專利名稱：由內(nèi)源性攜帶氨基的單體形成的聚陽離子基因載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明證實(shí)了可降解為內(nèi)源性單體的聚陽離子基因(和RNA)載體的合成和組裝 方法及設(shè)計(jì)理念。
背景技術(shù)：
現(xiàn)在足夠的證據(jù)表明給定序列的核苷酸可以通過開啟(表達(dá))或是關(guān)閉(沉默) 特定基因而作為治療劑用于藥物治療，免疫治療和組織再生治療[1]。而要達(dá)到治療目的，治 療基因，DNA疫苗和siRNA藥物能夠輸送到靶細(xì)胞的細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)中是必要條件。在眾 多的輸送多核苷酸的載體體系中，與病毒載體相比，合成輸送系統(tǒng)具有一系列優(yōu)點(diǎn)，如無免 疫源性和病毒突變，通過單一機(jī)制包封多個(gè)基因或siRNA的能力，以及能夠簡單而低成本 地制備β]。為了使用非病毒系統(tǒng)將基因物質(zhì)(DNA和RNA)有效地靶向輸送到細(xì)胞間隙或細(xì) 胞內(nèi)的位點(diǎn)，合成基因載體(即非病毒載體)應(yīng)具有類似病毒載體的一系列功能包裹和凝 聚基因物質(zhì)，靶向和進(jìn)入細(xì)胞，內(nèi)吞逃逸，以及在細(xì)胞質(zhì)釋放基因物質(zhì)。如果其中任何功能 缺乏，相應(yīng)的步驟將成為整個(gè)基因轉(zhuǎn)染中的限速屏障。另外，合成的基因載體本身必須是無 毒、生物相容的并能夠代謝的。但是，到目前為止沒有一種合成基因遞送系統(tǒng)能夠滿足上述 所有條件。在過去的幾十年所報(bào)道的合成基因遞送載體一般可以分為幾類基于陽離子脂質(zhì) 體的系統(tǒng)(稱作lipolex)，基于聚陽離子的系統(tǒng)(稱作polyplex)，基于脂質(zhì)體-聚陽離子 兩者組合的系統(tǒng)(稱作lipopolyplex)，和無電荷納米顆粒。其中l(wèi)ipolex和polyplex報(bào) 道的最多，這是由于DNA和RNA帶負(fù)電荷，基因物質(zhì)可以容易與帶正電荷的脂質(zhì)體或聚合 物復(fù)合成顆粒。針對(duì)基因轉(zhuǎn)染的每個(gè)環(huán)節(jié)，這兩種載體各有優(yōu)點(diǎn)和機(jī)制。陽離子脂質(zhì)體凝 聚基因物質(zhì)的密度不如陽離子聚合物[3]，但有更好的與內(nèi)吞體的膜融合的功能，從而幫助 DNA或RNA以分子形式逃逸到細(xì)胞質(zhì)中⑷。另外，聚陽離子(陽離子聚合物)可以以更緊 密的形式凝聚基因物質(zhì)，從而起到保護(hù)基因和擔(dān)載基因的功能[5]。在內(nèi)吞逃逸機(jī)理上， polyplex被認(rèn)為是通過“質(zhì)子海綿”作用，即吞噬了 polyplex的內(nèi)吞體被富集的氯離子撐 破，而所述氯離子是由于連續(xù)泵入HCl以補(bǔ)償陽離子聚合物載體消耗的質(zhì)子而累積的。但 是，吸收了質(zhì)子的聚陽離子(由于增加的正電荷)可以在polyplex內(nèi)更緊密的凝聚DNA或 RNA，從而使得基因物質(zhì)以顆粒的形式而不是分子形式進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中。看起來聚陽離子凝聚 和釋放DNA或RNA是個(gè)相互矛盾的過程，這就需要聚陽離子載體系統(tǒng)具備多方面的功能。為了同時(shí)兼顧包封以及在細(xì)胞質(zhì)釋放基因的能力，一些研究者認(rèn)為應(yīng)該使用或設(shè) 計(jì)與基因物質(zhì)有較弱的復(fù)合強(qiáng)度的聚陽離子載體[6]。使用低分子量的陽離子聚合物或是低氨基密度的陽離子聚合物都是方法之一 [7]。另外一個(gè)策略就是使用環(huán)境敏感的聚陽離子以 實(shí)現(xiàn)基因的凝聚和釋放[8]。但是，這類型的高分子通常在結(jié)構(gòu)復(fù)雜、載體系統(tǒng)的體內(nèi)代謝多 樣。使用可降解的陽離子聚合物作為基因載體是個(gè)更為明智的方法，因?yàn)榭梢酝ㄟ^載體骨 架的降解而非減弱DNA或RNA的復(fù)合能力來實(shí)現(xiàn)基因的釋放氣另外，降解為小分子的過 程也可以降低聚陽離子的化學(xué)毒性。文獻(xiàn)報(bào)道過的可生物降解的連接結(jié)構(gòu)，如羧酸酯，磷酸 酯，亞胺和二硫結(jié)構(gòu)均被結(jié)合到陽離子聚合物的骨架中。在這方面，酯鍵是用的最多的可降 解結(jié)構(gòu)，其在到聚陽離子骨架中可平衡穩(wěn)定性和可降解性。但是，酯鍵與親核試劑如伯氨基 和仲氨基團(tuán)容易發(fā)生反應(yīng)性[1°]，它們是基因復(fù)合及質(zhì)子海綿作用的關(guān)鍵官能團(tuán)。為了防止酯鍵與氨基的反應(yīng)，到目前為止的研究中有兩種策略，合成只有叔氨基 基團(tuán)的陽離子聚合物或使用二硫鍵結(jié)構(gòu)形成可降解的高分子骨架[11_13]。例如有些研究者通 過攜帶酯的連接劑聚合支化的小分子聚乙烯亞胺(PEI)，并且交聯(lián)的小分子PEI載體具有 更高的基因轉(zhuǎn)染效率和更小毒性[13]。這種高分子骨架的降解通過連接鍵的斷裂來實(shí)現(xiàn)，從 而降解后小分子PEI或是其它帶有氨基的單體(聚合物構(gòu)建單元)帶有連接劑的片段[11’ 12]。這種骨架降解模式對(duì)于由人工合成的帶有氨基的結(jié)構(gòu)單元形成的聚陽離子基因載體是 可取的。對(duì)于由內(nèi)源性的帶有氨基的單體形成的可降解陽離子聚合物，連接劑片段殘留在 聚合物降解產(chǎn)生的單體上將會(huì)消除使用內(nèi)源性單體的意義。聚陽離子基因載體能降解為人 體內(nèi)源性的帶有氨基的單體對(duì)于實(shí)現(xiàn)基因物質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的釋放和載體的自身代謝消除是 一個(gè)理想的設(shè)計(jì)。本發(fā)明的首要目的是研究開發(fā)具有足夠數(shù)量氨基以凝聚基因物質(zhì)形成緊湊顆粒 并通過質(zhì)子海綿作用誘導(dǎo)內(nèi)體逃逸，并且具有完全可降解骨架以在內(nèi)體逃逸后釋放基因并 且自身轉(zhuǎn)化為內(nèi)源性的或無毒單體的聚陽離子基因載體。發(fā)明概述如上所述，用于臨床的輸送系統(tǒng)應(yīng)能夠?qū)⑺x擇的DNA或RNA(—種或多種類型) 包裹為足夠密度的納米顆粒，將該攜帶基因的納米粒子靶向致病細(xì)胞，將基因物質(zhì)輸送并 釋放到細(xì)胞胞質(zhì)，最后實(shí)現(xiàn)自身為無毒化代謝。從實(shí)際應(yīng)用考慮，這一系統(tǒng)最好是結(jié)構(gòu)簡 單，容易制備和合成，儲(chǔ)存穩(wěn)定，易于運(yùn)輸和臨床操作。以上生物學(xué)特點(diǎn)可以翻譯為合成聚 陽離子載體的一系列化學(xué)性質(zhì)，包括有足夠的正電荷以包裹帶負(fù)電荷的DNA或RNA，易于結(jié) 合致病細(xì)胞的靶向基團(tuán)，攜帶足夠量的低pKa(< 8)氨基基團(tuán)作為質(zhì)子海綿庫，并且可降解 為無毒單體(最好是內(nèi)源性的)單體，以實(shí)現(xiàn)基因物質(zhì)的細(xì)胞內(nèi)釋放和載體本身的代謝消 除。本發(fā)明公開了聚陽離子化學(xué)結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì)，所述聚陽離子由帶有足夠氨基的內(nèi)源性 單體是通過用連接分子或它們本身形成可降解鍵聚合而成。所述攜帶氨基的單體是自然存 在或是對(duì)人體無毒的單體。連接分子在降解時(shí)，不僅可降解為無毒小分子，而且能夠以其天 然態(tài)釋放出帶有氨基的單體。一些內(nèi)源性的帶有氨基的單體實(shí)例為精胺，亞精胺，絲氨酸或 N，N-二甲基絲氨酸，組氨酸和丙胺酸。氨基基團(tuán)之間形成的可降解化學(xué)鍵的實(shí)例為氨基甲 酸酯鍵，亞胺鍵，酰胺鍵，碳酸酯鍵和酯鍵。為了改善降解性和質(zhì)子海綿效應(yīng)，低pKa( < 8) 的氨基基團(tuán)和其它給電子基團(tuán)被結(jié)合到用于連接帶有氨基的單體的兩個(gè)(或三個(gè))反應(yīng)性 基團(tuán)之間的鏈中。


圖1.帶有氨基的單體和連接分子通過氨酯鍵聚合的聚陽離子(Polylink-SP)。A 基于精胺的聚合物；B 基于亞精胺的聚合物。連接分子可以與精胺或亞精胺的任何氨基形 成氨酯鍵。圖2.帶有氨基的單體和連接分子通過氨酯鍵聚合的聚陽離子(Polylink-SP)。所 述氨酯鍵是在連接分子和精胺的二級(jí)氨基(所述精胺的兩個(gè)一級(jí)氨基被保護(hù))之間形成 的。A 聚精胺氨酯，由一級(jí)氨基保護(hù)的精胺與1，4_ 丁二醇氯甲酸酯縮合后脫保護(hù)而成；B 聚精胺氨酯，由一級(jí)氨基保護(hù)的精胺與乙二醇氯甲酸酯縮合后脫保護(hù)而成。圖3.精胺和琥珀酰氯縮合形成的聚精胺酰胺(聚酰胺-SP)。圖4.精胺和乙二酰氯縮合形成的聚精胺氨基甲酸酯。A)端基與膽固醇接枝 (Cho-Polylink-SP)和 B 端基與 PEG 接枝(PEG-Polylink-SP)。圖5.精胺和活化的組氨酸琥珀酸連接劑縮合形成的聚精胺酰胺(聚組氨酸-SP)。圖6.精胺和二醛連接劑縮合(邁克爾加成)而成的聚精胺亞胺(聚亞胺-SP)。 A.聚合有乙二醛連接劑的聚精胺亞胺；B.聚合有戊二醛的聚精胺亞胺。圖7.聚偽絲氨酸的合成，其中R1和&為甲基，R’為聚乙二醇，靶向基團(tuán)或者疏水基團(tuán)。圖8.精胺和結(jié)構(gòu)中帶有咪唑基團(tuán)的二氯甲酸酯連接劑縮合聚合而成的聚精胺氨酯。圖9. Polylink-SP在37°C，在HEPS緩沖溶液(pH = 7)孵育下不同天數(shù)的分子量 和形態(tài)變化。A)Polylink SP孵育0，5，7天的分子量變化的CPC-HPLC圖。B)Polylink SP 樣品在孵育和凍干之后的形態(tài)。圖10.不同的高分子/DNA比的polyplexde電泳和Zeta電位測量。A)GFP DNA與 Polylink SP混合后的電泳圖；B)GFP DNA和Polylink SP形成的Polyplex的Zeta電勢 圖。圖11. Polylink SP和GFP質(zhì)粒形成的polyplex的粒徑圖。A)在鹽水中B)在純 水中。圖12.對(duì)熒光素酶基因的轉(zhuǎn)染活性。A.聚精胺氨酯；B :PEG-聚精胺氨酯。圖 13.經(jīng) Polylink SP，PEG 化的 Polylink SP 和 PEI_25KDa 處理的 C0S-7 細(xì)胞的
存活率。圖14. C0S-7細(xì)胞的顯微鏡圖像綠熒光點(diǎn)具有熒光標(biāo)記的polyplexes ；深藍(lán)色 斑點(diǎn)C0S-7細(xì)胞的核。圖15.脂質(zhì)雙層膜在基于精胺或基于絲氨酸的陽離子聚合物形成的polyplex表 面通過疏水接枝基團(tuán)的組裝。發(fā)明詳述有效的基因輸送有賴于輸送系統(tǒng)完成一系列的生物學(xué)功能，包括將基因凝聚成緊 湊的粒子，將基因輸送到靶細(xì)胞，幫助基因逃逸內(nèi)吞降解，將基因釋放到細(xì)胞質(zhì)中，自身降 解為對(duì)身體無毒的單體并且能夠從體內(nèi)消除。要滿足這樣的要求，合成基因輸送系統(tǒng)應(yīng)在 結(jié)構(gòu)上帶有產(chǎn)生上述生物學(xué)功能的相應(yīng)的官能團(tuán)。從制備過程和毒性研究的簡捷計(jì)，合成 基因載體的結(jié)構(gòu)簡單是重要的，這就要求一個(gè)化學(xué)官能團(tuán)最好能夠完成多項(xiàng)生物學(xué)功能。
6比如，最好具有充足的氨基數(shù)量，氨基具有理想的Pka值，能夠?qū)⒒蚰劭s合成納米級(jí)的 粒子，并且在內(nèi)吞體中能夠發(fā)揮質(zhì)子海綿作用以實(shí)現(xiàn)內(nèi)吞逃逸，并且不會(huì)在載體與核酸復(fù) 合納米顆粒(polyplex)表面產(chǎn)生過多的表面電荷，以利于體內(nèi)循環(huán)和細(xì)胞靶向。載體骨架 應(yīng)以合適的速率降解，以在基因轉(zhuǎn)染中將其包裹的基因釋放到細(xì)胞質(zhì)，緩解聚陽離子引起 的細(xì)胞毒性的問題，并且產(chǎn)生游離氨基以利于內(nèi)吞體逃逸。載體還應(yīng)有一個(gè)功能基團(tuán)，以便 于同其他功能分子接枝，以實(shí)現(xiàn)polyplex的細(xì)胞間靶向和體內(nèi)長循環(huán)時(shí)間，以及促進(jìn)脂質(zhì) 雙層膜的附著。本發(fā)明旨在通過化學(xué)設(shè)計(jì)造就這樣一個(gè)基于生物學(xué)功能的輸送系統(tǒng)。本發(fā)明中的聚陽離子基因輸送載體分別采用了精胺和N，N-二甲基絲氨酸兩種人 體內(nèi)源性的具有多個(gè)氨基的單體作為基本構(gòu)建單元聚合而成。其中一種聚陽離子聚合物是 通過精胺與連接分子之間形成可降解的化學(xué)鍵而形成的。可降解鍵可以是氨酯鍵、酰胺鍵 和碳氮雙鍵。對(duì)于聚氨酯、聚酰胺的合成，精胺的兩個(gè)伯胺基在分別與二氯甲酸酯或琥珀酰 氯反應(yīng)之前要被保護(hù)，以得到更好的線性的聚合物。而聚亞胺的合成則由精胺的伯胺基和 連接物的醛羰基選擇性地反應(yīng)生成碳氮雙鍵。含氨酯鍵的聚精胺和含酰胺鍵的聚精胺的一個(gè)問題就是氨酯鍵和酰胺的連接降 解速率太慢，不足以在細(xì)胞中及時(shí)釋放基因和分子態(tài)精胺。體內(nèi)聚陽離子存留過長的時(shí)間 被認(rèn)為是產(chǎn)生毒性的來源。為了加速含氨酯鍵的聚精胺和含酰胺鍵的聚精胺的降解速度， 連接分子內(nèi)需要一個(gè)供電子的基團(tuán)(例如咪唑基或者組氨酸)。為了得到更快的降解速度， 基因與含氨酯鍵的聚精胺或者含酰胺鍵的聚精胺形成的polyplex復(fù)合物應(yīng)有低PKa值的 咪唑基團(tuán)和組氨基團(tuán)，這樣polyplex復(fù)合物中氨基總數(shù)不變但正電荷低，更有利于質(zhì)子海 綿作用。含有組氨酸基團(tuán)的聚精胺酰胺和含有咪唑基團(tuán)的聚精胺氨酯的結(jié)構(gòu)分別顯示在圖 5禾口 8中。碳氮雙鍵聚合的聚精胺亞胺剛好反過來，其穩(wěn)定性成為問題。為了提高含碳氮雙 鍵的聚精胺的穩(wěn)定性，用乙二醛作為連接基團(tuán)聚合精胺。聚精胺乙烯亞胺的分子結(jié)構(gòu)示于 圖6中。由于兩個(gè)-C = N-能夠形成耦合的共軛π鍵，因此能夠穩(wěn)定連接的亞胺鍵。作為反應(yīng)路線，二氯甲酸酯、或者二溴甲酸酯或者聚甲醛或者乙二醛，被滴入人體 內(nèi)源性的多氨基分子的溶液中，使之聚合。聚合物的分子量可以通過控制含有氨基鍵的物 質(zhì)與連接分子之間的摩爾比率來控制，或者通過選擇溶劑來實(shí)現(xiàn)。與核酸物質(zhì)形成polyplex組裝復(fù)合物的另一種陽離子聚合物是聚偽N，N- 二甲 基絲氨酸。圖7顯示了這種聚陽離子的分子結(jié)構(gòu)和合成路線。除了以上關(guān)于降解性和穩(wěn)定 性的考慮外，聚偽N，N- 二甲基絲氨酸除了更好的降解性和合理的穩(wěn)定性的一個(gè)特點(diǎn)是其 是它的合成途徑。N，N-二甲基絲氨酸先脫水通過Mitsimobnu反應(yīng)形成內(nèi)酯。然后四元環(huán) 內(nèi)酯通過親核聚合引發(fā)劑不斷開環(huán)形成聚合物。因?yàn)檫@個(gè)四元環(huán)內(nèi)酯發(fā)生陰離子開環(huán)聚合 反應(yīng)的活性很高(形成酯鍵)，幾乎任何化學(xué)結(jié)構(gòu)(脂肪酸，膽固醇，PEG或者靶向基團(tuán)部 分)，只要鏈接一個(gè)羧基，便可作為聚合反應(yīng)的引發(fā)劑很容易地連接在聚偽N，N- 二甲基絲 氨酸的一端。聚陽離子端基的接枝將有利于所形成的擔(dān)載DNA或者RNA的載體polyplex 將靶向基團(tuán)暴露在表面。選擇脂肪酸或者膽固醇作為聚合引發(fā)劑，是為了形成的polyplex 具有疏水表面錨區(qū)，用于附著脂質(zhì)雙層。據(jù)報(bào)道疏水表面錨區(qū)能夠誘發(fā)微粒周圍形成脂質(zhì) 雙層[14]。連接在polyplex復(fù)合物表面的疏水鍵能夠誘發(fā)自身重組，在微粒表面形成脂質(zhì) 雙層，從而形成lipolyplex，比前面介紹的通過離子吸附形成的lipoplex更穩(wěn)定(參見圖15)。聚偽N，N- 二甲基絲氨酸有一個(gè)聚酯的主鏈，所以與含氨酯鍵的聚精胺，含酰胺鍵 的聚精胺和含碳氮雙鍵的聚精胺相比，有更為平衡的可降解性/穩(wěn)定性。由于絲氨酸的羧 基被酯化，所以氨基鍵的PKa基本上低于9. 15。而且如同一些研究者報(bào)道聚偽N，N-二甲 基絲氨酸的氨基基團(tuán)全都是叔氨基，這有利于質(zhì)子海綿作用。聚偽N，N- 二甲基絲氨酸一個(gè) 缺點(diǎn)就是，其骨架降解產(chǎn)生羧酸而非氨基。酸的產(chǎn)生通常會(huì)減小質(zhì)子海綿作用。因此，使用 以絲氨酸為基礎(chǔ)的和以精胺為基礎(chǔ)的聚陽離子作為組合的基因包裹體系來制備復(fù)合物和 Iipolyplex也許是一個(gè)更好的選擇。簡單的通過混合基因的溶液與具有合適氮磷比的聚陽離子的水溶液就能夠?qū)⒒?因物質(zhì)(DNA或者RNA)凝聚成顆粒。基因轉(zhuǎn)染、反義效應(yīng)或者RNA干擾效應(yīng)能夠通過將這 些基因載體的懸浮液加入到細(xì)胞介質(zhì)中得到。聚陽離子可以幫助基因進(jìn)入細(xì)胞，從內(nèi)吞體 逃逸，并且在細(xì)胞質(zhì)中釋放出基因。官能團(tuán)(例如靶向基團(tuán)部分)能夠直接與上述合成的聚陽離子連接，或者與其他 的含有氨基酸的物質(zhì)(聚偽絲氨酸衍生物)合成的聚陽離子連接。與其他通過縮合反應(yīng)合 成的聚陽離子不同的是，聚偽絲氨酸衍生物是通過陰離子開環(huán)反應(yīng)合成的。官能團(tuán)可以作 為聚合反應(yīng)的引發(fā)劑，單體絲氨酸內(nèi)酯通過開環(huán)反應(yīng)一個(gè)個(gè)聚合到一起。通過這種機(jī)制，官 能團(tuán)被連接到聚合鏈的最末端，很容易就被暴露在基因-聚陽離子復(fù)合物顆粒的表面(圖 5 禾口 7)。聚陽離子具有很強(qiáng)的凝聚基因的能力，可通過簡單的混合，很容易地將大或小、單 一或多種基因混合，凝聚成細(xì)胞能夠吞噬的納米顆粒。被連接的小分子PEI或者精胺可用 來凝聚基因并發(fā)揮質(zhì)子海綿作用，而聚偽絲氨酸衍生物起到把靶向基團(tuán)固定到表面的作用。小分子PEI和精胺鏈接物的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)(除了降低毒性)是它們的降解不像其他 可降解的聚合物那樣產(chǎn)生酸性基團(tuán)。它們的降解產(chǎn)生更多的氨基，從而進(jìn)一步緩沖內(nèi)吞體 的酸性。這個(gè)性質(zhì)有助于基因的內(nèi)吞逃逸和在細(xì)胞質(zhì)中的釋放，而不需增加納米顆粒的表 面電荷。質(zhì)子海綿效應(yīng)在于游離氨基(吸收質(zhì)子)而產(chǎn)生的滲透壓致使內(nèi)吞體破裂。聚陽 離子的游離氨基是質(zhì)子海綿作用的源頭。但是，由于體內(nèi)組織表面帶有負(fù)電荷，如果增加了 質(zhì)子化了的氨基(即N/P比)導(dǎo)致納米復(fù)合物表面正電荷的增加，這樣會(huì)減少納米復(fù)合物 在體內(nèi)的循環(huán)時(shí)間。在本發(fā)明中，一部分游離氨基在氨酯、尿素、或亞胺結(jié)構(gòu)的降解中產(chǎn)生。 當(dāng)含氮的聚合物在凝聚基因物質(zhì)時(shí)不會(huì)增加表面正電荷，但是當(dāng)進(jìn)入細(xì)胞降解成氨基后， 起到緩沖作用。這個(gè)性質(zhì)能夠幫助攜帶基因的微粒具有低的表面電荷，而達(dá)到相同的內(nèi)吞 逃逸效果，或者更好的靶向能力。在本領(lǐng)域的科學(xué)家和工程師會(huì)發(fā)現(xiàn)下面的例子是這項(xiàng)發(fā)明的很好的展示，但是下 面的例子不應(yīng)該限制這項(xiàng)發(fā)明。
實(shí)施例實(shí)施例1.結(jié)構(gòu)不確定的聚精胺氨酯的合成(見圖IA與1B)通過氨酯鍵聚合精胺。取1當(dāng)量的乙二醇二氨基甲酸酯或丁二醇二氨基甲酸酯溶 于氯仿，在o°c、氮?dú)夥諊?，緩慢滴加到攪拌的溶解在氯仿和三乙胺中的精胺溶液中。之后，反?yīng)溶液升溫到室溫，并且攪拌12小時(shí)。在蒸發(fā)除去溶劑后，將得到的聚合物顆粒溶解 在水中，用透析袋(Mw = 3500)透析，除去小分子片段。最終產(chǎn)物在凍干后于-20°C儲(chǔ)存。實(shí)施例2.直鏈聚精胺氨酯的合成(見圖2A與2B)為了合成直鏈的聚精胺氨酯，精胺的兩個(gè)伯氨基需保護(hù)起來，即在氮?dú)庀拢?于-78°C下向精胺溶液(甲醇為溶劑)滴加三氟乙酸乙酯，隨后在0°C連續(xù)攪拌1小時(shí)。產(chǎn) 物N1A14-二(三氟乙酰基)精胺通過蒸發(fā)溶劑獲得，而其聚合物通過實(shí)施例1的步驟獲得。 聚合反應(yīng)完成后，氨基的保護(hù)基團(tuán)，三氟乙酸基的脫去通過用30wt%的氨水(保存于密閉 狀態(tài))在60°C下處理聚合產(chǎn)物達(dá)8小時(shí)而實(shí)現(xiàn)。最后的聚陽離子，最后通過用3500質(zhì)量的 透析膜除去小分子片段而獲得。實(shí)施例3.直鏈聚精胺酰胺的合成(見圖3)直鏈聚精胺酰胺鍵的合成方法與聚精胺氨酯相同，只不過其中的1個(gè)當(dāng)量的乙二 醇二氨基甲酸酯或1，4_ 丁二醇二氨基甲酸酯被1當(dāng)量的琥珀酰氯代替。實(shí)施例4.膽固醇或聚乙二醇接枝的直鏈聚精胺氨酯的合成(見圖4)為了將膽固醇或聚乙二醇接枝于聚精胺氨酯，實(shí)例2中合成的聚合物在脫保護(hù)之 前用mPEG-SC(5000)或膽留醇氯甲酸酯溶液(均溶于無水氯仿)做滴定添加處理。由于只 有聚合物鏈兩端帶有未加保護(hù)的氨基，mPEG或膽固醇基團(tuán)只能接枝于鏈的端頭。后續(xù)步驟， 如脫保護(hù)、凍干、復(fù)溶和透析等均與實(shí)例2的步驟相同。實(shí)施例5.含組氨酸的聚精胺的合成(見圖5)在60°C將琥珀酸酐加入到溶于乙醇鈉的組氨酸中合成中間物。溶液回流6小時(shí)。 溫度降到50°C，同時(shí)加入鹽酸，產(chǎn)物在丙酮中重結(jié)晶。咪唑上的氨基通過BOC加以保護(hù)。精 胺加入到溶于緩沖液的中間物質(zhì)溶液中，在50°C攪拌兩小時(shí)，合成含組氨酸的聚精胺。然后 除去B0C，并且得到的聚陽離子用3500的透析袋透析除去小分子部分。實(shí)施例6.聚精胺亞胺的合成(見圖6)在0°C、氮?dú)夥諊?、連續(xù)攪拌下，將乙二醛(40wt%的水溶液)或戊二醛(45wt%的 水溶液)滴入溶于無水乙醇的精胺溶液和分子篩中。然后溫度升至室溫，攪拌過夜。真空 蒸發(fā)濾液。然后將得到的聚陽離子經(jīng)3500的透析袋透析除去小分子量成份。實(shí)施例7.聚精胺氨酯的降解研究Polylink-SP(聚精胺氨酯)的降解性能經(jīng)37°C下HEBS緩沖液(pH = 7)中培養(yǎng) 后用GPC-HPLC分析分子量隨反應(yīng)天數(shù)的變化加以考察。為了從另一角度確認(rèn)Polylink-SP 的降解，將不同反應(yīng)天數(shù)的樣品凍干后對(duì)其形態(tài)進(jìn)行了觀察。這兩個(gè)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果分別顯示 于圖9A和9B。實(shí)施例8.聚精胺氨酯與DNA形成的polyplex的制備和物理化學(xué)表征Polyplex 的制備。所設(shè)計(jì)的聚陽離子(Polylink SP)基因擔(dān)載的能力，通過以聚合物/DNA重量比為 變量的電泳實(shí)驗(yàn)加以考察。Polylink-SP的濃縮液按照不同的聚合物/DNA比分別添加于綠 色熒光蛋白基因的溶液中。然后將配好的樣品添加到電泳板上進(jìn)行分析。對(duì)這些樣品同時(shí) 還進(jìn)行了 kta電位的測試。結(jié)果分別顯示于IOA和10B。實(shí)施例9. Polylink-SP與DNA形成的polyplex的粒徑上述復(fù)合物在水中的動(dòng)態(tài)粒徑運(yùn)用動(dòng)態(tài)光散射在25°C、4. 0毫瓦的He-Ne激光光 源(λ = 633nm)、在散射角度為90°下入射光進(jìn)行了考察。兩個(gè)測定結(jié)果分別示于圖IlA和 11B。實(shí)施例10. Polylink SP對(duì)報(bào)告基因的轉(zhuǎn)染活性Polylink-SP的基因轉(zhuǎn)染活性以熒光素酶基因(一種最常用的報(bào)告基因)為報(bào) 告基因，以C0S-7細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)細(xì)胞，同PEI-25KDa進(jìn)行了比較。在最優(yōu)聚合物/基因比例 (7-10)下，Polylink-SP顯示了相當(dāng)于PEI-25KDa的活性(圖12A)，說明在這個(gè)新型聚陽 離子在基因轉(zhuǎn)染效率上還是相當(dāng)?shù)?。Polylink-SP的轉(zhuǎn)染效率還同另一個(gè)對(duì)照物，HK高分子，賴氨酸和組胺酸共聚 形成的多肽，就熒光素酶基因的表達(dá)進(jìn)行了對(duì)比(圖12B)。關(guān)于聚合物對(duì)基因的比例， Polylink-SP為10，HK高分子為12。為了考察PEG化對(duì)基因轉(zhuǎn)染活性的影響，PEG化的 Polylink-SP (含36wt %的PEG)分別混合于Polylink-SP和HK高分子(混合度為20 % M 80% )。當(dāng)PEG化Polylink-SP比例較低時(shí)(20wt% )，Polylink-SP的基因轉(zhuǎn)染活性與 PEI-25KDa相當(dāng)，但高于HK高分子一個(gè)數(shù)量級(jí)。隨著PEG化Polylink-SP比例的增加(從 20%到80% ), Polylonk-SP的活性輕微下降，而HK高分子的活性逐漸增長，兩者從不同方 向趨近純PEG化Polylonk-SP的活性(圖12B)。對(duì)于Polylink SP而言，當(dāng)其加入50wt% 的PEG化聚合物時(shí)，即PEG重量含量為18%時(shí)(如圖12B)，Polylink SP的轉(zhuǎn)染綠色熒光 蛋白的活性并未受影響。事實(shí)上，PEG化的Polylink-SP對(duì)熒光素酶基因的轉(zhuǎn)染活性與未 PEG化的樣品相當(dāng)(圖12B)。實(shí)施例11.聚精胺氨酯與PEG化聚精胺氨酯的細(xì)胞毒性上述聚合物的細(xì)胞毒性，以PEI25kDa作為對(duì)照，運(yùn)用MTT法進(jìn)行了考察。將C0S-7 細(xì)胞以每孔IO4個(gè)細(xì)胞的密度，配合100 μ L培養(yǎng)液接種于96孔板中Mh。然后用含有聚合 物的新鮮，無血清和酚紅的培養(yǎng)基代替現(xiàn)有的生長培養(yǎng)基。用聚合物培養(yǎng)細(xì)胞4小時(shí)后，將 培養(yǎng)液換成新鮮的DMEM和25 μ L MTT的PBS溶液(5mg/mL)。兩次測試的結(jié)果示于圖13。實(shí)施例12.聚精胺氨酯與熒光SiRNA形成的polyplex的定位為了闡明Polylink SP(聚精胺氨酯)是否可以攜帶siRNA逃出內(nèi)吞體，我們利用 熒光標(biāo)定的siRNA與聚合物形成Polyplex，并與C0S-7細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。細(xì)胞核經(jīng)過染色，細(xì) 胞轉(zhuǎn)染通過共聚焦顯微鏡來觀察。如圖14所示，帶有熒光的polyplex被吸附在細(xì)胞核周 圍，這一現(xiàn)象表明PolylinkSP可以有效地?cái)y帶siRNA進(jìn)入細(xì)胞并逃出內(nèi)吞體。我們也將相 同的Polyplex轉(zhuǎn)染于肝臟細(xì)胞中并在細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了相同的熒光polyplex。實(shí)施例13.通過疏水相互作用形成lipopolyplexes以上討論過的基于精胺或絲氨酸的聚陽離子首先與脂肪酸，膽固醇或磷脂如實(shí)施 例4那樣接枝。然后在劇烈攪拌下，含有疏水基團(tuán)的聚陽離子與DNA或RNA的水溶液分別 加入到有機(jī)溶劑連續(xù)相中，形成油包水乳液。然后將磷酯溶液(溶于氯仿中)加入到連續(xù) 相中，并進(jìn)行干燥。最后，所得的粉末通過超聲水合形成lipopolyplex(見圖15)。參考文獻(xiàn)[l]Mulligan, R. 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權(quán)利要求
1.用人體內(nèi)源性的帶有氨基的單體構(gòu)建并可降解為人體內(nèi)源性的帶有氨基的單體的 陽離子聚合物。
2.權(quán)利要求1所述的陽離子聚合物，其中所述人體內(nèi)源性的帶有氨基的單體選自精 胺、亞精胺、絲氨酸、N，N-二甲基絲氨酸、組氨酸及其組合。
3.權(quán)利要求1或2所述的陽離子聚合物，其中所述人體內(nèi)源性帶有氨基的單體是通過 可降解的連接劑或通過其本身而聚合的。
4.權(quán)利要求1或2所述的陽離子聚合物，其中每個(gè)可降解的連接劑通過兩個(gè)或三個(gè)可 降解的鍵連接兩個(gè)或三個(gè)人體內(nèi)源性的帶有氨基的單體，所述可降解的鍵在降解時(shí)釋放人 體內(nèi)源性的帶有氨基的單體，所述單體呈起始狀態(tài)。
5.權(quán)利要求4所述的陽離子聚合物，其中在連接劑和人體內(nèi)源性的帶有氨基的單體之 間的可降解鍵為氨酯結(jié)構(gòu)、亞胺結(jié)構(gòu)、酯結(jié)構(gòu)或酰胺結(jié)構(gòu)。
6.權(quán)利要求1或2所述的陽離子聚合物，其中用于人體內(nèi)源性的帶有氨基的單體與其 本身相連的化學(xué)鍵為酯結(jié)構(gòu)或酰胺結(jié)構(gòu)。
7.權(quán)利要求3所述的陽離子聚合物，其中所述可降解連接劑不一定為內(nèi)源性單體或者 可降解為內(nèi)源性單體。
8.權(quán)利要求1或2所述的陽離子聚合物，其中所述內(nèi)源性的帶有氨基的單體包括具有 烷基化或二烷基化氨基的氨基酸。
9.權(quán)利要求4所述的陽離子聚合物，其中可降解的連接劑在與人體內(nèi)源性的帶有氨基 的單體相連的反應(yīng)性鍵之間具有一個(gè)或多個(gè)低PKa( < 8)的氨基。
10.權(quán)利要求9所述的陽離子聚合物，其中所述一個(gè)或多個(gè)低pKa(<8)的氨基包含在 咪唑基團(tuán)內(nèi)。
11.權(quán)利要求9所述的陽離子聚合物，其中所述一個(gè)或多個(gè)低pKa(<8)的氨基包含在氨基酸基團(tuán)內(nèi)。
12.權(quán)利要求9所述的陽離子聚合物，其中攜帶一個(gè)或多個(gè)低pKa(<8)的氨基的氨基 酸為組氨酸。
13.權(quán)利要求4所述的陽離子聚合物，其中所述可降解的連接劑在與人體內(nèi)源性的帶 有氨基的單體相連的反應(yīng)性鍵之間具有烷基。
14.權(quán)利要求4所述的陽離子聚合物，其中所述可降解的連接劑在與人體內(nèi)源性的帶 有氨基的單體相連的反應(yīng)性鍵之間帶有酯基團(tuán)。
15.權(quán)利要求1或2所述的陽離子聚合物，其與一個(gè)或多個(gè)生物官能團(tuán)接枝。
16.權(quán)利要求15所述的陽離子聚合物，其中結(jié)合的生物官能團(tuán)為脂肪酸，膽固醇琥珀 酸酯，或磷脂。
17.權(quán)利要求15所述的陽離子聚合物，其中結(jié)合的生物官能團(tuán)為聚乙二醇或細(xì)胞靶向基團(tuán)。
18.用于合成權(quán)利要求3所述的陽離子聚合物的方法，所述方法包括在人體內(nèi)源性的 帶有氨基的單體與含有兩個(gè)或三個(gè)反應(yīng)基團(tuán)的可降解連接劑之間的反應(yīng)，或在人體內(nèi)源性 的帶有氨基的單體本身之間的反應(yīng)。
19.權(quán)利要求18所述的方法，其中所述可降解的連接劑為二氯甲酸酯或三氯甲酸酯。
20.權(quán)利要求18所述的方法，其中所述可降解的連接劑為二醛或三醛。
21.權(quán)利要求18所述的方法，其中所述可降解的連接劑是二羧酸鹵化物或三羧酸鹵化物。
22.權(quán)利要求18所述的方法，其中所述可降解的連接劑為活化的二羧酸酯或三羧酸
23.權(quán)利要求18所述的方法，其中所述人體內(nèi)源性的帶有氨基的單體通過開環(huán)聚合與 其自身反應(yīng)。
24.權(quán)利要求18所述的方法，其中所述人體內(nèi)源性的帶有氨基的單體通過活化的 酸-羥基縮合而與其自身反應(yīng)。
25.權(quán)利要求1或2所述的陽離子聚合物在DNA(包括DNA疫苗)包裹和輸送中的應(yīng)用。
26.權(quán)利要求1或2所述的陽離子聚合物在RNA(包括siRNA)包裹和輸送中的應(yīng)用。
27.權(quán)利要求16所述的陽離子聚合物在通過疏水相互作用在polyplex周圍組裝脂質(zhì) 雙層中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明揭示了一種用于基因(DNA與RNA)輸送的聚陽離子的設(shè)計(jì)和合成方法。根據(jù)該設(shè)計(jì)，聚陽離子(也稱作陽離子聚合物)是由內(nèi)源性攜帶足夠氨基的單體通過可降解鍵與連接劑分子或與它們本身的聚合而形成的。這些攜帶氨基的單體指的是天然存在于人體內(nèi)或?qū)θ梭w無毒的那些單體。連接劑分子是指那些在降解的過程中不但可以降解為無毒的分子片段，并且能夠以其自然態(tài)釋放出攜帶氨基的分子。精胺，亞精胺，絲氨酸，N，N-二甲基絲氨酸與組氨酸是一些攜帶氨基的單體的例子。用于在攜帶氨基的單體之間形成的可降解的化學(xué)鍵實(shí)例有氨酯，亞胺，酰胺，碳酸酯和羧酸酯。為了改善降解性或質(zhì)子海綿效應(yīng)，低pKa(＜8)的氨基基團(tuán)或其它給電子基團(tuán)被結(jié)合到兩個(gè)(或三個(gè))反應(yīng)性基團(tuán)的鏈接分子中用以連接攜帶氨基的單體。本申請(qǐng)還提供一些使用這些聚陽離子載體進(jìn)行納米包封和基因物質(zhì)轉(zhuǎn)染的實(shí)例。
文檔編號(hào)C12N11/08GK102083972SQ200980110496
公開日2011年6月1日 申請(qǐng)日期2009年1月24日 優(yōu)先權(quán)日2008年1月25日
發(fā)明者杜子秀, 金拓 申請(qǐng)人:金拓