專利名稱：通過兩種微生物的順序作用將植物材料轉(zhuǎn)化為燃料和化學(xué)產(chǎn)品的方法
通過兩種微生物的順序作用將植物材料轉(zhuǎn)化為燃料和化學(xué)
產(chǎn)品的方法交叉引用本申請要求2008年2月27日提交的美國臨時申請61/032，048的優(yōu)先權(quán)，本文引 入該申請作為參考。
背景技術(shù)：
人們對于開發(fā)由可再生和可持續(xù)的生物質(zhì)資源產(chǎn)生可用能量的方法存在著興趣。 碳水化合物形式的能量可以在廢棄生物質(zhì)中和在專門的能量作物，如谷物(如玉米或小 麥)或草類(如柳枝稷(switchgrass))中找到。纖維素(cellulosic)材料和木質(zhì)纖維材 料在許多應(yīng)用中大量地生產(chǎn)、加工并使用。目前的挑戰(zhàn)是開發(fā)將碳水化合物轉(zhuǎn)化成為可用能量形式的可行和經(jīng)濟(jì)的策略。由 碳水化合物獲得有用的能量的策略包括乙醇(“纖維素乙醇”)和其他醇類(如丁醇)的 生產(chǎn)、碳水化合物轉(zhuǎn)化成氫和碳水化合物通過燃料電池直接轉(zhuǎn)化為電能。例如，DiPardo, Journal of Outlookfor Biomass Ethanol Production and Demand(EIA Forecasts), 2002 ；Sheehan, Biotechnology Progress,15 :8179,1999 ；Martin, EnzymeMicrobes Technology,31 :274, 2002 ；Greer, BioCycle,61-65, April 2005 ；Lynd, Microbiology and Molecular Biology Reviews，66 :3，506-577，2002 ；及 Lynd 等人，“Consolidated Bioprocessing of Cellulosic Biomass :AnUpdate, " Current Opinion in Biotechnology, 16 =577-583,2005中描述了生物質(zhì)乙醇的策略。雖然由谷物和糖生產(chǎn)乙醇是公知的，但這種方法涉及將有價值的糧食作物轉(zhuǎn)用于 能量生產(chǎn)。因此，將更經(jīng)濟(jì)和更豐富的植物材料(如木質(zhì)纖維材料)轉(zhuǎn)化為乙醇是可取 的。令人遺憾的是，盡管非常需要將包含木質(zhì)纖維素材料(纖維素、半纖維素和木質(zhì)素) 的源自植物的聚合物高效和完全地生物轉(zhuǎn)化為燃料和/或化學(xué)產(chǎn)品，但現(xiàn)在仍面臨挑戰(zhàn)， 因?yàn)橹挥心举|(zhì)纖維材料的纖維素和半纖維素可以通過目前已知的生物催化劑轉(zhuǎn)化為燃料 (如乙醇)。此外，材料的緊湊/致密的結(jié)構(gòu)加上木質(zhì)纖維素材料的木質(zhì)素成分的難消化性 (indigestibility)限制了木質(zhì)纖維素材料中纖維素和半纖維素的實(shí)質(zhì)部分(substantial portion)的生物利用度。并非所有的生物體可以利用這些復(fù)雜的化合物和結(jié)構(gòu)。通常情況 下，可以產(chǎn)生想要的終產(chǎn)物(包括可以用作燃料或其他功能化合物的化合物，優(yōu)選簡單糖 類或其他特殊碳基質(zhì))的生物體。目前用于生物轉(zhuǎn)化木質(zhì)纖維素物質(zhì)為燃料和/或化學(xué)產(chǎn)品的方法可以包括通過 機(jī)械、熱化學(xué)和生物化學(xué)過程對材料進(jìn)行大量而昂貴的預(yù)處理。一般地，這種預(yù)處理過程的 目標(biāo)包括(1)使得纖維素和半纖維素聚合物更易于為微生物利用，和(2)轉(zhuǎn)化復(fù)雜的纖維 素和半纖維素的多糖成為更簡單、可發(fā)酵的糖類或其他簡單化合物，其更容易通過微生物 轉(zhuǎn)化為燃料和其他化學(xué)產(chǎn)品。經(jīng)常用于木質(zhì)纖維素材料的預(yù)處理中的機(jī)械、熱化學(xué)和生化 過程構(gòu)成了主要成本且不是完全有效的。此外，目前用于由木質(zhì)纖維材料產(chǎn)生燃料和其他 化學(xué)產(chǎn)品的微生物缺乏用于裂解復(fù)雜植物多糖成為糖類(糖化作用)和然后以有效的方式 將得到的各種糖類轉(zhuǎn)化成燃料及其他化工產(chǎn)品的必要的細(xì)胞機(jī)構(gòu)(cellular machinery) 0因此，為了糖化復(fù)雜的多糖和更有效地轉(zhuǎn)化更廣泛的可發(fā)酵糖成為燃料和其他化學(xué)產(chǎn)品， 現(xiàn)在仍然需要利用更多能的微生物和/或微生物組合的優(yōu)勢的生物轉(zhuǎn)化方法。發(fā)明概述本發(fā)明提供了轉(zhuǎn)化復(fù)雜的植物多糖(包括纖維素材料)成為燃料和其他化學(xué)產(chǎn)品 的方法。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，該方法包括通過一種生物體(其然后被另一種生物體用作 生產(chǎn)希望的化合物的底物)轉(zhuǎn)化植物多糖成為較短鏈的多糖或其他化合物。在其他優(yōu)選的 實(shí)施方式中，該方法包括順序的纖維素水解性(cellulolytic)需氧微生物對植物多糖的 水解和厭氧微生物對水解產(chǎn)物的發(fā)酵。在第一方面，公開了一種用于產(chǎn)生生物燃料(如乙醇)和其他化學(xué)產(chǎn)品的方法。 該方法包括(1)在厭氧條件下提供生物質(zhì)材料，其中，生物質(zhì)沒有用外部提供的化學(xué)品或 酶進(jìn)行處理；(2)用非遺傳修飾厭氧細(xì)菌的第一培養(yǎng)物處理生物質(zhì)，其中，非遺傳修飾的厭 氧細(xì)菌轉(zhuǎn)化生物質(zhì)的至少一部分成為單糖和二糖；和(3)用作為非專性需氧菌(obligate aerobe)的微生物的第二培養(yǎng)物處理生物質(zhì)，其中，單糖和二糖轉(zhuǎn)化為生物燃料。在某些 實(shí)施方式中，該方法在封閉的容器中進(jìn)行。非遺傳修飾的厭氧細(xì)菌的第一培養(yǎng)物可以是 Clostridiumphytofermentans ο在第二個方面，公開了一種根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式的制造乙醇和其他化學(xué)產(chǎn) 品的方法。該方法包括(1)提供包含植物多糖的預(yù)處理的源自生物質(zhì)的材料；(2)在氧的 存在下，用包含纖維素水解性需氧微生物的第一培養(yǎng)物接種預(yù)處理的源自生物質(zhì)的材料， 以產(chǎn)生需氧培養(yǎng)液(aerobic broth)，其中，需氧微生物能夠至少部分地水解植物多糖；(3) 孵育需氧培養(yǎng)液，直到纖維素水解性需氧微生物消耗氧的至少一部分和水解植物多糖的至 少一部分，從而將需氧培養(yǎng)液轉(zhuǎn)化成為包含具有可發(fā)酵糖的水解產(chǎn)物的厭氧培養(yǎng)液；(4) 用包含能夠轉(zhuǎn)化可發(fā)酵糖成為乙醇的厭氧微生物的第二培養(yǎng)物接種厭氧培養(yǎng)液；和(5)發(fā) 酵接種的厭氧培養(yǎng)液，直到可發(fā)酵糖的一部分被轉(zhuǎn)化成乙醇。在第三個方面，公開了生產(chǎn)純化的生物燃料(如乙醇)和其他化學(xué)產(chǎn)品的三階段 方法。該方法包括(1)第一階段，其中，在厭氧條件下用非遺傳修飾的厭氧細(xì)菌的第一培 養(yǎng)物處理生物質(zhì)材料，其中非遺傳修飾的厭氧細(xì)菌無需外源提供的化學(xué)品或酶將生物質(zhì)基 本上轉(zhuǎn)化成為單糖和二糖；(2)第二階段，其中，單糖和二糖用第二微生物的培養(yǎng)物處理， 其中，單糖和二糖轉(zhuǎn)化為生物燃料；和(3)第三階段，其中，從殘留的生物質(zhì)和培養(yǎng)物分離 和回收產(chǎn)生的生物燃料。在某些實(shí)施方式中，該方法在封閉的容器中進(jìn)行。非遺傳修飾的 厭氧細(xì)菌的第一培養(yǎng)物可以是Clostridium phytofermentans。在上述方法的某些實(shí)施方式中，從發(fā)酵的厭氧培養(yǎng)液回收至少一部分乙醇。在其他的實(shí)施方式中，該方法進(jìn)一步包括溶解(Iyse)發(fā)酵的厭氧培養(yǎng)液中的需 氧和厭氧微生物以產(chǎn)生包含剩余的可發(fā)酵糖和細(xì)胞內(nèi)容物的溶解產(chǎn)物(Iysate)的步驟。 在一種變型中，溶解產(chǎn)物可以進(jìn)行另外的物理和/或化學(xué)處理。在另一個變型中，可以用另 一種能夠加快剩余的可發(fā)酵糖轉(zhuǎn)化為乙醇和其他化學(xué)產(chǎn)品的厭氧微生物接種溶解產(chǎn)物。在另一方面，公開了一種根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式的制造乙醇和其他化學(xué)產(chǎn)品 的方法。該方法包括(1)提供包含植物多糖的預(yù)處理的源自生物質(zhì)的材料；(2)在厭氧條 件下，用包含Clostridiumphytofermentans細(xì)胞的第一培養(yǎng)物接種源自生物質(zhì)的材料以 水解植物多糖的至少一部分，其中，培養(yǎng)物的細(xì)胞吸收水解的植物多糖的至少一部分作為細(xì)胞內(nèi)化合物；(3)溶解Clostridium phytofermentans細(xì)胞以產(chǎn)生溶解的培養(yǎng)液；(4)用 包含能夠轉(zhuǎn)化可發(fā)酵糖成為乙醇和其他化學(xué)產(chǎn)品的厭氧微生物的第二培養(yǎng)物接種溶解的 培養(yǎng)液；和(5)發(fā)酵接種的厭氧培養(yǎng)液，直到可發(fā)酵糖的至少一部分被轉(zhuǎn)化成乙醇和/或其 他化學(xué)產(chǎn)品。在另一方面，公開了一種生產(chǎn)生物燃料(如乙醇)和其他化學(xué)產(chǎn)品的方法。該方 法包括在中溫條件(mesophilic condition)下，在 Clostridium phytofermentans 禾口選自 丙酮丁酉享梭菌(Clostridiumacetobutyliticum)、熱纖梭菌(Clostridium thermocellum) 和食纖維梭菌(Clostridium cellovorans)的第二種梭菌屬細(xì)菌的共培養(yǎng)的存在下，使包 括含纖維素和半纖維素的植物材料的生物質(zhì)進(jìn)行發(fā)酵，所述培養(yǎng)的比例為使得纖維素乙 醇和半纖維素乙醇的轉(zhuǎn)化率大于通過使用單獨(dú)Clostridium phytofermentans或第二種 梭菌屬細(xì)菌獲得的轉(zhuǎn)化率的量。在另一方面，公開了一種生產(chǎn)生物燃料(如乙醇)和其他化學(xué)產(chǎn)品的方法。該方 法包括在中溫條件下，在Clostridium phytofermentans和運(yùn)動發(fā)酵單胞菌(Zymonomas mobilis)的共培養(yǎng)存在下，使包括含纖維素和半纖維素的植物材料的生物質(zhì)進(jìn)行發(fā)酵， 所述培養(yǎng)的比例為使得纖維素乙醇和半纖維素乙醇的轉(zhuǎn)化率大于通過使用單獨(dú)的 Clostridium phytofermentans或運(yùn)動發(fā)酵單胞菌獲得的轉(zhuǎn)化率的量。在另一方面，公開了一種同時糖化和發(fā)酵來自生物質(zhì)的纖維素固體物質(zhì)成為生 物燃料(如乙醇)和其他化學(xué)產(chǎn)品的方法。該方法包括在一定條件下，用Clostridium phytofermentans細(xì)菌處理封閉的容器中的生物質(zhì),其中，Clostridium phytofermentans 細(xì)菌產(chǎn)生足以基本上轉(zhuǎn)化生物質(zhì)為單糖和二糖的糖分解(saccharolytic)酶，和引入第二 微生物的培養(yǎng)物，其中，第二微生物能夠基本上轉(zhuǎn)化單糖和二糖為生物燃料。在另一方面，公開了一種由含木質(zhì)素的生物質(zhì)生產(chǎn)生物燃料的方法。該方法包 括(1)將含木質(zhì)素的生物質(zhì)與具有足以水解含木質(zhì)素的生物質(zhì)的至少一部分的濃度的 堿性水溶液接觸；(2)中和處理的生物質(zhì)至7-8的PH ； (3)在一定條件下，用Clostridium phytofermentans細(xì)菌處理封閉的容器中的生物質(zhì),其中，Clostridium phytofermentans 細(xì)菌產(chǎn)生足以基本上轉(zhuǎn)化處理過的生物質(zhì)為單糖和二糖的糖分解酶；和(4)引入第二微生 物的培養(yǎng)物，其中，第二微生物能夠基本上轉(zhuǎn)化單糖和二糖為生物燃料。在另一方面，公開了一種由生物質(zhì)生產(chǎn)生物燃料和營養(yǎng)發(fā)酵殘留物的方法。該 方法包括(1)用包含Clostridium phytofermentans的培養(yǎng)物處理生物質(zhì)，該包含 Clostridium phytofermentans的培養(yǎng)物在發(fā)酵反應(yīng)中產(chǎn)生醇和包含選自氨基酸、輔因子 (cofactor)、激素、蛋白質(zhì)、維生素和脂類的營養(yǎng)物的發(fā)酵殘留物；(2)在適于產(chǎn)生生物燃 料的條件下和適于產(chǎn)生營養(yǎng)物的條件下發(fā)酵培養(yǎng)物；(3)從培養(yǎng)分離生物燃料；和(4)回收 包含營養(yǎng)物的發(fā)酵殘留物。在另一方面，公開了一種由纖維素基質(zhì)生產(chǎn)乙醇的方法。該方法包括(1)在反 應(yīng)容器中提供包含施予了厭氧糖分解酶的纖維素基質(zhì)、Clostridium phytofermentans細(xì) 菌和任選的運(yùn)動發(fā)酵單胞菌(Zymomonasmobilis)細(xì)菌的漿料形式的反應(yīng)混合物；(2)攪拌 反應(yīng)混合物持續(xù)第一選定的時間段，其中，反應(yīng)混合物在足以引發(fā)并保持發(fā)酵反應(yīng)的條件 下反應(yīng)；(3)停止反應(yīng)混合物的攪拌足夠的時間以允許反應(yīng)混合物的不溶性基質(zhì)在第二選 定的時間段中沉淀，從而形成基本上不含懸浮固體的含乙醇流出層和殘留固體層；(4)在
6第二選定的時間段結(jié)束時和在進(jìn)行任何進(jìn)一步的攪拌之前，從反應(yīng)容器除去含乙醇的流出 物；(5)向含有殘留固體的反應(yīng)容器中添加包含步驟(1)的反應(yīng)混合物的成分的第二反應(yīng) 混合物；和(6)重復(fù)步驟(2)至(5)，以保持連續(xù)的發(fā)酵反應(yīng)。在另一方面，本發(fā)明提供了一種組合物，其包含在基本上不存在外源提供的酶、 空氣和添加的營養(yǎng)物的情況下，包含有運(yùn)動發(fā)酵單胞菌的第一培養(yǎng)物和不抑制發(fā)酵單胞菌 屬(Zymomonas)生長和發(fā)酵的量的Clostridium phytofermentans的第二培養(yǎng)物的發(fā)酵生 物質(zhì)。在另一方面，本發(fā)明提供了一種用于乙醇生產(chǎn)的封閉系統(tǒng)方法。該系統(tǒng)包括(1) 在能夠由生物質(zhì)產(chǎn)生糖的Clostridium phytofermentans的細(xì)菌存在下和能夠需氧和厭 氧地發(fā)酵糖并在厭氧發(fā)酵中產(chǎn)生乙醇的兼性厭氧菌的存在下，在至少大約35°C的溫度下， 在發(fā)酵容器中進(jìn)行產(chǎn)生乙醇的厭氧發(fā)酵，(2)從厭氧發(fā)酵物連續(xù)抽取發(fā)酵培養(yǎng)基的一部分； (3)從抽取的發(fā)酵培養(yǎng)基分離細(xì)菌，并將分離的細(xì)菌返回到厭氧發(fā)酵物中；和(4)從發(fā)酵培 養(yǎng)基的抽取部分除去乙醇。引用引入本文通過引用引入本說明書中提到的所有出版物、專利和專利申請，好像各個單 獨(dú)的出版物、專利或?qū)＠暾埦唧w和單獨(dú)地表明通過引用引入本文中。附圖簡述在所附的權(quán)利要求中詳細(xì)地提出本發(fā)明的新特征。通過參考提出利用本發(fā)明原理 的說明性實(shí)施方式的下面的詳細(xì)說明他附圖，可以獲得對于本發(fā)明的特點(diǎn)和優(yōu)勢的更好的 理解，附圖中

圖1描述示意性地顯示本發(fā)明的一種實(shí)施方式的方法的框圖。圖 2 顯示 C. phytofermentans 原液(0. 3% CB. MB)的生長。發(fā)明詳述^X除非另有定義，本文所用的科學(xué)和技術(shù)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人 員通常所理解相同的意義。為了本發(fā)明的目的，下列用語的定義如下?！吧锶剂稀?、“燃料和/或其他化學(xué)產(chǎn)品”和“其他產(chǎn)物”可以交替使用，并且在本 文中用來包括適合作為液體燃料、氣體燃料、試劑、化工原料、化學(xué)添加劑、處理助劑、食品 添加劑和可以添加化學(xué)產(chǎn)品的其他用途的化合物，且包括但不限于碳?xì)浠衔?、氫氣、?烷、羥基化合物(如醇類，如乙醇、丁醇、丙醇、甲醇等)、羰基化合物(如醛類和酮類(如丙 酮、甲醛、1-丙醛等))、有機(jī)酸、有機(jī)酸衍生物(如酯類(如蠟酯、甘油酯等))和其他功能 化合物(包括但不限于1，2_丙二醇、1，3_丙二醇、乳酸、甲酸、乙酸、琥珀酸、丙酮酸)、酶 (如纖維素酶、多糖酶(polysaccharase)、脂肪酶、蛋白酶、木質(zhì)素酶(Iigninase)和半纖維 素酶)，且可作為純的化合物、混合物或不純或稀釋的形式而存在。本文所用的“生物催化劑”包括酶和微生物，包括酶和微生物的溶液、懸浮液和混 合物。在某些情況中，這個詞指酶或微生物任一發(fā)揮某種特定功能的可能用途，在其他情況 中，這個詞指酶和微生物二者的結(jié)合用途，而在其他情況中，這個詞指酶和微生物二者中的 僅一個。這一用語的上下文表明本領(lǐng)域的技術(shù)人員理解的含義。本文所用的“植物多糖”指在植物物質(zhì)中存在的糖和糖衍生物的聚合物，以及糖聚合物的衍生物。示例性的植物多糖包括木質(zhì)素、纖維素、淀粉和半纖維素。一般來說，多糖 可以具有兩個或多個糖單元或糖單元的衍生物。糖單元和/或糖單元的衍生物可以以規(guī)則 方式或以其他方式重復(fù)。糖單元可以是己糖單元或戊糖單元，或這些的組合。糖單元的衍 生物可以是糖醇、糖酸、氨基糖等。本文所用的“生物質(zhì)”包括可以轉(zhuǎn)化為生物燃料、化學(xué)產(chǎn)品或其他產(chǎn)物的生物材 料。一種示例性的生物質(zhì)的來源是植物物質(zhì)。植物物質(zhì)可以是，例如，木本植物物質(zhì)、非木 本植物物質(zhì)、纖維素材料、木質(zhì)纖維素材料、半纖維素材料、碳水化合物、果膠、淀粉、菊粉 (inulin)、果聚糖(fructan)、葡聚糖、玉米、甘蔗、草、柳枝稷、竹子和由這些物質(zhì)衍生的材 料?？梢酝ㄟ^提及存在的化學(xué)物質(zhì)種類(如蛋白質(zhì)、多糖和油)進(jìn)一步描述植物物質(zhì)。多糖 包括各種單糖和單糖衍生物(包括葡萄糖、果糖、乳糖、半乳糖醛酸、鼠李糖等)的聚合物。 植物物質(zhì)還包括農(nóng)業(yè)廢棄的副產(chǎn)物或副產(chǎn)品流(side stream)，如果渣、玉米漿、玉米漿干 粉(corn steep solids)、酒糟(distillers grain)、果皮、核、發(fā)酵廢棄物、秸稈、木材、污 水、垃圾和剩余食物。這些材料可以來自農(nóng)場、林業(yè)、工業(yè)來源、家庭等。生物質(zhì)的另一非限 制的例子是動物物質(zhì)，包括例如牛奶、肉類、脂肪、動物加工廢棄物和動物糞便?！霸稀苯?jīng)常 用來指用于加工的生物質(zhì)，如本文所述的那些。本文所用的“可發(fā)酵糖”指可以用作微生物的碳源的糖和/或糖衍生物，包括這些 化合物(包括這些化合物中的兩種或多種)的單體、二聚體和聚合物。在某些情況下，生物 體可以在吸收裂解的材料之前，通過例如水解來裂解這些聚合物。示例性的可發(fā)酵糖包括 但不限于葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖、鼠李糖、纖維二糖、乳糖、蔗糖、麥芽糖和 果糖。本文所用的“培養(yǎng)液”指任何生長階段(包括剛接種后的時刻和任一或所有細(xì)胞 活動已停止后的時期)的接種培養(yǎng)基，且可以包括發(fā)酵后處理后的材料。如果合適的話，它 包括可溶性和不溶性物質(zhì)的組合、懸浮物質(zhì)、細(xì)胞和培養(yǎng)基的全部內(nèi)容物。本文所用的“糖化”指植物多糖向低分子量物質(zhì)的轉(zhuǎn)化，所述低分子量物質(zhì)可以被 附近的生物體利用。對于某些生物體，這包，向單糖、二糖、三糖和高達(dá)大約7個單體單元的 寡糖以及糖衍生物的類似鏈大小的糖衍生物及糖和糖衍生物的組合的轉(zhuǎn)化。對于某些生物 體，允許的鏈節(jié)可以更長，和對于某些生物體，允許的鏈節(jié)可以較短。本文所用的“預(yù)處理”或“預(yù)處理的”指無論以組合的步驟進(jìn)行的或順序進(jìn)行的任 何機(jī)械、化學(xué)、熱、生化過程或這些過程的組合，其達(dá)到去除或破壞木質(zhì)素的目的以使得植 物生物質(zhì)中的纖維素和半纖維素聚合物更容易為纖維素酶和/或微生物利用。在一些實(shí)施 方式中，預(yù)處理可以包括去除或破壞木質(zhì)素以使得植物生物質(zhì)中的纖維素和半纖維素聚合 物更容易為纖維素酶和/或微生物利用。在一些實(shí)施方式中，預(yù)處理可以包括使用一種類 型的微生物使得植物多糖更容易為另一類型的微生物利用。在一些實(shí)施方式中，預(yù)處理也 可以包括纖維素/或半纖維素材料的破壞和/或膨脹。蒸汽爆發(fā)(steam explosion)和氨 纖維膨脹(或爆發(fā))是公知的熱/化學(xué)技術(shù)。可以使用水解，包括利用酸和/或酶的方法。 也可以使用其他的熱、化學(xué)、生化、酶學(xué)技術(shù)。碰下面的描述和實(shí)施例詳細(xì)說明本發(fā)明的某些優(yōu)選實(shí)施方式。本領(lǐng)域技術(shù)人員會認(rèn) 識到，存在本發(fā)明范圍涵蓋的許多的變化和修改。因此，優(yōu)選的實(shí)施方式的描述不應(yīng)被視為限制本發(fā)明的范圍。本發(fā)明的各種實(shí)施方式提供涉及以下方面的益處1)以漸進(jìn)的方式在整個過程 中，而不是依賴于單一的初步預(yù)處理步驟的效果，使得木質(zhì)纖維素材料的纖維素和半纖維 素聚合物具有生物可利用性，無論是使聚合物更容易接近、水解它們、衍生化或以這些或其 他使它們可以由附近的生物利用的方式作用于它們；2)利用多種生物催化劑，以達(dá)到植物 聚合物的更完整的糖化、源自植物的糖向燃料和/或化學(xué)產(chǎn)品的更完全的轉(zhuǎn)化、源自植物 的糖向燃料和/或化學(xué)產(chǎn)品的更迅速的轉(zhuǎn)化；3)利用需氧微生物以從進(jìn)程中除去氧，從而 使得能夠隨后使用厭氧微生物，或在后續(xù)使用厭氧微生物或需氧微生物前利用厭氧微生 物；4)循環(huán)利用過程中的營養(yǎng)物，以盡量減少培養(yǎng)基的成本；和5)提供在過程中同時制造 兩種或多種產(chǎn)物的方法。本發(fā)明的某些實(shí)施方式可能顯示所有這些益處，而其他實(shí)施方式 可能顯示較少的益處，但仍保持在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。在一個優(yōu)選的實(shí)施方式中，預(yù)處理或沒有預(yù)處理的原料(如農(nóng)作物、作物殘渣、樹 木、木屑、鋸末、紙張、紙板以及含有纖維素、半纖維素和/或木質(zhì)纖維素的其他材料(統(tǒng)稱 為“原料”))接觸能夠轉(zhuǎn)化原料中的一種或多種植物多糖成為低分子量物質(zhì)的厭氧生物體， 所述低分子量物質(zhì)可以用作第二微生物生產(chǎn)燃料和/或其他化學(xué)產(chǎn)品的碳源。這些低分子 量物質(zhì)可以保持作為細(xì)胞外化合物，可以攝取作為細(xì)胞內(nèi)化合物，或同時作為細(xì)胞內(nèi)和細(xì) 胞外的化合物存在。生物體也可以至少部分地聚合或以某種其他方式結(jié)合這些化合物。在一種這樣的實(shí)施方式中，使用 Clostridium phytofermentans。Clostridium phytofermentans包括美國典型培養(yǎng)物保藏700394T號，且在一些實(shí)施方式中可以根據(jù)培 ff liftt ISDgT (ffarnick ^A International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 52 =1155-60,2002)的表型和基因型特征定義。本發(fā)明的方面一般包括用 于生產(chǎn)燃料(如乙醇)和/或其他有用的有機(jī)產(chǎn)品的系統(tǒng)、方法和組合物，其涉及例如， 菌株ISDgT和/或任何其他Clostridium phytofermentans種類的菌株，包括那些可以 由源自菌株ISDgT的或單獨(dú)分離的菌株。某些示例性的物種可以使用標(biāo)準(zhǔn)分類學(xué)規(guī)則來 定義(Stackebrandt 禾口 Goebel, International Journal of Systematic Bacteriology, 44 =846-9,1994)與典型菌株(ISDgT)相比具有97 %和更高的16S rRNA序列同源性值 的菌株和具有至少大約70%的DNA重組值(re-association value)的菌株可以是值得 考慮的Clostridium phytofermentans。存在相當(dāng)多的證據(jù)表明具有70%或更高的DNA 重組值的許多微生物也具有至少96%的DNA序列一致性，并共有定義物種的表型性狀。 Clostridiumphytofermentans菌株ISDgT的基因組序列分析表明大量很可能參與植物多 糖發(fā)酵機(jī)制和途徑的基因和遺傳基因座的存在，導(dǎo)致可以在這種微生物的Clostridium phytofermentans種的所有或幾乎所有菌株中發(fā)現(xiàn)異常的發(fā)酵性能。Clostridium phytofermentans菌株可以是天然的分離物或遺傳修飾的菌株。Clostridium phytofermentans提供了生物質(zhì)轉(zhuǎn)化為乙醇和其他產(chǎn)品的有用 的優(yōu)勢。Clostridium phytofermentans的一個優(yōu)勢在于它產(chǎn)生能夠水解多糖和高級 糖(higher saccharide)成為較低分子量的糖、寡糖、二糖和單糖的酶的能力。在一 些實(shí)施方式中，生物體可用于水解存在于生物質(zhì)中的各種高級糖成為低級糖，如在用 于發(fā)酵以產(chǎn)生乙醇、氫或如有機(jī)酸(包括甲酸、乙酸和乳酸)的其他化學(xué)品的制備中。 Clostridium phytofermentans的另一個優(yōu)勢是其水解含有己糖糖單元、含有戊糖糖單元和含有這兩種糖單元的多糖和高級糖成為低級糖，和在某些情況下水解成為單糖的能 力。這些酶和/或水解產(chǎn)物可用于發(fā)酵中以生產(chǎn)各種產(chǎn)品(包括燃料和其他化學(xué)產(chǎn)品)。 Clostridiumphytofermentans的另一個優(yōu)勢是由低級糖(如單糖)生產(chǎn)乙醇、氫和其他燃 料或化合物(如包括乙酸、甲酸和乳酸的有機(jī)酸)的能力。Clostridium phytofermentans 的另一個優(yōu)勢是進(jìn)行水解含有糖和/或高級糖或多糖的高分子量生物質(zhì)成為低級的糖及 發(fā)酵這些低級糖成需要的產(chǎn)品包括乙醇、氫氣和其他化合物(如包括乙酸、甲酸和乳酸的 有機(jī)酸)的組合步驟的能力。Clostridium phytofermentans的另一個優(yōu)勢是在包括升高的乙醇濃度、高糖濃 度、低糖濃度、利用不溶性碳源和/或厭氧條件下運(yùn)行的條件下生長的能力。這些特征可 以以不同的組合實(shí)現(xiàn)具有長發(fā)酵周期的運(yùn)行，且可用于結(jié)合批次發(fā)酵、進(jìn)料批次發(fā)酵(fed batch fermentation)、自種(self-seeding) /部分收獲發(fā)酵和從作為接種體的最終發(fā)酵物 回收細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，Clostridium phytofermentans接觸預(yù)處理或未預(yù)處理的含 有纖維素，半纖維素和/或木質(zhì)纖維素材料的原料?？梢源嬖诹硗獾臓I養(yǎng)物，包括含氮化 合物(如氨基酸、蛋白質(zhì)、水解蛋白質(zhì)、氨、尿素、硝酸鹽、亞硝酸鹽、大豆、大豆衍生物、酪蛋 白、酪蛋白衍生物、奶粉、奶制品(milk derivative)、乳清、酵母提取物、水解酵母、自溶解 的酵母、玉米漿、玉米漿干粉、谷氨酸一鈉和/或其他發(fā)酵氮源)、維生素和/或礦物質(zhì)補(bǔ)充 劑。在一些實(shí)施方式中，一種或多種其他低分子量的碳源可以被添加或存在，如葡萄糖、蔗 糖、麥芽糖、玉米糖漿、乳酸等。這些低分子量的碳源可以發(fā)揮多種功能，包括在發(fā)酵期開始 時提供初始碳源、幫助建立細(xì)胞計數(shù)、控制碳/氮比例、除去過量的氮或一些其他功能。與C. phytofermentans接觸一般包括至少一段具有足夠低的溶解氧的時期，以使 生物體繁殖和/或產(chǎn)生纖維素酶和/或在細(xì)胞內(nèi)儲存糖/多糖/寡糖物質(zhì)和/或產(chǎn)生燃料 和/或其他化學(xué)產(chǎn)品。可以通過任何適當(dāng)?shù)姆椒▽?shí)現(xiàn)適當(dāng)?shù)腿芙庋醯臈l件，包括加熱培養(yǎng) 基、用低氧氣體吹洗培養(yǎng)基、培養(yǎng)液或發(fā)酵罐、加入?yún)捬跎矬w、在培養(yǎng)基制備過程中排除 空氣等。在一些實(shí)施方式中，在無氧環(huán)境下培養(yǎng)Clostridium phytofermentans細(xì)胞，所 述無氧環(huán)境可以通過經(jīng)具有浸沒于培養(yǎng)基表面下的氣體出口的起泡器鼓入基本上不含 氧的氣體來實(shí)現(xiàn)和/或維持。過量氣體和由培養(yǎng)基中的反應(yīng)產(chǎn)生的流出物填充頂部空 間，并最終通過容器壁中形成的出氣口排出。可以用來維持厭氧條件的氣體包括N2、N2/ CO2(80 20)、N2/C02/H2(83 10 7)和隋性氣體(如氦和氬)。在2007年1月26日提 交的題為"Systems and Methods for Producing Biofuels and RelatedMaterials，，的美 國申請11/698，722中描述了實(shí)現(xiàn)厭氧條件的方法，本文通過引用完整引入該文獻(xiàn)。在某些實(shí)施方式中，C. phytofermentans可以降低原料中的一種或多種多糖的分 子量，并在細(xì)胞內(nèi)吸入低分子量的化合物的至少一部分。吸收這些化合物后，細(xì)胞被溶解并 接觸用于生產(chǎn)燃料和/或其他化學(xué)產(chǎn)品的另一種生物體。溶解發(fā)生在用第二生物體接種 之前、期間或之后。溶解和第二接種的相對時間選擇可以取決于以下事件所使用的溶解 方法、第二生物體的健壯性(robustness)和C. phytofermentans的健壯性。在某些情況 下，可以在用C. phytofermentans接種的同時或之前，用第二生物體接種培養(yǎng)液。適合用 作第二生物體的生物體包括那些能夠產(chǎn)生乙醇、甲醇、丙醇、丁醇、氫、甲烷、乳酸、乙酸、琥珀酸、丙酮酸、甲醛、丙酮或可作為燃料和/或其他化學(xué)產(chǎn)品的其他化合物的生物體。優(yōu)選 的生物體包括酵母(如釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae))、梭菌屬的種(如熱纖梭菌 (C. thermocellum)、丙酮丁醇梭菌(C. acetobutylicum)禾口食纖維梭菌(C. cellovorans)) 和產(chǎn)生乙醇的細(xì)菌(如運(yùn)動發(fā)酵單胞菌)。合適的溶解方法包括單獨(dú)或組合地添加酶(如溶菌酶、蛋白酶、脂肪酶、多糖酶)、 添加螯合劑(如磷酸鹽、EDTA、碳酸鹽、離子交換樹脂等)、高剪切混合、超聲處理、壓降漿 (pressure-drophomogenization)、添加酸或堿、添加氧化或還原劑或其他適當(dāng)?shù)氖侄巍８鶕?jù)產(chǎn)生的具體物質(zhì)和所需的純度，可以通過適當(dāng)?shù)募庸し椒ɑ厥债a(chǎn)生的燃料 和/或其他化合物。例如，當(dāng)生產(chǎn)乙醇時，可以將反應(yīng)物的全部內(nèi)容物轉(zhuǎn)移到蒸餾裝置 (di sti 11 ation unit)，且可以蒸餾和收集96體積％的乙醇/4體積％的水?？梢酝ㄟ^96 % 乙醇的共沸蒸餾(例如，通過加入苯，然后再蒸餾該混合物)，或?qū)?6%乙醇通過分子篩以 除去水而獲得燃料級乙醇(99-100%乙醇)。一方面，本發(fā)明使用順序的需氧或厭氧循環(huán)將纖維素/木質(zhì)纖維材料生物轉(zhuǎn)化為 燃料和化學(xué)產(chǎn)品。一些實(shí)施方式使用需氧/厭氧循環(huán)將纖維素/木質(zhì)纖維材料生物轉(zhuǎn)化為燃料和化 學(xué)產(chǎn)品。在一些實(shí)施方式中，厭氧微生物可以直接發(fā)酵生物質(zhì)而無需預(yù)處理。在某些實(shí)施 方式中，原料接觸能夠裂解源自植物的聚合材料為低分子量產(chǎn)物的生物催化劑，所述產(chǎn)物 可以隨后由生物催化劑轉(zhuǎn)化為燃料和/或其他需要的化學(xué)產(chǎn)品。根據(jù)一種實(shí)施方式的處理步驟可以包括1)將原料與需氧的纖維素水解性微生 物接觸，2)將產(chǎn)生的經(jīng)處理的原料與厭氧的纖維素水解性微生物接觸，該微生物也能夠發(fā) 酵糖成為燃料和/或化學(xué)產(chǎn)品，3)從液體部分(包括燃料和/或其他化學(xué)產(chǎn)品的至少一部 分)分離固體部分(包括微生物細(xì)胞、殘留原料和部分代謝的原料的至少一部分)，4)通過 機(jī)械、熱和/或化學(xué)技術(shù)處理固體，以實(shí)現(xiàn)殘留原料材料中的植物聚合物的至少部分裂解， 并產(chǎn)生可用的碳水化合物(如單糖、二糖、寡糖、多糖、糖醇和其他的糖衍生物)和與由前述 處理步驟產(chǎn)生的微生物細(xì)胞相關(guān)的其他營養(yǎng)物，和5)將處理的固體與能夠轉(zhuǎn)化存在的至 少一些碳水化合物為燃料和/或其他化學(xué)產(chǎn)品的微生物接觸。在一些實(shí)施方式中，可以預(yù)處理原料，如通過熱、機(jī)械和/或化學(xué)手段預(yù)處理。這 種預(yù)處理可以至少部分地水解存在的碳水化合物或蛋白質(zhì)，破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，增加表面積，或 使碳水化合物更容易為微生物或酶利用。在一些實(shí)施方式中，處理步驟包括1)在有氧條件下將預(yù)處理的生物質(zhì)材料接觸 需氧細(xì)菌的第一培養(yǎng)物，其中，需氧細(xì)菌能夠至少部分地水解預(yù)處理的生物質(zhì)，3)孵育需氧 培養(yǎng)液直到纖維素水解性需氧微生物消耗氧的至少一部分并水解生物質(zhì)的至少一部分，從 而轉(zhuǎn)化需氧培養(yǎng)液成為包括含可發(fā)酵糖的水解產(chǎn)物的厭氧培養(yǎng)液，和2)用包含能夠轉(zhuǎn)化 可發(fā)酵糖成為生物燃料的厭氧微生物的微生物第二培養(yǎng)物處理。一些實(shí)施方式使用厭氧/需氧循環(huán)用于纖維素/木質(zhì)纖維素材料向燃料和化學(xué)產(chǎn) 品的生物轉(zhuǎn)化。其他實(shí)施方式使用厭氧/厭氧循環(huán)用于纖維素/木質(zhì)纖維素材料向燃料和 化學(xué)產(chǎn)品的生物轉(zhuǎn)化。在一些實(shí)施方式中，厭氧微生物可以直接發(fā)酵生物質(zhì)而無需預(yù)處理。在一些實(shí)施方式中，處理步驟包括1)在厭氧條件下將生物質(zhì)材料接觸非遺傳修 飾的厭氧細(xì)菌的第一培養(yǎng)物，其中，生物質(zhì)沒有經(jīng)外源提供的化學(xué)品或酶處理，且其中，非遺傳修飾的厭氧細(xì)菌轉(zhuǎn)化生物質(zhì)的至少一部分成為單糖和二糖，和2)用非專性需氧菌的 微生物的第二培養(yǎng)物處理生物質(zhì)，其中，單糖和二糖轉(zhuǎn)化為生物燃料。該過程可在封閉的容 器中進(jìn)行。在一些實(shí)施方式中，厭氧細(xì)菌是C.phytofermentans。在一些實(shí)施方式中，第二 培養(yǎng)物是釀酒酵母、梭菌屬的種(如熱纖梭菌、丙酮丁醇梭菌和食纖維梭菌)或運(yùn)動發(fā)酵單 胞菌。在一些實(shí)施方式中，處理步驟也可以包括3)分離和回收所產(chǎn)生的生物燃料、殘留的 生物質(zhì)和培養(yǎng)物。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明包括產(chǎn)生生物燃料的方法，包括在中溫條件下，在 Clostridium phytofermentans和運(yùn)動發(fā)酵單胞菌的共培養(yǎng)的存在下，使包括含纖維素和 半纖維素的植物材料的生物質(zhì)進(jìn)行發(fā)酵，所述培養(yǎng)的比例為使得纖維素乙醇和半纖維素 乙醇的轉(zhuǎn)化率高于通過使用單獨(dú)的Clostridium phytofermentans或運(yùn)動發(fā)酵單胞菌獲 得的轉(zhuǎn)化率的量。在一些實(shí)施方式中，用Clostridium phytofermentans和運(yùn)動發(fā)酵單胞 菌的共培養(yǎng)獲得的轉(zhuǎn)化率高于通過使用單獨(dú)的Clostridiumphytofermentans或運(yùn)動發(fā) 酵單胞菌獲得的轉(zhuǎn)化率的 5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、 60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%。中溫條件優(yōu)選保持在大約28°至 約 35°。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了產(chǎn)生生物燃料的方法，包括在中溫條件下，在 Clostridium phytofermentans和選自丙酮丁醇梭菌、熱纖梭菌和食纖維梭菌的第二種 梭菌屬細(xì)菌的共培養(yǎng)的存在下，使包括含纖維素和半纖維素的植物材料的生物質(zhì)進(jìn)行發(fā) 酵，所述培養(yǎng)的比例為使得纖維素乙醇和半纖維素乙醇的轉(zhuǎn)化率高于通過使用單獨(dú)的 Clostridium phytofermentans或第二種梭菌屬細(xì)菌獲得的轉(zhuǎn)化率的量。在一些實(shí)施方式 中，用Clostridium phytofermentans和第二種梭菌屬細(xì)菌的共培養(yǎng)獲得的轉(zhuǎn)化率為高于 通過使用單獨(dú)的Clostridiumphytofermentans或第二種梭菌屬細(xì)菌獲得的轉(zhuǎn)化率的5%、 10% ,15%,20%,25%,30%,35%,40%,45%,50%,55%,60%,65%,70%,75%,80%, 85%、90%、95% 或 100%。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了 一種同時糖化和發(fā)酵來自生物質(zhì)的纖維素固體 成為生物燃料的方法。該方法包括在一定條件下，用Clostridium phytofermentans細(xì)菌 處理封閉的容器中的生物質(zhì)，其中，Clostridium phytofermentans細(xì)菌產(chǎn)生足夠基本上轉(zhuǎn) 化生物質(zhì)為單糖和二糖的糖分解酶。該培養(yǎng)物然后接觸第二微生物的培養(yǎng)物，其中，第二生 物體能夠基本上轉(zhuǎn)化單糖和二糖為生物燃料。第二培養(yǎng)物的例子包括但不限于釀酒酵母、 梭菌屬的種(如熱纖梭菌、丙酮丁醇梭菌和食纖維梭菌)和運(yùn)動發(fā)酵單胞菌。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種由含木質(zhì)素的生物質(zhì)生產(chǎn)生物燃料 的方法。該方法包括1)將含木質(zhì)素的生物質(zhì)與具有足以水解含木質(zhì)素的生物質(zhì)的 至少一部分的濃度的堿性水溶液接觸；2)中和處理過的生物質(zhì)至7-8的pH;3)在一 定條件下，用Clostridiumphytofermentans細(xì)菌處理封閉容器中的生物質(zhì)，其中， Clostridiumphytofermentans細(xì)菌產(chǎn)生足夠基本上轉(zhuǎn)化處理過的生物質(zhì)為單糖和二糖的 糖分解酶；和4)引進(jìn)第二微生物的培養(yǎng)，其中，第二生物體能夠基本上轉(zhuǎn)化單糖和二糖為 生物燃料。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種由生物質(zhì)生產(chǎn)生物燃料和營養(yǎng)發(fā)酵殘留 物的方法。該方法包括1)用包含Clostridiumphytofermentans的培養(yǎng)物處理生物質(zhì)，
12Clostridium phytofermentans在發(fā)酵反應(yīng)中產(chǎn)生醇和包含選自氨基酸、輔因子、激素、蛋 白質(zhì)、維生素和脂類的營養(yǎng)物的發(fā)酵殘留物；2)在適于產(chǎn)生生物燃料的條件下和適于生產(chǎn) 營養(yǎng)物的條件下發(fā)酵培養(yǎng)物；3)從培養(yǎng)物分離生物燃料；和4)回收包含營養(yǎng)物的發(fā)酵殘留 物。本發(fā)明的一個實(shí)施方式由圖1示意性地顯示。經(jīng)處理或未經(jīng)處理的原料11輸送到 需氧生物反應(yīng)器1中，在其中它受到一種或多種需氧微生物作用。步驟1是任選的需氧預(yù) 處理步驟。需氧培養(yǎng)的原料12然后輸送到厭氧生物反應(yīng)器2中，在其中它由一種或多種厭 氧微生物作用，以產(chǎn)生一種或多種用作燃料或其它用途的化合物，并任選地分解存在的糖。 在另一實(shí)施方式中，需氧培養(yǎng)1和厭氧培養(yǎng)2可在同一容器中進(jìn)行。厭氧處理的材料13輸 送到分離器3，在其中主要液體的部分15與富含固體的厭氧處理的殘留部分14分離。步 驟3是任選的分離步驟。在這里，“主要液體的部分”指由分離產(chǎn)生的具有較低懸浮固體的 部分。這部分一般是可流動的，且在一些實(shí)施方式中具有比其他部分高的透光百分比。可 能必要的話，主要液體的部分15經(jīng)進(jìn)一步處理，使得分離燃料或所需的化學(xué)產(chǎn)品。分離器 3可以是密度分離裝置，如沉淀池、澄清池、離心機(jī)、水力旋流器等，或者它也可以是膜裝置 (如反滲透裝置、橫流微濾、超濾、納米過濾等)，或者它也可以是過濾單元、或篩選單元、或 浮選單元、或這些類型的裝置的組合。厭氧處理的殘留部分14可以被丟棄、回收利用、進(jìn)一 步加工或用這些方法的組合進(jìn)行處理。厭氧處理的殘留部分14的進(jìn)一步加工可以包括機(jī)械、化學(xué)和熱處理步驟。在另一 實(shí)施方式中，殘留部分14通過發(fā)酵進(jìn)行加工。在另一實(shí)施方式中，殘留部分14由至少一個 處理步驟和發(fā)酵的組合進(jìn)行加工。處理后的殘留部分14也可以為了銷售其中存在的一種 或多種產(chǎn)品而進(jìn)行加工。在圖1中，厭氧處理的殘留部分14經(jīng)處理步驟4加工以產(chǎn)生處理的殘留材料16， 其然后再經(jīng)發(fā)酵步驟5加工以產(chǎn)生發(fā)酵殘留材料17。發(fā)酵殘留材料17然后經(jīng)分離步驟6 處理，以部分或完全地分離有用的產(chǎn)品(例如燃料或化學(xué)產(chǎn)品)。在一個實(shí)施方式中，分離 步驟6從富含固體的相18分離主要液體的相19。主要液體的相19然后可以進(jìn)一步加工以 分離和/或純化用作燃料或化學(xué)產(chǎn)品的材料。主要液體的相19的至少一部分也可以在處 理中回收。富含固體的相18可以被丟棄、回收利用、填埋、堆肥、用于向農(nóng)作物施肥或用作 其他與其組成(composition)有關(guān)的目的。本發(fā)明的另一實(shí)施方式提供了一種用于生產(chǎn)乙醇的封閉系統(tǒng)方法，包括以下步 驟1)在能夠由生物質(zhì)產(chǎn)生糖的Clostridium phytofermentans細(xì)菌存在下和的能夠需氧 和厭氧地發(fā)酵糖并在厭氧發(fā)酵中產(chǎn)生乙醇的兼性厭氧菌的存在下，在至少大約35°C的溫度 下，在發(fā)酵容器中進(jìn)行產(chǎn)生乙醇的厭氧發(fā)酵，2)從厭氧發(fā)酵連續(xù)地抽取發(fā)酵培養(yǎng)基的一部 分；3)從抽取的發(fā)酵培養(yǎng)基分離細(xì)菌，并將分離的細(xì)菌返回到厭氧發(fā)酵中；和3)從抽取的 發(fā)酵培養(yǎng)基的部分除去乙醇。在一種實(shí)施方式中，兼性厭氧細(xì)菌是大腸桿菌。本發(fā)明的另一實(shí)施方式提供了一種由纖維素基質(zhì)生產(chǎn)乙醇的方法，包括以 下步驟1)在反應(yīng)容器中提供包含施予厭氧的糖分解酶的纖維素基質(zhì)、Clostridium phytofermentans細(xì)菌和任選的運(yùn)動發(fā)酵單胞菌的漿料形式的反應(yīng)混合物；2)攪拌反應(yīng)混 合物持續(xù)第一選定的時間段，其中，反應(yīng)混合物在足以引發(fā)并保持發(fā)酵反應(yīng)的條件下反應(yīng)； 3)停止反應(yīng)混合物的攪拌持續(xù)足夠的時間以允許反應(yīng)混合物的不溶性基質(zhì)在第二選定的
13時間段中沉淀，從而形成基本上不含懸浮固體的含乙醇的流出物層和殘留固體層；4)在第 二選定的時間段結(jié)束時和任何進(jìn)一步的攪拌之前，從反應(yīng)容器除去含乙醇的流出物；5)向 含有殘留固體的反應(yīng)容器中添加包含步驟1)的反應(yīng)混合物的成分的第二反應(yīng)混合物；和 6)重復(fù)步驟2)至5)，以保持連續(xù)的發(fā)酵反應(yīng)。本發(fā)明還提供了組合物。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了在基本上不存在外源 提供的酶、空氣和添加的營養(yǎng)物的情況下包含含有運(yùn)動發(fā)酵單胞菌的第一培養(yǎng)物和不抑制 發(fā)酵單胞菌屬生長和發(fā)酵的量的Clostridium phytofermentans的第二培養(yǎng)物的發(fā)酵生物 質(zhì)的組合物?！?鄉(xiāng)千麵、輔麵■誦佳可能含有纖維素、半纖維素和/或木質(zhì)纖維素材料的原料可以源自農(nóng)業(yè)作物、作 物殘茬、樹木、木片、木屑、紙張、紙板、草和其他來源。纖維素是葡萄糖的直鏈聚合物，其中，葡萄糖單元通過β (1 — 4)鍵連接。半纖維 素是許多糖單體(包括葡萄糖、木糖、甘露糖、半乳糖、鼠李糖和阿拉伯糖)的分支聚合物， 并且可以具有同時存在的糖酸(如甘露糖醛酸和半乳糖醛酸)。木質(zhì)素是主要對-香豆醇 (p-coumarylalcohol)、松柏酉享(conferyl alcohol)禾口芥子酉享(sinapyl alcohol)的交聯(lián) 的外消旋大分子。這三種聚合物一起出現(xiàn)在植物生物質(zhì)中的木質(zhì)纖維素材料中。這三種聚 合物的不同特點(diǎn)可以使該組合難于水解，因?yàn)楦鞣N聚合物傾向于屏蔽其他聚合物免受酶的 攻擊。在一些實(shí)施方式中，原料材料可以在用于生產(chǎn)燃料和化學(xué)產(chǎn)品的生物過程之前進(jìn) 行任選的機(jī)械、熱化學(xué)和/或生物化學(xué)預(yù)處理，但未經(jīng)處理的木質(zhì)纖維素材料也可以用于 該方法中。機(jī)械方法可以減小木質(zhì)纖維素材料的顆粒大小，以便它可以在生物過程中更方 便地處理，還可以增加原料的表面積以促進(jìn)與化學(xué)劑/生物化學(xué)劑/生物催化劑的接觸。木 質(zhì)纖維素材料也可進(jìn)行熱和/或化學(xué)預(yù)處理以使植物聚合物更易利用，但因?yàn)楦鞣N實(shí)施方 式可以加入木質(zhì)纖維素處理的多個步驟，因此有可能會使用更溫和和較便宜的熱化學(xué)預(yù)處 理?xiàng)l件。添加裂解植物聚合物的酶(糖化作用)可以用作常規(guī)的木質(zhì)纖維素生物轉(zhuǎn)化過程 中的部分，且這些酶可以構(gòu)成主要的成本。機(jī)械過程包括并不限于，洗滌、浸泡、碾磨、粉碎、過篩、剪切和大小分選過程。化學(xué) 過程包括但不限于，漂白、氧化、還原、酸處理、堿處理、亞硫酸鹽處理、酸式亞硫酸鹽處理、 堿式亞硫酸鹽處理和水解。熱過程包括但不限于，滅菌、蒸汽爆發(fā)、在水存在或不存在的情 況下保持在升高的溫度下和冷凍。生化過程包括但不限于用酶處理和用微生物處理。可以 利用的各種酶包括纖維素酶、淀粉酶、β-葡萄糖苷酶、木聚糖酶、葡聚糖酶(gluconase)和 其他多糖酶(polysaccharase)；溶菌酶；漆酶和其他木質(zhì)素修飾酶；脂肪氧合酶、過氧化物 酶和其他氧化酶；蛋白酶；和脂肪酶。機(jī)械、化學(xué)、熱和生物化學(xué)過程中的一種或多種可以 組合或單獨(dú)使用。這種組合的過程也可以包括那些用于紙張、纖維素產(chǎn)品、微晶纖維素和纖 維素的生產(chǎn)中的過程，且可包括制漿、牛皮制漿(kraft pulping)、酸性亞硫酸鹽處理。原 料可以是來自利用對纖維素、半纖維素和木質(zhì)纖維素材料的這些處理的一種或多種的設(shè)施 (如造紙廠、纖維素廠、棉花加工廠或微晶纖維素廠)的副產(chǎn)品流或廢物流。原料還可以包 括含纖維素或含纖維質(zhì)的廢料。在準(zhǔn)備用厭氧生物接種原料時，可以將如氮源、鹽、維生素和微量元素的另外的營
14養(yǎng)物添加到培養(yǎng)液中。在接種之前、同時或接種后，培養(yǎng)液的氧含量降低到適于使用的特定 生物體的水平。一種優(yōu)選的生物體是C. phytofermentans?？梢圆捎酶鞣N方法以減少氧含 量。例如，可以用氮?dú)饣蚍呛鯕怏w流沖洗培養(yǎng)液或發(fā)酵罐，培養(yǎng)基可以在排除氧的情況下 配制，可以加熱培養(yǎng)基，或可以添加需氧生物體。在一個實(shí)施方式中，利用也能夠制造所需 的燃料和/或其他化學(xué)產(chǎn)品的需氧生物體或兼性厭氧生物體。第一生物體向第二生物體的 過渡然后可以通過改變通風(fēng)模式和選擇性溶解第一生物體來實(shí)現(xiàn)。厭氧牛物反應(yīng)容器對于本發(fā)明來說特別感興趣的是具有裂解纖維素和半纖維素及代謝由木質(zhì) 纖維素材料的糖化作用產(chǎn)生的己糖和戊糖的能力的厭氧纖維素水解性微生物(例如， Clostridium phytofermentans)。為了促進(jìn)也可以轉(zhuǎn)化糖為燃料和/或化學(xué)產(chǎn)品的厭氧纖 維素水解性生物催化劑的生長，有必要補(bǔ)充營養(yǎng)物以促進(jìn)快速生長和生化活性，但是，可以 至少部分基于所需要的營養(yǎng)物的簡單性和低成本選擇挑選用于該過程中的微生物培養(yǎng)。雖 然厭氧微生物可以同時糖化木質(zhì)纖維素材料和由植物聚合物產(chǎn)生的全部范圍的己糖和戊 糖轉(zhuǎn)化為燃料和/或化學(xué)產(chǎn)品，但各種類型的戊糖或己糖轉(zhuǎn)化為燃料和/或化學(xué)產(chǎn)品的速 度會發(fā)生變化。因此，一些糖被厭氧生物催化劑比其他催化劑更快地轉(zhuǎn)化為燃料和/或化 學(xué)產(chǎn)品。因此，本發(fā)明的一種實(shí)施方式允許木質(zhì)纖維素材料和厭氧纖維素水解性發(fā)酵生物 催化劑之間的充分接觸時間，以達(dá)到基本上完全的糖化，但只有糖向燃料和/或產(chǎn)品的部 分轉(zhuǎn)化。在一個實(shí)施方式中，將包括至少一種能夠水 解纖維素、半纖維素或木質(zhì)纖維素材 料并生產(chǎn)所需的燃料和/或其他化學(xué)產(chǎn)品的厭氧菌的厭氧培養(yǎng)物添加到原料的一部分中， 例如，原料12。在另一實(shí)施方式中，將包括至少一種能夠水解纖維素、半纖維素或木質(zhì)纖維 素材料并在細(xì)胞內(nèi)儲存水解的物質(zhì)的厭氧菌的厭氧培養(yǎng)物添加到原料的一部分。在一些實(shí) 施方式中，添加到原料中的厭氧菌既可以在細(xì)胞內(nèi)存儲水解的物質(zhì)，也可以產(chǎn)生所需的燃 料和/或其他化學(xué)產(chǎn)品。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，厭氧菌是C. phytofermentans.包含C. phytofermentans的厭氧培養(yǎng)物優(yōu)選維持在大約30°大約120小時。但 是，不同的生物體和不同的培養(yǎng)基組成可能需要較高或較低的溫度和較長或較短的發(fā)酵時 間。在這段時間內(nèi)，厭氧菌可以代謝培養(yǎng)液中存在的碳水化合物，以產(chǎn)生所需的燃料和/或 其他化學(xué)產(chǎn)品，并賦予殘留的生物質(zhì)更易于被另一種微生物后續(xù)發(fā)酵生物利用。在其他的 實(shí)施方式中，厭氧微生物水解培養(yǎng)液中存在的碳水化合物并在細(xì)胞內(nèi)存儲水解的物質(zhì)。在 其他的實(shí)施方式中，厭氧微生物水解碳水化合物，并在細(xì)胞內(nèi)存儲水解的物質(zhì)的一部分和 由水解的和/或存儲的物質(zhì)的一部分產(chǎn)生燃料和/或其它化學(xué)產(chǎn)品。在一些實(shí)施方式中， 如當(dāng)存在的原料不完全水解時，厭氧微生物可進(jìn)一步水解剩余的原料的至少一部分。產(chǎn)生 的燃料和/或其他化學(xué)產(chǎn)品通常聚集在細(xì)胞外培養(yǎng)基中，但是，在某些情況下，燃料和/或 其他化學(xué)產(chǎn)品將聚集在另一個位置。例如，氣體產(chǎn)物(包括氫)可以積聚在生物反應(yīng)器的 頂部空間中，它可以在生物反應(yīng)器的頂部空間排出、捕獲等。其他燃料和/或其他化合物可 以在細(xì)胞內(nèi)聚集。任選的厭氧處理原料的分離當(dāng)原料耗盡，植物多糖的水解速度已經(jīng)減慢，生物體的碳存儲已經(jīng)放緩時，或由于 其他原因(如保持平穩(wěn)的發(fā)酵廠的運(yùn)作)，厭氧發(fā)酵步驟可以停止。各種方法可以用來監(jiān)測生物體的活性，并確定停止厭氧發(fā)酵的時間點(diǎn)(包括但不限于監(jiān)測廢氣率(off-gas rate) 和/或組成、培養(yǎng)液的PH值和培養(yǎng)基組成)。在某些情況下，可以監(jiān)測當(dāng)生產(chǎn)速率降低時停 止的發(fā)酵中的CO2生產(chǎn)速率和/或氫生產(chǎn)速率。培養(yǎng)液然后可以分成富含固體的部分和主 要液體的部分，例如通過離心、沉淀、過濾、用膜、旋流器處理等。例如，在圖1中，培養(yǎng)液然 后可以分成富含固體的部分14和主要液體的部分15。在各種實(shí)施方式中，主要液體的部分(例如，液體部分15)可以包含一種或多種可 進(jìn)一步純化或直接使用的需要的燃料/或其他化學(xué)產(chǎn)品。產(chǎn)品的例子包括醇類、酶類、有機(jī) 酸類和有機(jī)酸酯類。采用的純化方法可以包括濃縮方法(如蒸發(fā)、超濾等)、結(jié)晶、沉淀(如 用鹽或加入非溶劑)、液_液分離、蒸餾、色譜、離子交換、吸附、透析和干燥。在一些實(shí)施方式中，一種或多種產(chǎn)品包含于富含固體的部分中，或一種產(chǎn)品可以 在富含固體的部分中和相同或不同的產(chǎn)品可以在主要液體的部分中。當(dāng)產(chǎn)品包含于富含固 體的部分中時，富含固體的部分可以作為產(chǎn)品本身進(jìn)行處理，或此部分可進(jìn)一步加工，如通 過干燥、洗滌、溶解、提取、衍生化(derivitizing)和/或通過其他技術(shù)加工，以達(dá)到預(yù)期的 純度和產(chǎn)品特性?？蛇x擇地，厭氧處理的原料可直接分離成產(chǎn)品材料和殘留部分。這個途徑的例子 是從靜止底部為殘留部分(例如，殘留部分14)的厭氧處理原料蒸餾乙醇。這一途徑的變型是在發(fā)酵過程中回收一種或多種氣體產(chǎn)物(如氫或甲烷)。在圖 1所示的實(shí)施方式中，分離過程3可以在發(fā)酵過程中在發(fā)酵容器內(nèi)進(jìn)行而不是在停止發(fā)酵 后進(jìn)行，并包括從發(fā)酵培養(yǎng)液14分離氣態(tài)產(chǎn)物流15。液體部分主要液體的部分(如液體部分15)經(jīng)常含有厭氧發(fā)酵過程中產(chǎn)生的燃料和/或化 學(xué)產(chǎn)品。所需的燃料和/或其他化學(xué)產(chǎn)品的回收取決于微生物產(chǎn)生的具體化合物。例如， 在醇類(如乙醇、甲醇、丙醇、丁醇等)的情況下，可以蒸餾液體部分以生產(chǎn)高濃度的醇，其 然后可以進(jìn)一步脫水，例如用分子篩、過蒸汽化(pervaporation)、另外的蒸餾步驟(包括 用試劑破壞共沸物或以其他方式促進(jìn)分離)或進(jìn)行分離的其他技術(shù)。所需的燃料和/或其 他化學(xué)產(chǎn)品也可以被純化，以除去其他微量成分，或也可以直接使用。當(dāng)沒有任選的分離步驟時，厭氧處理的殘留部分和厭氧處理的培養(yǎng)液的處理當(dāng)沒有利用任選的分離步驟(例如，分離步驟3)時，厭氧處理的殘留物(如厭氧 處理的殘留物14)或厭氧處理的培養(yǎng)液(如厭氧處理的培養(yǎng)液13)進(jìn)行機(jī)械、熱化學(xué)和/ 或生化處理(如生化處理4)以進(jìn)一步釋放難以處理的(recalcitrant)植物聚合物，糖化 植物聚合物和/或釋放未代謝的糖類或來自微生物細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)內(nèi)容物的儲存糖類/糖聚 合物和可溶性營養(yǎng)物。如此處理的材料將稱為“處理的殘留材料”，無論加工中是否采用任 選的分離步驟(如分離步驟3)。由此加工固體或厭氧處理的培養(yǎng)液的這一進(jìn)一步的處理產(chǎn) 生的處理的殘留材料(如處理的殘留材料16)可以用作動物飼料，作為燃料燃燒，或以其他 方式利用，如通過另外的加工或在該過程中反復(fù)利用。使用的加工技術(shù)可以包括細(xì)胞裂解，如通過超聲波、高剪切混合、蒸汽爆發(fā)、酶處 理、化學(xué)品處理、滲壓震擾或其他適當(dāng)?shù)募夹g(shù)。其他加工技術(shù)可以包括蛋白質(zhì)和/或多糖的 水解，如通過用酶、酸、溫度或其他合適技術(shù)處理。其他產(chǎn)物(如胞外和/或分泌的酶)可以通過適當(dāng)?shù)募夹g(shù)回收。這些技術(shù)的例子
16可以包括超濾、納米過濾、反滲透、過濾、離心、重力沉降、浮選、干燥、透析、鹽沉淀、通過加 入非溶劑沉淀、達(dá)到或接近等電點(diǎn)的沉淀以及通過這些方法和其他方法的組合的沉淀?？梢岳玫拿赴▎为?dú)或組合的溶菌酶、蛋白酶、多糖酶、脂肪酶。在一些實(shí)施方 式中，使用這些種類中一種的1種以上的酶，例如使用兩種或多種蛋白酶?？梢酝ㄟ^加入純 化或部分純化形式的單個的酶或通過加入具有存在的多種酶和酶類型的酶混合物，來利用 這些酶。在一些實(shí)施方式中，可以通過酶的加入利用化學(xué)、熱或機(jī)械處理。這種額外的處理 可以在酶的加入之前，期間和/或之后進(jìn)行。這樣的處理可以包括加熱、冷卻、滲透壓的變 化、加入螯合劑、高剪切混合、均質(zhì)化、超聲、加入氧化劑、加入還原劑及這些和其他合適技 術(shù)的組合。在一些實(shí)施方式中，通過溶解步驟暴露的細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)可以包括含糖化合物。這些 含糖化合物(包括多糖)的水解可以釋放單糖、二糖、三糖或較高級的糖。一般來說，這種 水解的目的是提高這些糖類對于隨后的微生物培養(yǎng)的生物利用度。這種培養(yǎng)可以作為循環(huán) 步驟的部分，或用于隨后的下游發(fā)酵步驟。處理的殘留材料的發(fā)酵處理的殘留材料(如殘留材料16)可以用一種或多種另外的生物體(例如厭氧微 生物)發(fā)酵，以產(chǎn)生發(fā)酵的殘留材料(如發(fā)酵殘留材料17)，其包括一種或多種用作燃料或 化學(xué)產(chǎn)品的化合物。示例性的另外的微生物包括釀酒酵母、運(yùn)動發(fā)酵單胞菌、丙酮丁醇梭 菌、C. phytofermentans、熱纖梭菌、食纖維梭菌以及產(chǎn)生或經(jīng)工程化以產(chǎn)生醇類、有機(jī)酸、 有機(jī)酸衍生物、醛、酮、氫或甲烷的其他生物體。在一些實(shí)施方式中，另外的生物體可以是優(yōu)先利用只是被厭氧培養(yǎng)步驟中使用 的微生物緩慢利用的糖的生物體。例如，對于C.phytofermentans，緩慢利用的糖類包括 乳糖、阿拉伯糖和木糖，而更迅速利用的糖類包括葡萄糖、纖維二糖和半乳糖。對于運(yùn)動 發(fā)酵單胞菌，更迅速利用的糖類包括葡萄糖、果糖和蔗糖。在此步驟產(chǎn)生的產(chǎn)物可能與在 厭氧發(fā)酵步驟產(chǎn)生的相同或不同。處理的殘留材料的發(fā)酵條件根據(jù)所使用的具體生物體 和最終需要的產(chǎn)物而變化。對于C. phytofermentans，在排除氧和低于大約8. 5的pH的 條件下，使用大約28°C至大約38°C或優(yōu)選大約33至36°C或大約35°C的溫度。其他培養(yǎng) 條件可以在 2007 年 8 月 2 日提交的題為 “System and Methods forProducing Biofuels and Related Materials” 的美國專利申請 11/698，727 和 Thomas A. Warnick 等人， Clostridium phytofermentans sp.nov., Acellulolytic Mesophile from Forest Soil, 52 International Journal ofSystematic and Evolutionary Microbiology 1155 (2002) 中發(fā)現(xiàn)，本文通過引用將其完整引入。發(fā)酵的殘留材料的分離發(fā)酵的殘留材料(如發(fā)酵的殘留材料17)可通過例如離心、沉淀，過濾和用膜、旋 流器處理等分為富含固體的部分(如富含固體的部分18)和主要液體的部分(如液體部分 19)。在一些實(shí)施方式中，發(fā)酵的殘留材料可直接分離成產(chǎn)品材料和富含固體的材料。 這種方法的例子是從靜止底部為富含固體的材料(例如，富含固體的材料18)的厭氧處理 原料蒸餾乙醇。在其他的實(shí)施方式中，如當(dāng)產(chǎn)品是氣體(如氫或甲烷)時，可以通過從發(fā)酵罐除去氣相而在發(fā)酵罐中發(fā)生從發(fā)酵的殘留材料(如發(fā)酵的殘留材料17)分離產(chǎn)品。當(dāng)從 培養(yǎng)液直接分離產(chǎn)物時和當(dāng)從發(fā)酵罐收集氣體產(chǎn)物時，可以對產(chǎn)物流進(jìn)行額外的純化或處
理步驟。富含固體的材料富含固體的部分(如富含固體的部分18) —般含有木質(zhì)纖維素材料和微生物細(xì) 胞。在一些實(shí)施方式中，這部分可能會被丟棄，用作動物飼料、肥料或掩埋。在其他的實(shí)施 方式中，可以用機(jī)械、化學(xué)、熱方法或這些方法的組合處理這些固體。處理的固體可以具有 回收的其它產(chǎn)物，或它們可以在該過程的上游點(diǎn)回收，或者它們可以例如在額外的發(fā)酵步 驟中處理。在一些實(shí)施方式中，可以處理富含固體的材料以分離含有糖和/或營養(yǎng)物的主 要液體的部分?？梢砸耘c材料的剩余部分同樣的方式或不同的方式利用這種主要液體的部 分。處理的固體的隨后發(fā)酵在各種實(shí)施方式中，將分離的富含固體的部分返回至較早的培養(yǎng)步驟中，以便比 以另外的方式可能實(shí)現(xiàn)的更完全地將植物聚合物轉(zhuǎn)化為糖和有用的產(chǎn)品。在一些實(shí)施方式 中，與“單程”方法相比，更溫和的處理和/或更經(jīng)濟(jì)的處理步驟是可能的，因?yàn)槟举|(zhì)纖維素 材料會由于微生物對原料作用的結(jié)果而被明顯軟化。此外，由在該方法的培養(yǎng)階段生長的 細(xì)胞釋放的細(xì)胞材料的循環(huán)利用可以作為在那些階段中的營養(yǎng)物，這導(dǎo)致成本降低。在其他的實(shí)施方式中，用另外的生物體培養(yǎng)經(jīng)處理的處理固體以產(chǎn)生燃料和/或 其他化學(xué)產(chǎn)品。優(yōu)選的生物體包括那些快速利用只是被用于厭氧培養(yǎng)步驟中的微生物緩慢 利用的糖的生物體。此步驟產(chǎn)生的產(chǎn)物可能與厭氧發(fā)酵步驟中產(chǎn)生的產(chǎn)品相同或不同。任選的需氧生物反應(yīng)器預(yù)處理在一些實(shí)施方式中，預(yù)處理或未預(yù)處理的木質(zhì)纖維素材料可以任選地與同時 和/或順序地促進(jìn)糖化和氧消耗的活性纖維素水解性需氧微生物(例如，里氏木霉 (Trichoderma reesei))接觸。糖化酶的原位產(chǎn)生可以減少處理成本，且除去氧產(chǎn)生了適于 纖維素水解性厭氧微生物生長的環(huán)境。在一個實(shí)施方式中，將包含至少一種纖維素水解性需氧微生物的培養(yǎng)物添加到原 料中。如需要，額外的營養(yǎng)物(如氮源、維生素、礦物質(zhì)和微量元素)可以通過微生物添加。 加入足夠的接種體以在合理時間內(nèi)提供良好的生長?？梢钥刂苹蚓彌_PH值到微生物的合 適的范圍。如需要，可以為生物體提供通風(fēng)，并將溫度操控在合適的范圍內(nèi)。在另一實(shí)施方式中，如上，將包含至少一種纖維素水解性需氧微生物的培養(yǎng)物添 加到含有對于需氧細(xì)胞增殖足夠的原料和營養(yǎng)物的漿料中。將這種培養(yǎng)物維持在對于生物 體適當(dāng)?shù)臏囟群蚉H值并結(jié)合足夠的通風(fēng)以支持生物體生長。此外，可以使用富氧氣流來代 替或與空氣流結(jié)合，以達(dá)到所需要的細(xì)胞活性或溶解氧含量。在需氧發(fā)酵末期，如通過監(jiān)測木質(zhì)纖維素基質(zhì)的水解速率或其他適當(dāng)?shù)姆椒ㄋ_ 定的，減少通風(fēng)以使生物體消耗剩余的氧，以準(zhǔn)備用于厭氧培養(yǎng)的生長?？梢圆捎酶鞣N方法 以降低氧含量。例如，在批培養(yǎng)中，可以簡單地關(guān)閉進(jìn)風(fēng)，或可以用氮?dú)饣蜓鹾臏p的氣流取 代空氣。可選擇地，可以將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移(例如，通過管道)到另一個容器，并在轉(zhuǎn)移過程中， 將培養(yǎng)物與氧供應(yīng)切斷。在連續(xù)培養(yǎng)中，培養(yǎng)液可以通過其中不添加氧的區(qū)域。這樣的區(qū) 域可以是生物反應(yīng)器的部分、管道、另一容器等。實(shí)施例實(shí)施例1. MBl培養(yǎng)基的制備可以在燒杯中通過混合以下成分制備MBl培養(yǎng)基a. 750毫升雙蒸水b. 8 克 K2HPO4c. 4 克 KH2PO4d. 1 克(NH4)2SO4e. 6克半胱氨酸f. 6克Amberex695AG 6克(經(jīng)濟(jì)的酵母提取物可以使用Bacto)g.底物-例如，纖維二糖、葡萄糖、纖維素以及本文所述的其他底物如果底物是不溶性的(如玉米秸稈、紙漿(paper sludge))，培養(yǎng)基的pH值在沒有 底物的情況下進(jìn)行調(diào)整。將培養(yǎng)基分布于分離的容器中，并將底物分別添加到各個容器中。 接種體繁殖(inoculumpropagation)的標(biāo)準(zhǔn)品為0. 3%的纖維二糖。用NaOH或KOH將pH 值調(diào)整到7. 50。將ddH20添加至IL的體積。將培養(yǎng)基分布于獨(dú)立的容器中，密封，并使得 絕氧。將培養(yǎng)基在設(shè)定為121°C的液體中高壓滅菌持續(xù)最少20分鐘。如果高壓滅菌器中 的總體積大于3升或容器容納大于500毫升，那么時間增加?？梢允褂闷渌麜r間和溫度，限 制是過多熱量或過長時間可能會破壞糖底物?？梢杂蒘ensient Flavors Co. , 330S. Mill Street, Juneau WI53039 (920-386-4527)獲得 Amberex 695AG?？梢栽诟邏簻缇疤砑拥孜?。并不需要使用刃天青(Resazurin)。任選地，可以添 加刃天青以保證該容器是絕氧的。將所有成分都放入燒杯中。加入水，且如果需要，用6N KOH調(diào)整pH至pH 7.50。用微波加熱混合物至剛剛沸騰。迅速取出后，使用Hungate方法 用來形成絕氧或使用真空歧管來用氮?dú)馐乖嚬芑驘拷^氧。如果使用真空歧管，則培養(yǎng)基應(yīng)置于適用橡膠隔片的試管或/瓶中。凸緣試管(如 Cat#2048-11800 Bellco Glass Inc，Vineland NJ)通常用橡膠隔片密封，或?qū)τ谳^大的培 養(yǎng)體積，使用配備位于螺絲蓋的適當(dāng)位置的適當(dāng)大小的橡膠隔片的螺絲蓋瓶/燒瓶。隨后 可以用無菌針刺穿試管和燒瓶的橡膠隔片，以加入接種物或底物或取出樣品進(jìn)行分析。實(shí)施例2. GS-2培養(yǎng)基的制備可以在燒杯中通過混合以下成分制備GS-2培養(yǎng)基a. 750毫升雙蒸水b. 2. 90 克 K2HPO4c. 1. 50 克 KH2PO4d. 2. 10 克尿素e. 2. 00克鹽酸半胱氨酸f. 10. 00 克 MOPSg. 3. 00克二水合檸檬酸三鈉h. 6 克 Bacto 酵母提取物(Catalogueii2I275O Becton, Dickinson Co.)i. 1.00毫升0. 的刃天青
j.底物-例如，纖維二糖、葡萄糖、纖維素以及本文所述的其他底物添加ddH20到補(bǔ)足900mL。如果底物是不溶性的(玉米秸稈、紙漿)，在沒有底物的 情況下調(diào)整PH值。然后將培養(yǎng)基分布于單獨(dú)的容器中，并將底物分別添加到各個容器中。 接種體繁殖的標(biāo)準(zhǔn)品為0. 3%的纖維二糖。用NaOH或KOH將pH值調(diào)整到7. 50。將培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到圓底燒瓶中并用微波加熱至沸騰，而不將培養(yǎng)基沸騰。將燒瓶放 置在Himgate儀器附近的加熱的攪拌板上，并保持加熱至恰未沸騰，同時用氮?dú)鉀_洗，直到 培養(yǎng)基“去粉紅色(cbpinks) ”。在恒定的氮?dú)鈿夥障拢瑢?. 7毫升分配到各管，用氮?dú)鉀_洗直到刃天青無色。冷卻 培養(yǎng)基至室溫，然后，在冰浴中冷卻10分鐘。將管放置在具有向下牢固地擰緊在塞子頂部的頂板和墊的壓熱鍋(autoclave press)中。(使用在底部具有橡膠墊的試管架以避免管開裂。)將培養(yǎng)基在設(shè)定為121°C的液體中高壓滅菌持續(xù)最少20分鐘。如果高壓滅菌器中 的總體積大于3升或容器容納大于500毫升，那么增加時間。可以使用其他時間和溫度，限 制是過多熱量或過長時間可能會破壞糖底物。經(jīng)過高壓滅菌后，使得試管達(dá)到室溫，并從壓 熱鍋中取出。使用Hungate儀器和恒定的氮?dú)饬?，添?. 0毫升的無菌GS-2鹽。高壓滅菌后， 加入10% ν/ν的GS-2鹽。GS-2鹽的配方如下GS-2 鹽a. ddH20100 毫升b.MgCl2*6H20 1. 0 克c.CaCl2*2H20 0. 15 克d. FeS04*7H20 0. 00125 克可以使得培養(yǎng)基絕氧或需氧地使用。如果有氧，添加時培養(yǎng)基會變成微粉紅色；它 由于培養(yǎng)基中的半胱氨酸會很快地去粉紅色。如對培養(yǎng)基(上文)一樣高壓滅菌。在二者都冷卻之后和接種前，向培養(yǎng)基添加10% ν/ν的鹽如果是培養(yǎng)基管，則達(dá) 到最終的10毫升體積，9mL的GS-2培養(yǎng)基和ImL的GS-2鹽。實(shí)施例3.培養(yǎng)基高壓滅菌程序高壓滅菌設(shè)定溫度為121°C，其相當(dāng)于15psi的壓力。液體循環(huán)如果高壓滅菌器中的培養(yǎng)基總體積小于或等于3升，運(yùn)行20分鐘，如果 高壓滅菌器中的培養(yǎng)基的總體積大于3升或如果單獨(dú)的容器容納500毫升或更多，增加高 壓滅菌的時間。高壓滅菌器循環(huán)的時間和溫度的最大限制因素是，存在著培養(yǎng)基中的可溶性糖的 “焦糖化(carmelizing)”的危險-它會變成深褐色且結(jié)構(gòu)變化。這改變了糖的性質(zhì)，因而 應(yīng)該避免。Ml10毫升培養(yǎng)基體積Bellco玻璃厭氧管，20mm的嘴* 具有 Bellco blue 20mm 塞的塞子* 具有 Wheaton grey 20mm 塞的塞子
20
*來自Bellco或Wheaton的具有20mm鋁卷曲的卷曲*來自Bellco orWheaton的用〃卷曲機(jī)〃工具固定的卷曲Hungate管*管是只對于 $8/管的特定型號*塞子是綠色橡膠，漸縮的用于適配，可用于各種位置50mL的培養(yǎng)基體積血清瓶，20mm的嘴* 具有 Bellco blue 20mm 塞的塞子* 具有 Wheaton grey 20mm 塞的塞子*來自Bellco或Wheaton的具有20mm鋁卷曲的卷曲*來自Bellco或Wheaton的用〃卷曲機(jī)〃工具固定的卷曲100-200毫升培養(yǎng)基體積分刻度的250mL血清瓶，30mm的嘴* 具有 Wheaton grey 30mm 塞的塞子*來自Wheaton的具有30mm鋁卷曲的卷曲*來自Wheaton的用〃卷曲機(jī)〃工具固定的卷曲< 200毫升的培養(yǎng)基分刻度的250mL螺絲蓋培養(yǎng)基瓶體積*用EDPM凍干式黑色塞子塞住的*用塑料螺絲帽W/中心孔固定的分刻度的500mL、l升或2升螺絲蓋培養(yǎng)基瓶*用EDPM凍干式黑色塞子塞住的*用塑料螺絲帽W/中心孔固定的^MM 4. AU吝養(yǎng)基去除氧,的稈序絕氧指示劑刃天青-粉紅=有氧無色=厭氧當(dāng)培養(yǎng)基進(jìn)入高壓滅菌器時，刃天青應(yīng)該是無色的。如果是粉紅色的，容器中存在氧。但是，半胱氨酸是緩慢的還原劑，在充氣后對于100毫升的瓶去粉紅色耗時10分 鐘是不尋常的。如果當(dāng)培養(yǎng)基從高壓滅菌器出來時它仍然是粉紅色或在搖晃新從高壓滅菌器取 出的容器后變成粉紅色，則氧存在。當(dāng)充氣MBl時如果培養(yǎng)基太暗以至于不能可靠地觀察刃天青的顏色，那么準(zhǔn)備 具有等于分布的培養(yǎng)基容器體積的絕氧指示劑溶液的容器。絕氧指示劑溶液的配方如下絕氧指示劑溶液100毫升a. 100 毫升 ddH20b. 0.06克半胱氨酸d. 0.01毫升的刃天青溶液對同時具有培養(yǎng)基的絕氧指示劑溶液的容器充氣和使用清晰可見的刃天青反應(yīng) 來判斷培養(yǎng)基需氧條件。真空歧管的程序這是設(shè)計用于制備卷曲蓋管和燒瓶中的無氧環(huán)境、HPLC緩沖液的過濾、殘留底物過濾和真空干燥的多功能裝置。打開氮?dú)夤轪.檢查以觀察氮?dú)夤拚_地連接到調(diào)節(jié)器。i.如果關(guān)閉通過放松調(diào)節(jié)器前的黃銅T型閥來緩解隔膜(diaphragm)上的壓 力，然后打開氮?dú)夤揄敳康拈y門ii.用大的黑色刻度盤調(diào)整調(diào)節(jié)器壓力至3或4psiiii.調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)器側(cè)的小銅刻度盤以讓氮?dú)饬飨騈2/真空選擇閥激活冷阱和真空泵iv.移動冷阱W的頂部/浸泡冷卻器探針進(jìn)入阱桶中，打開冷卻器。v.等待10分鐘使得探針冷卻阱；你會發(fā)現(xiàn)防凍劑凍結(jié)到較低的線圈。vi.通過按冷卻器旁邊的電源板上的開關(guān)打開真空泵。b.脫氣管和燒瓶i.將22號針應(yīng)用于真空歧管的5個端口中的各個。你可以重復(fù)使用針。ii.關(guān)閉主歧管上的所有5個黑色塑料閥。不調(diào)整連接到超壓釋放閥的第六個黑 色塑料閥。iii.刺穿你的管或燒瓶的隔片iv.使用玻璃傾斜雙聯(lián)閥選擇真空功能v.打開5個黑色塑料歧管閥并將真空應(yīng)用到各個端口。vi.以300mBars或更低的壓力使管真空2分鐘，使小于500毫升的燒瓶真空2分 鐘，使500毫升以上的燒瓶真空5分鐘vii.調(diào)整玻璃選擇閥至氮?dú)?，并沖洗管，直到過壓安全閥底部的白色聚四氟乙烯 球發(fā)出丁當(dāng)聲。(大約20秒)viii.檢查以觀察液體表面停止起波紋(大約5秒鐘以上)ix.調(diào)整玻璃傾斜雙聯(lián)閥來重復(fù)真空循環(huán)χ.用氮第三次沖洗后，從隔片移除針，關(guān)閉所有5個端口，調(diào)整傾斜雙選擇器至真 空并切換到5個新的管或燒瓶。c.過濾HPLC緩沖液i.關(guān)閉主歧管上的所有5個黑色塑料閥。不調(diào)整連接到超壓釋放閥的第六個黑色 塑料閥。ii.將通過單孔塞將側(cè)臂錐形過濾燒瓶連接到大的金屬歧管。用#8塞子密封其余 端□。iii.將0.45微米過濾器放置在過濾器支架中，用夾子固定，并置于錐形燒瓶中iv.使用玻璃閥打開真空管到歧管上。v.將緩沖液倒入過濾器漏斗并重復(fù)直到溶液過濾vi.關(guān)閉到真空泵的真空管角的玻璃閥vii.用黑色刻度盤打開歧管端口，以恢復(fù)到大氣壓力viii.除去過濾的緩沖液。d.過濾殘留底物i.關(guān)閉主歧管上的所有5個黑色塑料閥。不調(diào)整連接到超壓釋放閥的第六個黑色
22塑料閥。ii.將玻璃過濾漏斗放置于歧管上的6個端口的各個中。iii.將預(yù)先稱重的0. 45微米過濾器放置于各個漏斗中iv.確保用于過濾歧管的液體阱是空的。v.將上清液倒入過濾漏斗vi.調(diào)整玻璃閥以將真空管應(yīng)用于歧管。vii.當(dāng)過濾完成時，關(guān)閉玻璃閥以阻止真空流。通過打開黑色塑料閥恢復(fù)到大氣 壓力viii.除去濾紙和殘留固體e.激活真空爐i.關(guān)閉主歧管上的所有5個黑色塑料閥。不調(diào)整連接到超壓釋放閥的第六個黑色 塑料閥。ii.將干燥爐真空管通過單孔塞連接到歧管。用#8塞子密封其余端口。iii.調(diào)整玻璃閥以將真空管應(yīng)用于干燥爐。iv.使用爐頂部的刻度盤以調(diào)節(jié)壓力。當(dāng)達(dá)到預(yù)期的壓力時密封閥。v.當(dāng)完成時，關(guān)閉玻璃閥以阻止真空流。關(guān)機(jī)f.關(guān)閉玻璃閥以阻止通過歧管的真空流。g.關(guān)閉真空泵。h.關(guān)閉冷卻器。i.通過調(diào)節(jié)器側(cè)面的小銅刻度盤關(guān)閉氮?dú)饬?。你可以使罐開放。i.通過打開歧管前面的黑色塑料閥使歧管恢復(fù)到大氣壓力。HunRate 程序打開 Hungatea.滑動玻璃管，使得所有的銅在加熱單元之內(nèi)。b.通過向下翻轉(zhuǎn)開關(guān)打開變阻器至120伏特上面的刻度盤調(diào)節(jié)熱_ 一旦調(diào)整， 不要動！c.打開氮?dú)鈏.垂直于顯示器的大旋鈕應(yīng)該是松的ii.打開罐上的主閥iii.大旋鈕擰緊，直到左側(cè)的刻度盤中的針移動。它不是必須移動許多。該旋鈕 調(diào)節(jié)隔膜片上的彈簧，其調(diào)節(jié)流量；它們可能通過壓力的突然變化損壞，這就是在打開罐時 為什么它應(yīng)該松的原因。iv.通過使用調(diào)節(jié)器上的小的側(cè)面旋鈕(連接顯示器)調(diào)節(jié)流量。允許小流量只 通過一個端口，直到預(yù)備好為培養(yǎng)基加氣；這確保了氮?dú)庀鄬τ诖髿獾恼蛄鲃?。d.使用Hungate前，允許用空氣流加熱銅(copper) 40分鐘。使用Hungate以使培養(yǎng)基除氣(gas out)a.轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基至燒瓶，并在微波爐中或加熱板上加熱至沸騰_不要煮沸溢出。b.將燒瓶放置在Himgate儀器附近的加熱的攪拌板上。保持燒瓶恰低于沸騰下加熱，并用來自Himgate的氮?dú)鉀_洗直到培養(yǎng)基去粉紅色。分配的同時繼續(xù)沖洗和加熱。c.將培養(yǎng)基分配到容器，各用氮?dú)鉀_洗。輕輕地將塞子置于沖洗套管上。*在分配過程中培養(yǎng)基變?yōu)槲⒎奂t色沖洗直到去粉紅色，同時在冰浴中冷卻至 略低于室溫。*d.取出套管，同時保持塞子向下，以最小化大氣污染。e.將管架放置于管架壓力機(jī)中。固定用于其他容器的塞子。如對于容器和總體積 (如上所述)適宜地進(jìn)行高壓滅菌。關(guān)閉 Hungatea.除了 一個之外，所有端口應(yīng)關(guān)閉，通過該端口具有非常小的流量。b.關(guān)閉變阻器開關(guān)應(yīng)在中間位置(最多=140伏)。c.滑動玻璃管，使得所有的銅在加熱元件之外。d.關(guān)閉氮?dú)馇笆沟勉~冷卻15-20分鐘(直到徒手觸摸舒適)。e.關(guān)閉氮?dú)鈏.關(guān)閉主罐閥ii.等待兩個刻度盤指針靜止于零。iii.當(dāng)兩個表盤讀數(shù)為零時，通過逆時針轉(zhuǎn)動大的旋鈕直至變松以釋放隔膜片調(diào) 節(jié)器實(shí)施例 5.發(fā)酵條件-C. phytofermentans溫度35°C或30°Ca. 35°促進(jìn)生長，并用于可溶性底物b. 30°用于不溶性底物Sft 試管培養(yǎng)在沒有攪拌的情況下靜態(tài)生長。培養(yǎng)物可以靜態(tài)地或以不同的攪拌速度在燒瓶中生長。如果底物是不溶性的(即 Avicel)那么攪拌是有用的，且可獲得的底物表面積可能是限制因素。調(diào)整攪拌速度以保持 底物懸浮，且這根據(jù)底物的類型和底物濃度變化。pH 倌7. 50 (見培養(yǎng)基 SOP)C. phytofermentans可以在6. 5-8. 5的pH值下生長，最好在較高的中間范圍內(nèi)。^M 0. 3%纖維二糖-維持接種物的標(biāo)準(zhǔn)物高于2. 5%可能會導(dǎo)致抑制。一些人證明了依賴葡萄糖的生長抑制纖維素酶產(chǎn)生，這種抑制在轉(zhuǎn)移到纖維素前 向纖維二糖的中間轉(zhuǎn)移是可逆的。轉(zhuǎn)移條件通常情況下，C. phytofermentans的工作原液作為含0. 3%纖維二糖的GS-2或MBl 培養(yǎng)基中活躍生長的植物性培養(yǎng)而保持。使用用于試管中繁殖的2%接種體積，將培養(yǎng)轉(zhuǎn) 移生長的中對數(shù)期(見下文)。通常使用10%接種體積接種生物反應(yīng)器?？梢哉{(diào)整接種體 積，以實(shí)現(xiàn)需要支持實(shí)驗(yàn)要求的時間的中對數(shù)期生長。通過測量660nm波長處的OD可以確 定C. phytofermentans的生長(圖2)。中對數(shù)的OD為底物依賴的a. 0. 3%底物0D 660nm處轉(zhuǎn)移0. 500-0. 700吸光度單位，底物是限制的，且培養(yǎng) 物在0. 700吸光度單位后不久進(jìn)入靜態(tài)生長
b. 1% +底物0D處轉(zhuǎn)移0. 500-0. 700吸光度單位實(shí)施例6.冷凍C. phytofermentans原液的制備為了制備C. phytofermentans的冷凍原液，制備中對數(shù)期培養(yǎng)，加入等體積的無 菌甘油(30%原液)，并放于-80°C冰箱內(nèi)。這些冷凍原液可以無限期儲存。為了使冷凍原 液恢復(fù)活性，在冰上解凍原液，而且將培養(yǎng)物挑染到適當(dāng)?shù)沫傊迳匣蛘?%的接種體用于 液體培養(yǎng)基中，通常在試管中。如果將培養(yǎng)物挑染到瓊脂板上，那么在30°C的3至5天的無 氧接種可取得良好的生長。無菌接種環(huán)用于將單一菌落轉(zhuǎn)移到微離心管中的1毫升無菌培 養(yǎng)基(GS-2或MB 1)中，并攪拌以產(chǎn)生細(xì)菌細(xì)胞的懸浮液。無菌注射器用于吸取細(xì)菌懸浮 液，并將它接種到密封的絕氧試管中。如果將解凍的培養(yǎng)物直接加入到試管中，則無菌注射 器用于吸取適當(dāng)體積(2%的接種體積是典型的)的微生物細(xì)胞懸浮液，并通過含GS-2或 MB-I培養(yǎng)基的密封無氧試管的隔膜注射它。所有這些操作都在絕氧手套箱中進(jìn)行的。使冷 凍培養(yǎng)恢復(fù)活性后，在作為營養(yǎng)工作原液使用之前，允許至少2次分培養(yǎng)事件。這使得冷凍 的原液適應(yīng)在液體培養(yǎng)中生長并產(chǎn)生可靠的生長動力學(xué)。實(shí)施例7.糖和乙醇分析產(chǎn)物形成和剩余底物濃度的數(shù)據(jù)來自HPLC分析。1)無氧地對培養(yǎng)物采樣優(yōu)選22號針用于通過塞子無氧取樣。遵循以下步驟a.將無氧氣體吸入注射器，并排空注射器至少兩次b.吸保持等于樣品體積的量的無氧氣體進(jìn)入注射器c.將無氧氣體注入容器中d.采取樣品(通常1至1. 5毫升)2)將樣品放置于微量離心機(jī)并以12000rpm離心10分鐘。3)上清液用0. 45微米注射器過濾器過濾進(jìn)入HPLC取樣瓶的(可以使用插入物)。4)使用在55 °C下運(yùn)行的Aminex HPX-87H柱用0. 005mM的硫酸流動相，通過高壓液 相色譜進(jìn)行樣品分析。也可以用在樣的柱上或使用水流動相在80°C下的Aminex HPX-87P 柱，對纖維二糖的濃度進(jìn)行定量。實(shí)施例8.對于培養(yǎng)物污染的評估可以以各種方法檢測污染。例如a.通過在顯微鏡下觀察樣品。如果看到除了 C. phytofermentans之外的其他任何 東西，則樣本被污染。b.通過監(jiān)測培養(yǎng)物的pH值，如果pH值低于6. 8，則懷疑受到污染。c. HPLC數(shù)據(jù)有時可以表明更常見的污染物中的一種如果檢測到非常大量的乳 酸，則培養(yǎng)物被污染。d.可以將培養(yǎng)物的樣品挑染到瓊脂板上(參見，用于瓊脂培養(yǎng)基的S0P，以得到對 于C. phytofermentans選擇性的瓊脂或其他瓊脂的配方)。如果形態(tài)明顯不同的菌落在畫 線路徑上生長，則培養(yǎng)污染?？梢杂糜诒疚乃龅膶?shí)施例中的試劑的例子和訂購詳情如下表所述。厭氧管 藍(lán)色20mm塞子 灰色20mm塞子 20mm iaJ^^j
20mm卷縮機(jī)
血清瓶
Hungate管w/塞子 Hungate壓熱鍋
分刻度的250mL血清瓶 灰色30mm塞子
訂購詳情 Bellco 2048-00150 Bellco 2048-11800 VWR 16171-650
Bellco 2048-11020/VWR 16171-829 或 VWR 16171-851
(撕開)
Bellco 2048-10020/VWR HP9301-07
VWR 16171-385
特殊訂貨項(xiàng)目 特殊訂貨項(xiàng)目
30mm 的嘴VWR 16171-420
VWR 16171-630
2630mm鋁卷曲 30mm卷縮機(jī)
250mL螺絲蓋培養(yǎng)基瓶
黑色橡膠EDPM塞子 用于W/注射器的帽W/孔
VWR 16171-862 VWR 26676-406
VWR 89000-236 (具有這種可用的類型開口的其他大, 的瓶)
VWR 16171-620 VWR 16149-145
K2HPO4
KH2PO4
(NH4)2SO4
水合鹽酸半胱氨酸
Amberex酵母提取物
D-(+)-纖維二糖
D-葡萄糖，無水
尿素
MOPS
二水合檸檬酸三鈉 Bacto酵母提取物 刃天青 LB培養(yǎng)肉湯 Bacto-瓊脂 MgCl2MH2O CaCl2*2H20 FeS04*7H20
Sigma-Aldrich P3 786 Sigma-Aldrich P5379 Sigma-Aldrich A2939 Sigma-Aldrich C7880 Sensient 695AG MP Biomedicals 101298 Mallinckrodt Chemicals 4912-12 Sigma-Aldrich Ul250 Sigma-Aldrich M1252 Sigma-Aldrich S4641 BD 212750 Sigma-Aldrich R7017 VWR 900003-118 Difco 0140-01 Sigma-Aldrich M2670 Sigma-Aldrich 223506
Sigma-Aldrich 215422 雖然本文已經(jīng)顯示和描述了本發(fā)明的優(yōu)選方式，對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員顯而易見 的是，提供這樣的實(shí)施方式只是為了舉例。在不背離本發(fā)明的情況下，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可 以想到許多變化、改變和替換。應(yīng)該理解，在實(shí)踐本發(fā)明時，可以使用本文所述的本發(fā)明的 實(shí)施方式的各種替代方案。意味著下列權(quán)利要求定義本發(fā)明的范圍，因此這些權(quán)利要求范 圍內(nèi)的方法和結(jié)構(gòu)及其等價物由本發(fā)明覆蓋。
權(quán)利要求
一種用于產(chǎn)生乙醇和其他化學(xué)產(chǎn)品的方法，包括提供包含植物多糖的預(yù)處理的源自生物質(zhì)的材料；在氧的存在下，用包含纖維素水解性需氧微生物的第一培養(yǎng)物接種所述的預(yù)處理的源自生物質(zhì)的材料，以產(chǎn)生需氧培養(yǎng)液，其中，所述需氧微生物能夠至少部分地水解植物多糖；孵育所述需氧培養(yǎng)液直到所述纖維素水解性需氧微生物消耗至少一部分氧和水解至少一部分植物多糖，從而將需氧培養(yǎng)液轉(zhuǎn)化成包含具有可發(fā)酵糖的水解產(chǎn)物的厭氧培養(yǎng)液；用包含能夠?qū)⒖砂l(fā)酵糖轉(zhuǎn)化成為乙醇和其他化學(xué)產(chǎn)品的厭氧微生物的第二培養(yǎng)物接種所述厭氧培養(yǎng)液；和發(fā)酵接種的厭氧培養(yǎng)液，直到可發(fā)酵糖的至少一部分被轉(zhuǎn)化成乙醇和其他化學(xué)產(chǎn)品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中，從發(fā)酵的厭氧培養(yǎng)液回收至少一部分乙醇。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，進(jìn)一步包括溶解發(fā)酵的厭氧培養(yǎng)液中的需氧和厭氧微 生物，以產(chǎn)生包含剩余的可發(fā)酵糖和細(xì)胞內(nèi)容物的溶解產(chǎn)物。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，進(jìn)一步包括對所述溶解產(chǎn)物進(jìn)行另外的物理和/或化學(xué)處理。
5.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，進(jìn)一步包括用能夠加快剩余的可發(fā)酵糖轉(zhuǎn)化為乙醇和其他 化學(xué)產(chǎn)品的另一種微生物和/或酶混合物接種所述溶解產(chǎn)物。
6.一種用于制造適合作為燃料的材料的方法，包括 提供包含多糖的源自植物的材料；用包含纖維素水解性需氧微生物的第一培養(yǎng)物接種所述源自植物的材料，以產(chǎn)生需氧 培養(yǎng)液，其中，所述需氧微生物能夠至少地部分水解多糖；在氧的存在下，孵育所述培養(yǎng)液，使得多糖的至少一部分水解成為一種或多種糖類物質(zhì)；在一定條件下孵育所述培養(yǎng)液以降低氧濃度，從而將所述培養(yǎng)液轉(zhuǎn)化為厭氧培養(yǎng)液； 用包含能夠?qū)⑺龅囊环N或多種糖類物質(zhì)轉(zhuǎn)化成適合作為燃料的材料的厭氧微生物 的第二培養(yǎng)物接種所述厭氧培養(yǎng)液；發(fā)酵接種的厭氧培養(yǎng)液，以產(chǎn)生適合作為燃料的材料。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中，從發(fā)酵的厭氧培養(yǎng)液回收至少一部分適合作為燃料 的材料。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7的方法，進(jìn)一步包括溶解發(fā)酵的厭氧培養(yǎng)液中的需氧和厭氧微 生物，以產(chǎn)生包含細(xì)胞內(nèi)糖和細(xì)胞內(nèi)容物的溶解產(chǎn)物。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，進(jìn)一步包括對所述溶解產(chǎn)物進(jìn)行另外的物理和/或化學(xué)處理。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，進(jìn)一步包括用另一種微生物接種所述溶解產(chǎn)物。
11.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中，所述源自植物的材料在用纖維素水解性需氧微生物 接種之前進(jìn)行預(yù)處理。
12.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中，所述適合作為燃料的材料包括乙醇。
13.一種制造乙醇和其他化學(xué)產(chǎn)品的方法，包括2提供包含植物多糖的源自生物質(zhì)的材料；在厭氧條件下，用包含Clostridium phytofermentans細(xì)胞的第一培養(yǎng)物接種所述源 自生物質(zhì)的材料，以水解植物多糖的至少一部分，其中，所述培養(yǎng)物的細(xì)胞吸收水解的植物 多糖的至少一部分作為細(xì)胞內(nèi)化合物；溶解Clostridium phytofermentans細(xì)胞以產(chǎn)生溶解的培養(yǎng)液； 用包含能夠?qū)⒖砂l(fā)酵糖轉(zhuǎn)化為乙醇和/或其他化學(xué)產(chǎn)品的厭氧微生物的第二培養(yǎng)物 接種所述溶解的培養(yǎng)液；和發(fā)酵接種的厭氧培養(yǎng)液，直到可發(fā)酵糖的至少一部分被轉(zhuǎn)化成乙醇和/或其他化學(xué)產(chǎn)PΡΠ O
14.一種生產(chǎn)生物燃料的方法，包括如下步驟在厭氧條件下在封閉的容器中提供生物質(zhì)材料，其中，所述生物質(zhì)沒有用外源供給的 化學(xué)產(chǎn)品或酶進(jìn)行處理；用非遺傳修飾的厭氧細(xì)菌的第一培養(yǎng)物處理所述生物質(zhì)，其中，所述非遺傳修飾的厭 氧細(xì)菌將生物質(zhì)的至少一部分轉(zhuǎn)化為單糖和二糖；和用非專性需氧的微生物的第二培養(yǎng)物處理所述生物質(zhì)，其中，所述單糖和二糖轉(zhuǎn)化為 生物燃料。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中，所述非遺傳修飾的細(xì)菌的第一培養(yǎng)物是 Clostridium phytofermentans0
16.根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中，所述微生物的第二培養(yǎng)物選自釀酒酵母、運(yùn)動發(fā)酵 單胞菌、丙酮丁醇梭菌、C. phytofermentans、熱纖梭菌、食纖維梭菌。
17.根據(jù)權(quán)利要求14的方法，進(jìn)一步包括溶解發(fā)酵的厭氧培養(yǎng)液中的需氧微生物，以 產(chǎn)生包含剩余的可發(fā)酵糖和細(xì)胞內(nèi)容物的溶解產(chǎn)物。
18.根據(jù)權(quán)利要求17的方法，進(jìn)一步包括對所述溶解產(chǎn)物進(jìn)行另外的物理和/或化學(xué) 處理。
19.根據(jù)權(quán)利要求14的方法，進(jìn)一步包括從殘留的生物質(zhì)和培養(yǎng)基分離和回收轉(zhuǎn)化的 生物燃料。
20.根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中，所述生物質(zhì)包括含纖維素和半纖維素的材料。
21.根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中，所述生物質(zhì)包括木質(zhì)素。
22.根據(jù)權(quán)利要求22的方法，進(jìn)一步包括將所述生物質(zhì)與具有足以水解含木質(zhì)素的生 物質(zhì)的至少一部分的濃度的堿性水溶液接觸，并中和處理的生物質(zhì)至7-8的pH。
23.一種生產(chǎn)生物燃料的方法，該方法包括在中溫條件下，在Clostridium phytofermentans和選自丙酮丁醇梭菌、熱纖梭菌和食纖維梭菌的第二種梭菌屬細(xì) 菌的共培養(yǎng)物存在下，使包括含纖維素和半纖維素的植物材料的生物質(zhì)進(jìn)行發(fā)酵，所 述培養(yǎng)物的比例為使得纖維素乙醇和半纖維素乙醇的轉(zhuǎn)化率高于通過單獨(dú)使用 Clostridiumphytofermentans或所述第二種梭菌屬細(xì)菌獲得的轉(zhuǎn)化率的量。
全文摘要
本發(fā)明公開了將復(fù)雜的植物多糖(包括纖維素材料)轉(zhuǎn)化為燃料和其他化學(xué)產(chǎn)品的方法。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，該方法包括通過兩種或多種微生物順序水解植物多糖。
文檔編號C12R1/145GK101981199SQ200980110745
公開日2011年2月23日 申請日期2009年2月27日 優(yōu)先權(quán)日2008年2月27日
發(fā)明者J·基爾貝恩, W·G·拉圖夫 申請人:奎特羅斯公司