shí)間和成本都大大增加。專利申請(qǐng)?zhí)朇N102703356A，公開(kāi)了一種聚-Y-谷氨酸作為農(nóng)用芽孢桿菌保護(hù)劑的應(yīng)用，其中Y-聚谷氨酸也需要經(jīng)過(guò)滅菌、純化和真空干燥步驟，才能使用Y -聚谷氨酸，步驟復(fù)雜，使用操作繁瑣，增加了處理的時(shí)間和成本，不利于工業(yè) 生產(chǎn)。
[0004]綜上所述，節(jié)約Y -聚谷氨酸工業(yè)生產(chǎn)成本，大大提高發(fā)酵產(chǎn)率，以及對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行簡(jiǎn)單方便和穩(wěn)定處理，對(duì)Y —聚谷氨酸在農(nóng)業(yè)肥料方面應(yīng)用具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]為了克服以上所述之技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種甲基營(yíng)養(yǎng)芽孢桿菌及其制備生物型肥料增效劑的方法，使得Y —聚谷氨酸的生物發(fā)酵效率得以大大提高，以及解決傳統(tǒng)發(fā)酵液處理步驟復(fù)雜，使用大量化學(xué)溶劑洗滌和沉淀的問(wèn)題，大大節(jié)約工業(yè)應(yīng)用的時(shí)間和成本，有利于工業(yè)化生產(chǎn)以及環(huán)境保護(hù)。
[0006]本發(fā)明的技術(shù)方案:為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明一種來(lái)源于味精廠排口土壤中分離、選育的谷氨酸依賴型甲基營(yíng)養(yǎng)芽孢桿菌(Bacillus methylotrophicus),已于2013年10月9日，經(jīng)中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心鑒定為甲基營(yíng)養(yǎng)芽孢桿菌(Bacillusmethylotrophicus)菌株BT1301 ;該菌株已保藏于中國(guó)武漢武漢大學(xué)中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC M2013462。
[0007]本發(fā)明所述依賴谷氨酸發(fā)酵生產(chǎn)Y-聚谷氨酸的菌株甲基營(yíng)養(yǎng)芽孢桿菌(Bacillus methylotrophicus) BT1301,最初來(lái)源于味精廠排口土壤樣本,樣本經(jīng)液體培養(yǎng)基富集培養(yǎng)和稀釋涂布后，進(jìn)行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，最后對(duì)發(fā)酵液的Y -聚谷氨酸進(jìn)行定性定量分析，最終得到生產(chǎn)Y-聚谷氨酸的菌株，并進(jìn)行菌株的分離與鑒定。圖1是BT1301在蛋白胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上菌落顯微照片，顯微鏡下細(xì)長(zhǎng)桿狀，0.5~0.75 μ mX 1.5~
2.5 μ m，不規(guī)則形狀，有的細(xì)胞呈V形排列；圖2是BT1301在蛋白胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上菌落呈白色或灰色、不透明，圓形邊緣整齊。
[0008] 申請(qǐng)人:委托中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)經(jīng)過(guò)序列測(cè)定，該甲基營(yíng)養(yǎng)芽孢桿菌BT1301的16S rRNA核苷酸序列如SEQ ID No:1所示。菌株BT130116S rRNA基因測(cè)序BLAST結(jié)果說(shuō)明:與甲基營(yíng)養(yǎng)芽孢桿菌具有較高的同源性，相似度為99.86%，鑒定該菌株為甲基營(yíng)養(yǎng)芽孢桿菌。
[0009]甲基營(yíng)養(yǎng)芽抱桿菌(Bacillus methylotrophicus)BT1301具有以下性質(zhì):
[0010]1.形態(tài)特征
[0011]在蛋白胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞為0.5~0.75 μ mX 1.5~2.5 μ m大小的桿菌，當(dāng)培養(yǎng)基中添加谷氨酸時(shí)，見(jiàn)圖3，BT1301形成無(wú)色半透明隆起菌落，像半粒玻璃珠在平板上；菌落表面光滑邊緣整齊、濕潤(rùn)粘稠。
[0012]2.生理生化特征見(jiàn)表1和表2
[0013]表1生理生化特性一碳源利用
[0014]
【權(quán)利要求】
1.甲基營(yíng)養(yǎng)芽抱桿菌(Bacillusmethylotrophicus)菌株 BT1301,于 2013 年 10 月 9日保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC M2013462。
2.用權(quán)利要求1所述甲基營(yíng)養(yǎng)芽孢桿菌BT1301發(fā)酵生產(chǎn)Y-聚谷氨酸及其制備生物型肥料增效劑的方法，其特征在于，用甲基營(yíng)養(yǎng)芽孢桿菌(Bacillus methylotrophicus)BT1301CCTCC M2013462做出發(fā)菌株，進(jìn)行斜面菌種活化、菌種液體搖瓶活化和液體深層發(fā)酵三級(jí)培養(yǎng): 斜面菌種活化:將培養(yǎng)好的保藏斜面種(Bacillus methylotrophicus BT1301 CCTCCM2013462)劃線于新配制的LB斜面上，LB斜面組成如下:蛋白胨8~12g、酵母膏3~8g、氯化鈉9~llg、瓊脂15~22g、水11^，？!1值6.5~8.0，1211:滅菌20min，培養(yǎng)條件為:培養(yǎng)溫度33°C~37°C，培養(yǎng)I~4d ; 菌種液體搖瓶活化:將上述斜面菌種接種于液體LB活化培養(yǎng)液中，液體LB活化培養(yǎng)液組成如下:蛋白胨8~12g、酵母膏3~8g、氯化鈉9~llg、水lL，pH值6.5~8.0，500~1000mL三角瓶裝液1/3，121°C滅菌20min ;培養(yǎng)條件為:搖床轉(zhuǎn)速180~250r/min，培養(yǎng)溫度33°C~ 37°C，培養(yǎng)12~36h ； 液體深層發(fā)酵:液體深層發(fā)酵培養(yǎng)液組成如下:淀粉糖化液(淀粉水解糖的質(zhì)量濃度10~200g/L) 100~400mL/L、氯化鈣0.3~0.8g/L、蛋白胨3~8g/L、谷氨酸鈉30~60g/L、氯化鈉9~15g、硫酸鎂I~1.5g/L、磷酸二氫鉀2~6g/L、硫酸錳0.005~0.08g/L ;液體深層發(fā)酵罐為0.5~50立方米自動(dòng)控制高密度發(fā)酵罐，裝液量60%~85%，121°C滅菌20~30min ;培養(yǎng)條件為:接種量0.5~5%、攪拌轉(zhuǎn)速250~1000r/min、培養(yǎng)溫度33°C~37°C，培養(yǎng)I~4d ;得到深層發(fā)酵發(fā)酵液； 所述生物型肥料增效劑是由深層發(fā)酵發(fā)酵液與二價(jià)離子無(wú)機(jī)鹽組成。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種甲基營(yíng)養(yǎng)芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)Y-聚谷氨酸及其制備生物型肥料增效劑的方法，其特征在于，所述淀粉水解糖為利用木薯淀粉、甘薯淀粉、玉米淀粉、小麥淀粉、大米淀粉的一種或一種以上。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種甲基營(yíng)養(yǎng)芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)Y-聚谷氨酸及其制備生物型肥料增效劑的方法，其特征在于，所述二價(jià)離子無(wú)機(jī)鹽是鎂、鐵或鋅的無(wú)機(jī)鹽中的一種以上。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的甲基營(yíng)養(yǎng)芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)Y-聚谷氨酸及其制備生物型肥料增效劑的方法，其特征在于，所述鎂的無(wú)機(jī)鹽包括硫酸鎂、氯化鎂、草酸鎂的一種或一種以上；所述鋅的無(wú)機(jī)鹽包括硫酸鋅、氯化鋅、硝酸鋅、磷酸鋅的一種或一種以上；鐵的無(wú)機(jī)鹽包括硫酸亞鐵、氯化亞鐵、硝酸亞鐵的一種或一種以上。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種甲基營(yíng)養(yǎng)芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)Y-聚谷氨酸及其制備生物型肥料增效劑的方法，其特征在于，所述生物型肥料增效劑由液體深層發(fā)酵發(fā)酵液:鎂鹽按質(zhì)量百分比85~95:5~15組成；或由液體深層發(fā)酵發(fā)酵液:鋅鹽按質(zhì)量百分比85~95:5~15組成；或由液體深層發(fā)酵發(fā)酵液:鋅鹽:鎂鹽:二價(jià)鐵鹽按質(zhì)量百分比85~95:2~15:1~15:2~15組成。
7.利用權(quán)利要求2-6之一所述的方法制得的生物型肥料增效劑粉劑，其特征在于，將權(quán)利要求2-6之一所述生物型肥料增效劑與硅藻土按1:1~2質(zhì)量比混合、干燥制成粉劑。
8.利用權(quán)利要求7所述的生物型肥料增效劑粉劑制得的生物型肥料增效劑復(fù)合肥，其特征在于，將將權(quán)利要求7所述生物型肥料增效劑粉劑、尿素、磷肥、鉀肥和粘土按質(zhì)量比1~5:20~87:5~60:5~60:2~20混合得到復(fù)合肥。
【文檔編號(hào)】C12N1/20GK103992966SQ201410148228
【公開(kāi)日】2014年8月20日 申請(qǐng)日期:2014年4月14日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月14日
【發(fā)明者】邵海鋒 申請(qǐng)人:深圳市芭田生態(tài)工程股份有限公司