專利名稱：一種賴氨酸高產(chǎn)菌株的篩選方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種賴氨酸高產(chǎn)菌株的篩選方法及其在發(fā)酵產(chǎn)賴氨酸中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
現(xiàn)有技術(shù)中，一般通過賴氨酸搖瓶發(fā)酵篩選賴氨酸高產(chǎn)菌株，具體操作步驟包括分別將賴氨酸發(fā)酵菌株接種至液體培養(yǎng)基中進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，發(fā)酵結(jié)束后測定發(fā)酵液中的賴氨酸含量并計算轉(zhuǎn)化率從而篩選出高產(chǎn)量菌株。 而在搖瓶發(fā)酵的過程中，隨著營養(yǎng)物質(zhì)的消耗，發(fā)酵液的pH值會不斷下降，所以需要人工定時取樣檢測PH值并添加氨水或液氨來控制pH值在適當(dāng)范圍內(nèi)以保證菌種的正常生長代謝。因此，搖瓶發(fā)酵篩選菌株的操作過程繁瑣，即每次添加氨水或液氨時至少需要進(jìn)行2次pH值的測定，而且在添加氨水或液氨時容易使發(fā)酵液染雜菌，存在導(dǎo)致篩選失敗的風(fēng)險。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種操作簡單且結(jié)果可靠的賴氨酸高產(chǎn)菌株篩選方法及其應(yīng)用。為了實現(xiàn)上述目的，一方面，本發(fā)明提供了一種賴氨酸高產(chǎn)菌株的篩選方法，該方法包括配制固體培養(yǎng)基，將多株賴氨酸發(fā)酵菌株接種至固體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，然后篩選出高產(chǎn)菌株，其特征在于，所述固體培養(yǎng)基為添加了指示劑的固體培養(yǎng)基且所述指示劑的變色pH范圍為5. 5-8 ;并通過觀察固體培養(yǎng)基中指示圈的大小篩選出所述高產(chǎn)菌株。另一方面，本發(fā)明提供了上述方法在發(fā)酵產(chǎn)賴氨酸中的應(yīng)用。通過上述技術(shù)方案，在賴氨酸發(fā)酵菌株的培養(yǎng)過程中，隨著營養(yǎng)物質(zhì)的消耗，會逐漸在固體培養(yǎng)基上形成指示圈，操作人員根據(jù)該指示圈的大小便可直觀地篩選出高產(chǎn)量的賴氨酸高產(chǎn)菌株。本發(fā)明的其他特征和優(yōu)點將在隨后的具體實施方式
部分予以詳細(xì)說明。
具體實施例方式以下對本發(fā)明的具體實施方式
進(jìn)行詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解的是，此處所描述的具體實施方式
僅用于說明和解釋本發(fā)明，并不用于限制本發(fā)明。本發(fā)明中，在未作相反說明的情況下，術(shù)語“指示劑的變色pH范圍”指的是指示劑的變色pH點所在的范圍。本發(fā)明提供的賴氨酸高產(chǎn)菌株的篩選方法包括配制固體培養(yǎng)基，將多株賴氨酸發(fā)酵菌株接種至固體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，然后篩選出高產(chǎn)菌株，其特征在于，所述固體培養(yǎng)基為添加了指示劑的固體培養(yǎng)基且所述指示劑的變色PH范圍為5. 5-8，優(yōu)選為6-7. 4 ;并通過觀察固體培養(yǎng)基中指示圈的大小篩選出所述高產(chǎn)菌株。其中，所述多株賴氨酸發(fā)酵菌株優(yōu)選至少為8株賴氨酸發(fā)酵菌株。所述賴氨酸發(fā)酵菌株可以是商購獲得的產(chǎn)賴氨酸菌株，也可以是人工篩選獲得的產(chǎn)賴氨酸菌株。本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的是指示劑一般以溶液的形式使用，可以直接商購獲得，也可以購買粉末狀產(chǎn)品再配制成溶液使用，且配制時使用的溶劑為常規(guī)試劑，配制方法為常規(guī)方法，例如，溴百里酚藍(lán)一般以O(shè). 1-0. 3重量％濃度的溶液形式使用，配制方法包括先將O. 1-0. 3克溴百里酚藍(lán)溶于60ml濃度為100%的乙醇中，再加水至100ml。根據(jù)本發(fā)明，相對于每千克的固體培養(yǎng)基，所述指示劑的添加量優(yōu)選為
O.002-0. 012克。當(dāng)指示劑的添加量在上述優(yōu)選范圍內(nèi)時，顯色明顯且不會對賴氨酸發(fā)酵產(chǎn)生影響。需要說明的是，本發(fā)明中，指示劑的添加量以指示劑的干重計，即當(dāng)所述指示劑以溶液形式使用時，指示劑的添加量不包括其中溶劑的量。 根據(jù)本發(fā)明，只要所述指示劑的變色pH范圍在上述范圍內(nèi)即可實現(xiàn)本發(fā)明的目的，優(yōu)選地，所述指示劑為溴百里酚藍(lán)、溴酚藍(lán)、中性紅、酚紅、苯酚紅和石蕊中的一種。根據(jù)本發(fā)明，如前所述，在賴氨酸發(fā)酵菌株的培養(yǎng)過程中，隨著營養(yǎng)物質(zhì)的消耗，會逐漸在固體培養(yǎng)基上形成指示圈，指示圈越大，說明賴氨酸發(fā)酵菌株產(chǎn)生的賴氨酸的量越多，因此可以直接選用形成的指示圈直徑最大和/或形成的指示圈的直徑為直徑最大的指示圈的直徑的98%以上的菌株作為高產(chǎn)菌株。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠理解的是，指示圈的顏色與使用的指示劑的類型有關(guān)，故在此不再詳述。根據(jù)本發(fā)明，所述固體培養(yǎng)基可以為本領(lǐng)域常規(guī)使用的能夠培養(yǎng)賴氨酸發(fā)酵菌株并添加了指示劑的培養(yǎng)基，優(yōu)選情況下，所述固體培養(yǎng)基為添加了指示劑的賴氨酸發(fā)酵固體培養(yǎng)基、胰蛋白大豆瓊脂固體培養(yǎng)基或LB固體培養(yǎng)基。使用上述優(yōu)選的培養(yǎng)基能夠獲得更易于觀測的指示圈。進(jìn)一步優(yōu)選情況下，所述固體培養(yǎng)基為添加了溴酚藍(lán)的賴氨酸發(fā)酵固體培養(yǎng)基；或者所述固體培養(yǎng)基為添加了溴百里酚藍(lán)的胰蛋白大豆瓊脂固體培養(yǎng)基。本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，使用這兩種固體培養(yǎng)基最終獲得的指示圈更大且邊緣更明顯，故更適于觀測。本發(fā)明中，所述賴氨酸發(fā)酵固體培養(yǎng)基可以通過往常規(guī)的賴氨酸發(fā)酵液體培養(yǎng)基中添加瓊脂而獲得，所述賴氨酸發(fā)酵液體培養(yǎng)基為本領(lǐng)域常規(guī)使用的發(fā)酵制賴氨酸的培養(yǎng)基。所述LB固體培養(yǎng)基可以通過往常規(guī)的LB液體培養(yǎng)基中添加瓊脂而獲得。通過添加瓊脂來配制固體培養(yǎng)基是本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的，因此瓊脂的添加量可以為本領(lǐng)域常規(guī)使用的量，例如，相對于每千克的固體培養(yǎng)基，所述瓊脂的添加量為15-30g,優(yōu)選為15-25g。對于賴氨酸發(fā)酵固體培養(yǎng)基，一般地，相對于每千克的賴氨酸發(fā)酵固體培養(yǎng)基，葡萄糖的用量為30-50g，優(yōu)選為35-45g ;糖蜜的用量為0_40g，優(yōu)選為15_25g ;玉米漿(干重為20-50重量％)用量為10-40g，優(yōu)選為15-25g ;磷酸氫二鉀的用量為O. 5-1. 5g，優(yōu)選為O. 75-1. 25g ;硫酸鎂的用量為O. 4-2g，優(yōu)選為O. 8-1. 5g ;硫酸銨的用量為5_20g，優(yōu)選為10-15g ；蘇氨酸的用量為O. 05-0. 6g，優(yōu)選為O. 1-0. 3g ；蛋氨酸的用量為O. 05-0. 6g，優(yōu)選為O. 1-0. 4g ;谷氨酸的用量為O. 2-0. 6g，優(yōu)選為O. 3-0. 5g ;甜菜堿的用量為l_5g，優(yōu)選為2-4g ；pH 值為 6. 8-7. 4，優(yōu)選為 7-7. 2。對于胰蛋白大豆瓊脂固體培養(yǎng)基，可以通過商購獲得，一般地，相對于每千克的胰蛋白大豆瓊脂固體培養(yǎng)基，胰蛋白大豆瓊脂的用量為30-50g，優(yōu)選為35-45g，pH值為6. 8-7. 4，優(yōu)選為 7-7. 2。
對于LB固體培養(yǎng)基，可以自行配制，也可以通過商購獲得，一般地，相對于每千克的LB固體培養(yǎng)基，蛋白胨的用量為5-15g，優(yōu)選為8-12g ;酵母膏的用量為2_8g，優(yōu)選為4-6g ;氯化鈉的用量為2-8g，優(yōu)選為4-6g ;pH值為6. 8-7. 4，優(yōu)選為7-7. 2。根據(jù)本發(fā)明，所述賴氨酸發(fā)酵菌株可以為本領(lǐng)域常規(guī)使用的賴氨酸發(fā)酵菌株，例如可以為選自谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)、大腸桿菌(EscherichiaColi)和黃色短桿菌(Brevibacterium fIavum)中的一株。根據(jù)本發(fā)明，對所述培養(yǎng)的條件沒有特殊限定，優(yōu)選情況下，所述培養(yǎng)的條件包括溫度為30-38°C，時間為50-80h。本發(fā)明還提供了上述方法在發(fā)酵產(chǎn)賴氨酸中的應(yīng)用。以上詳細(xì)描述了本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，但是，本發(fā)明并不限于上述實施方式中的具體細(xì)節(jié)，在本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思范圍內(nèi)，可以對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行多種簡單變型，這 些簡單變型均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。另外需要說明的是，在上述具體實施方式
中所描述的各個具體技術(shù)特征，在不矛盾的情況下，可以通過任何合適的方式進(jìn)行組合，為了避免不必要的重復(fù)，本發(fā)明對各種可能的組合方式不再另行說明。此外，本發(fā)明的各種不同的實施方式之間也可以進(jìn)行任意組合，只要其不違背本發(fā)明的思想，其同樣應(yīng)當(dāng)視為本發(fā)明所公開的內(nèi)容。以下將通過實施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)描述。以下實施例中，黃色短桿菌菌種(菌株原種FB42購自江南大學(xué))；將培養(yǎng)的黃色短桿菌菌種用無菌水稀釋101°倍，制得菌懸液；pH值的檢測使用梅特勒DeLTA320pH計；發(fā)酵液中賴氨酸的含量參照標(biāo)準(zhǔn)GB10794-89。以下實施例中，所用固體培養(yǎng)基的具體成分及其含量如下表I所示表I
權(quán)利要求
1.一種賴氨酸高產(chǎn)菌株的篩選方法，該方法包括配制固體培養(yǎng)基，將多株賴氨酸發(fā)酵菌株接種至固體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，然后篩選出高產(chǎn)菌株，其特征在于，所述固體培養(yǎng)基為添加了指示劑的固體培養(yǎng)基且所述指示劑的變色PH范圍為5. 5-8 ;并通過觀察固體培養(yǎng)基中指示圈的大小篩選出所述高產(chǎn)菌株。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中，所述指示劑的變色PH范圍為6-7.4。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的方法，其中，相對于每千克的固體培養(yǎng)基，所述指示劑的添加量為0. 002-0. 012克。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任意一項所述的方法，其中，所述指示劑為溴百里酚藍(lán)、溴酚藍(lán)，中性紅、酚紅、苯酚紅和石蕊中的ー種。
5.根據(jù)權(quán)利要求I或4所述的方法，其中，所述固體培養(yǎng)基為添加了溴酚藍(lán)的賴氨酸發(fā)酵固體培養(yǎng)基。
6.根據(jù)權(quán)利要求I或4所述的方法，其中，所述固體培養(yǎng)基為添加了溴百里酚藍(lán)的胰蛋白大豆瓊脂固體培養(yǎng)基。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中，所述賴氨酸發(fā)酵菌株為選自谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)、大腸桿菌(Escherichia Coli)和黃色短桿菌(Brevibacterium fIavum)中的一株。
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中，所述培養(yǎng)的條件包括溫度為30-38°C，時間為50-80h。
9.權(quán)利要求1-8中任意一項所述的方法在發(fā)酵產(chǎn)賴氨酸中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種賴氨酸高產(chǎn)菌株的篩選方法及其應(yīng)用，該方法包括配制固體培養(yǎng)基，將多株賴氨酸發(fā)酵菌株接種至固體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，然后篩選出高產(chǎn)菌株，其特征在于，所述固體培養(yǎng)基為添加了指示劑的固體培養(yǎng)基且所述指示劑的變色pH范圍為5.5-8；并通過觀察固體培養(yǎng)基中指示圈的大小篩選出所述高產(chǎn)菌株。通過上述技術(shù)方案，在賴氨酸發(fā)酵菌株的培養(yǎng)過程中，隨著營養(yǎng)物質(zhì)的消耗，會逐漸在固體培養(yǎng)基上形成指示圈，操作人員根據(jù)該指示圈的大小便可直觀地篩選出高產(chǎn)量的賴氨酸高產(chǎn)菌株，且本發(fā)明方法的篩選結(jié)果可靠。
文檔編號C12N1/02GK102766591SQ201210266750
公開日2012年11月7日 申請日期2012年7月30日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月30日
發(fā)明者盧宗梅, 吳曉艷, 夏令和, 滿云, 馬靜 申請人:中糧生物化學(xué)(安徽)股份有限公司