專利名稱：一種生產(chǎn)1,3-丙二醇的菌株篩選方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及1，3-丙二醇，尤其是涉及一種生產(chǎn)1，3-丙二醇的菌株篩選方法與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
1，3-丙二醇是一種重要的化工原料，它可直接作為抗凍劑、多種增塑劑、洗滌劑、防腐劑和乳化劑的合成原料，也可用于食品、化妝品和制藥等行業(yè)。其最主要的用途是作為合成聚酯、聚醚和聚氨酯等高分子材料的單體。目前，1，3-丙二醇的合 成方法主要有兩種，即化學(xué)法和生物法。其中化學(xué)法生產(chǎn)1，3-丙二醇已日趨成熟，但化學(xué)法消耗了不可再生的有限資源，并造成了環(huán)境污染。近年來(lái)，生物轉(zhuǎn)化法以其利用可再生資源、對(duì)環(huán)境友好等特點(diǎn)日益受到人們的重視。隨著石化資源的日益枯竭，生物法必將取代化學(xué)法。21世紀(jì)，石油供需矛盾日益尖銳，石油化工及石化燃料燃燒造成的環(huán)境問題日益突出，開發(fā)新的對(duì)環(huán)境無(wú)害的可再生能源日益得到各國(guó)的重視。生物柴油是一種環(huán)境友好的生物燃料，在使用中可部分或全部替代石化柴油。近年來(lái)，生物柴油產(chǎn)業(yè)異軍突起，飛速發(fā)展，而廢甘油是生物柴油生產(chǎn)過(guò)程中的主要副產(chǎn)物，每生產(chǎn)I噸生物柴油會(huì)副產(chǎn)O. I噸廢甘油。隨著世界范圍內(nèi)生物柴油需求量和生產(chǎn)量的迅猛增長(zhǎng)，廢甘油成為豐富而廉價(jià)的原料，對(duì)它的有效利用也成為緊迫的課題。目前以甘油為原料制備1，3-丙二醇主要有兩種方法I.中國(guó)專利200710113923. 8公開了一種采用化學(xué)法轉(zhuǎn)化甘油制備1,3-丙二醇的方法，采用兩步反應(yīng)，第一步是1，3-溴氯丙烷與乙酸鈉在醇類催化劑的作用下生成1，3-丙二乙酯，第二步是上步反應(yīng)得到的雙脂與甲醇在樹脂類催化劑的作用下生成1，3-丙二醇。2.中國(guó)專利200710048122. 8公開了一種采用微生物發(fā)酵甘油制備1,3-丙二醇的方法，該方法所使用的菌種為克雷伯氏桿菌，為條件致病菌，存在生物安全性方面的隱患。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種丁酸梭菌(Clostridium butyricum) Genl60。本發(fā)明的第二目的在于提供丁酸梭菌(Clostridium butyricum)Genl60的篩選方法。本發(fā)明的第三目的在于提供丁酸梭菌(Clostridium butyricum)Genl60的改造方法。本發(fā)明的第四目的在于提供丁酸梭菌(Clostridium butyricum)Genl60在利用廢甘油生產(chǎn)1，3_丙二醇中的應(yīng)用。所述丁酸梭菌(Clostridium butyricum) Genl60,是一種益生菌，該菌種已于2012年07月05日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCCNo. 6317，地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵政編碼 100101。
所述丁酸梭菌(Clostridium butyricum) Genl60從土壤樣品中篩選得到,具體步驟為取采集樣品各lg，加入到9mL白菜汁中，37°C密封富集培養(yǎng)24h后置80°C水浴lOmin，殺死非芽孢菌，轉(zhuǎn)入梭菌增殖液體培養(yǎng)基，37°C厭氧培養(yǎng)24h再置80°C水浴lOmin，轉(zhuǎn)入發(fā)酵培養(yǎng)基，37°C厭氧選擇性富集培養(yǎng)24h后進(jìn)行高效液相色譜分析發(fā)酵產(chǎn)物，選取能夠生產(chǎn)1，3-丙二醇的陽(yáng)性菌；再采用高層瓊脂柱法，分離出單菌落；同時(shí)進(jìn)行好氧和厭氧培養(yǎng)，除去兼性厭氧菌，得到嚴(yán)格厭氧菌，分析發(fā)酵產(chǎn)物，選取能夠生產(chǎn)1，3-丙二醇和培養(yǎng)特征、菌落形態(tài)均符合丁酸梭菌培養(yǎng)特征的菌株進(jìn)行16S rDNA序列分析鑒定。所述梭菌增殖液體培養(yǎng)基即生長(zhǎng)培養(yǎng)基(RCM培養(yǎng)基)為胰蛋白胨，10g/L ;牛肉膏，10g/L ;酵母粉，3g/L ;葡萄糖，5g/L ；NaC l, 3g/L ；NaAc, 3g/L ;可溶性淀粉,lg/L ;半胱氨酸鹽酸鹽，0. 5g/L ；pH 7. 5。所述高層瓊脂柱培養(yǎng)法的具體步驟為加熱融化10管加入Vc的RCM固體培養(yǎng)基(每管9mL培養(yǎng)基)，待冷至80°C左右，在第I管中接入ImL菌液，充分振蕩均勻后，迅速將其ImL培養(yǎng)基倒入第2管，充分振蕩均勻后將其ImL培養(yǎng)基倒入第3管，依次稀釋至第10管。將試管放入冰中，迅速冷卻。待瓊脂凝固，每管加入2. 5mL滅菌的液體石蠟，置37°C恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)24h。用接種環(huán)挑選單菌落于無(wú)菌水中，振蕩混勻，用無(wú)菌注射器分別轉(zhuǎn)入RCM液體培養(yǎng)基血清瓶中，37°C、150rpm搖床培養(yǎng)36h。所述丁酸梭菌(Clostridium butyricum) Genl60的改造方法的具體步驟為將丁酸梭菌(Clostridium butyricum)Genl60接入含有甘油的種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)10 20h，然后以4% 10%的接種量接種于含廢甘油濃度50g/L的發(fā)酵培養(yǎng)基的血清瓶中進(jìn)行搖瓶厭氧培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為31 39°C,發(fā)酵培養(yǎng)基中加入7 15g/L碳酸I丐以維持穩(wěn)定的pH。培養(yǎng)12 24h后，以4% 10%的接種量接種于另一瓶同樣培養(yǎng)基成分的血清瓶中，如此循環(huán)20次，將菌種保存于生長(zhǎng)培養(yǎng)基(RCM培養(yǎng)基)中并于4°C冰箱保存，得到丁酸梭菌第20代菌株，記作Gen20 ;依次提高廢甘油濃度70、80、90、100g/L，分別采用上述步驟進(jìn)行不斷傳代培養(yǎng)，每種條件培養(yǎng)20代，分別記為Gen40、60、80、100 ;在GenlOO基礎(chǔ)上，依次提高抑制菌體生長(zhǎng)的副產(chǎn)物丁酸濃度15、20、25g/L，分別采用上述步驟進(jìn)行不斷傳代培養(yǎng)，每種條件培養(yǎng)20代，分別記為Genl20、140、160;分別在分批發(fā)酵和補(bǔ)料分批發(fā)酵條件下對(duì)比保存菌株，擇優(yōu)進(jìn)行單菌落的分離，利用高層瓊脂柱法挑選出純菌株。所述種子培養(yǎng)基為甘油，20g/L；K2HPO4 · 3Η20，4· 45g/L ；KH2PO4,1. 3g/L ；(NH4) 2S04，2g/L ；MgS04 · 7H20，0. 2g/L ；CaCl2 · 2H20，0. 02g/L ;酵母粉，lg/L ;微量元素溶液，ImL ；Fe 溶液，ImL ;自然 pH。所述發(fā)酵的溫度可為31 39°C。所述發(fā)酵的攪拌速度可為100 300rpm。所述發(fā)酵體系的pH值可為6. O 8. O。所述發(fā)酵的時(shí)間可為12 60h。所述發(fā)酵的接種量的體積百分比可為4% 10%。所述發(fā)酵培養(yǎng)基為廢甘油(甘油含量由液相色譜分析測(cè)定)30 120g/L ；K2HPO4 · 3Η20，0· I 2. 0g/L ；KH2PO4,0. I 2. 0g/L ； (NH4)2SO4,0. 5 5. 0g/L ；MgS04 · 7H20,0. I I. Og/L ；CaCl2 ·2Η20，0· 01 0. 2g/L ;酵母粉，0. 5 5. 0g/L ;微量元素溶液，ImL ；Fe溶液ImL。所述廢甘油為生物柴油生產(chǎn)過(guò)程中的副產(chǎn)物。所述Fe 溶液為=FeSO4 · 7H20,1 10g/L ；HC1 (37%)，4mL。所述微量元素溶液為=ZnCl2,0.01 O. 2g/L ；MnCl2 · 4H20,0. 01 O. 2g/L ；H3BO3,O. 01 O. lg/L ；CoCl 2 · 6Η20，0· I O. 5g/L ；CuCl2 · 2Η20，0· 01 0. 05g/L ；NiCl2 · 6H20,0. 02 0. 05g/L ；Na2MoO4 · 2H20,0. 01 0. 06g/L ；HC1 (37%)，0. 9mL。所述丁酸梭菌(Clostridium butyricum) Gen l60可用于利用廢甘油生產(chǎn)1，3_丙二醇。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于I)由于本發(fā)明所用發(fā)酵培養(yǎng)基無(wú)需進(jìn)行滅菌，可直接用于發(fā)酵，因此減少了能耗，降低了生產(chǎn)成本。2)由于本發(fā)明使用微生物將廉價(jià)原料廢甘油轉(zhuǎn)化為具有高附加值的生物基平臺(tái)化合物1，3-丙二醇，因此找到了一條有效利用廢甘油的出路。3)由于本發(fā)明所用菌種為益生菌，因此無(wú)生物安全性方面的隱患。4)本發(fā)明屬于穩(wěn)定地、有目的性地改造菌株，操作簡(jiǎn)單，同時(shí)能夠構(gòu)建出生產(chǎn)目的產(chǎn)物的菌株。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明實(shí)質(zhì)內(nèi)容的限制。實(shí)施例I :I.菌種的分離和純化I)取采集樣品各lg，加入到9mL白菜汁中，37°C密封富集培養(yǎng)24h。2)將上述培養(yǎng)液置80°C水浴lOmin，殺死非芽孢菌，轉(zhuǎn)入梭菌增殖液體培養(yǎng)基，37 °C厭氧培養(yǎng)24h。3)將上述培養(yǎng)液置80°C水浴lOmin，轉(zhuǎn)入發(fā)酵培養(yǎng)基，37°C厭氧選擇性富集培養(yǎng)24h。進(jìn)行高效液相色譜分析發(fā)酵產(chǎn)物，選取能夠生產(chǎn)1，3-丙二醇的陽(yáng)性菌進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。4)梯度稀釋培養(yǎng)液，采用高層瓊脂柱法(RCM培養(yǎng)基加入2%瓊脂，石蠟油覆蓋2-3cm), 37°C培養(yǎng)24h，分離出單菌落(當(dāng)菌落長(zhǎng)至2mm左右時(shí)用接種針挑取)。5)同時(shí)進(jìn)行好氧和厭氧培養(yǎng)，除去兼性厭氧菌，得到嚴(yán)格厭氧菌。重復(fù)步驟3)、4)2-3次，直到得到單一純菌株，單一純菌株的要求為在顯微鏡下觀察，細(xì)菌細(xì)胞形狀均一。6)進(jìn)行高效液相色譜分析發(fā)酵產(chǎn)物，選取能夠生產(chǎn)1，3-丙二醇和培養(yǎng)特征、菌落形態(tài)均符合丁酸梭菌培養(yǎng)特征的菌株進(jìn)行16S rDNA序列分析鑒定。最終獲得一株可以轉(zhuǎn)化甘油產(chǎn)1，3-丙二醇的菌株GenO。2.菌種的鑒定將步驟I)篩選得到的菌株GenO進(jìn)行形態(tài)特征和16S rDNA序列鑒定，具體過(guò)程如下菌株GenO單菌落呈圓形、直徑約l_2mm、乳白色、低凸起、邊緣整齊、不透明的光滑型菌落。光學(xué)顯微鏡下觀察為革蘭氏陽(yáng)性桿菌，內(nèi)生孢子卵圓，偏心或次端生。培養(yǎng)過(guò)程中發(fā)酵產(chǎn)1，3-丙二醇產(chǎn)酸產(chǎn)氣，嚴(yán)格厭氧菌。根據(jù)《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》，判斷篩出的菌株形態(tài)學(xué)符合丁酸梭菌的特性，初步斷定為丁酸梭菌。菌株GenO的16S rDNA核苷酸序列如附錄中序列表所示，其與模式菌株丁酸梭菌Clostridium butyricum ATCC 19398 (T)白勺同源性最高，可達(dá) 99. 7%?；谝陨咸卣鲗⒑Y選得到的菌株GenO鑒定為丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum)。3.菌種的改造I)用無(wú)菌注射器抽取2mL 丁酸梭菌GenO于含50mL種子培養(yǎng)基的血清瓶中，活化 24h左右。2)待種子培養(yǎng)基中菌株長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(變白色渾濁)，抽取2mL種子液于含50mL發(fā)酵培養(yǎng)基的血清瓶中，培養(yǎng)24h (此即為一代)。此時(shí)該血清瓶中菌株記為Genl (以下編號(hào)同理)。3)同樣待發(fā)酵培養(yǎng)基中菌株長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，抽取2mL培養(yǎng)基于另一瓶含發(fā)酵培養(yǎng)基的血清瓶中，此時(shí)該血清瓶中菌株記為Gen2。4)如此循環(huán)傳代培養(yǎng)，每循環(huán)20代為一個(gè)批次，批次間逐步改變發(fā)酵培養(yǎng)基中廢甘油、丁酸等的濃度。每批次保存菌種于生長(zhǎng)培養(yǎng)基(RCM培養(yǎng)基)中并于4°C冰箱保存，分別記為GenO、20、40、60、80、100、120、140、160，分別對(duì)其進(jìn)行發(fā)酵考察。5)第I 20號(hào)發(fā)酵培養(yǎng)基中添加50g/L廢甘油(其余培養(yǎng)基成分同發(fā)酵培養(yǎng)基成分，下同);第21 40號(hào)發(fā)酵培養(yǎng)基中添加70g/L廢甘油；第41 60號(hào)發(fā)酵培養(yǎng)基中添加80g/L廢甘油；第61 80號(hào)發(fā)酵培養(yǎng)基中添加90g/L廢甘油；第81 100號(hào)發(fā)酵培養(yǎng)基中添加100g/L廢甘油；第101 120號(hào)發(fā)酵培養(yǎng)基中添加100g/L廢甘油和10g/L 丁酸；第121 140號(hào)發(fā)酵培養(yǎng)基中添加100g/L廢甘油和15g/L 丁酸；第141 160號(hào)發(fā)酵培養(yǎng)基中添加100g/L廢甘油和20g/L 丁酸。同時(shí)發(fā)酵培養(yǎng)基中添加10g/L碳酸鈣以維持穩(wěn)定的pH。6)利用已保存的菌株Gen0、20、40、60、80、100、120、140、160，分別進(jìn)行分配發(fā)酵和補(bǔ)料分批發(fā)酵，考察其利用廢甘油產(chǎn)1，3-丙二醇的能力，最終目的是提高1，3-丙二醇產(chǎn)量。7 )同時(shí)也考察了發(fā)酵過(guò)程中發(fā)酵培養(yǎng)基未滅菌與滅菌情況的對(duì)比，證實(shí)了未滅菌發(fā)酵過(guò)程沒有發(fā)生染菌現(xiàn)象，結(jié)果與正常滅菌發(fā)酵過(guò)程相差甚微。實(shí)施例2 (I)發(fā)酵方式5L機(jī)械攪拌發(fā)酵罐，通氮?dú)夥峙l(fā)酵(2)菌種丁酸梭菌(Clostridium butyricum) GenO(3)培養(yǎng)基種子培養(yǎng)基(/L)為甘油，20g；K2HPO4 · 3Η20，4· 45g ；KH2PO4,1. 3g ； (NH4)2S04，2g ；MgSO4 · 7Η20，0· 2g ；CaCl2 · 2H20，0. 02g ;酵母粉，Ig ;微量元素溶液，ImL ；Fe 溶液，ImL ;自然pH。發(fā)酵培養(yǎng)基(/L)為:廢甘油(甘油含量約90%w/w) ；KH2P04,1. 2g ； (NH4)2S04, 2g ；MgSO4 · 7Η20，0· 2g ；CaCl2 · 2H20，0. 02g ;酵母粉，Ig ;微量元素溶液，ImL ;Fe 溶液 ImL ；pH7. O。
所述Fe 溶液(/L)為=FeSO4 · 7H20，5g ；HC1 (37%)，4mL。所述微量元素溶液(/L)為=ZnCl2,0.07g ；MnCl2 · 4Η20，0· Ig ;Η3Β03，0· 06g ；CoCl2 · 6H20,0. 2g ；CuCl2 · 2H20,0. 02g ；NiCl2 · 6H20,0. 025g ；Na2Mo04 · 2H20,0. 035g ；HCl(37%),0. 9mL。(4)發(fā)酵過(guò)程種子培養(yǎng)用無(wú)菌注射器取2mL 丁酸梭菌GenO菌液接種于裝有50mL種子培養(yǎng)基的血清瓶中，37 0C、150rpm搖床培養(yǎng)，培養(yǎng)16h。種子擴(kuò)大培養(yǎng)用無(wú)菌注射器取5mL種子液接種于 裝有IOOmL種子培養(yǎng)基的血清瓶中，37°C、150rpm搖床培養(yǎng)，培養(yǎng)6h。5L發(fā)酵罐培養(yǎng)將擴(kuò)培的種子液以10%的接種量接種于裝有含70g/L廢甘油的2L發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵溫度控制在37°C，pH用濃度為4mol/L NaOH溶液自動(dòng)調(diào)節(jié)維持在7. 0，攪拌轉(zhuǎn)速150rpm,在發(fā)酵過(guò)程中向發(fā)酵罐中通氮?dú)?O. Ivvm)來(lái)維持發(fā)酵體系的厭氧條件。當(dāng)發(fā)酵液PH明顯上升(高于7. O)時(shí)，結(jié)束發(fā)酵，發(fā)酵時(shí)間為79h。(5)發(fā)酵結(jié)果發(fā)酵結(jié)束時(shí)，發(fā)酵液中1，3-丙二醇濃度30. lg/L,生產(chǎn)強(qiáng)度O. 380g/L · h。實(shí)施例3 (I)發(fā)酵方式5L機(jī)械攪拌發(fā)酵罐，通氮?dú)夥峙l(fā)酵。(2)菌種丁酸梭菌(Clostridium butyricum) Gen100。(3)培養(yǎng)基同實(shí)施例2。(4)發(fā)酵過(guò)程種子培養(yǎng)同實(shí)施例2。種子擴(kuò)大培養(yǎng)同實(shí)施例2。5L發(fā)酵罐培養(yǎng)將擴(kuò)培的種子液以10%的接種量接種于裝有含70g/L廢甘油的2L發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵溫度控制在37°C，pH用濃度為4mol/L NaOH溶液自動(dòng)調(diào)節(jié)維持在7. 0，攪拌轉(zhuǎn)速150rpm,在發(fā)酵過(guò)程中向發(fā)酵罐中通氮?dú)?O. Ivvm)來(lái)維持發(fā)酵體系的厭氧條件。當(dāng)發(fā)酵液PH明顯上升(高于7. O)時(shí)，結(jié)束發(fā)酵，發(fā)酵時(shí)間為20h。(5)發(fā)酵結(jié)果發(fā)酵結(jié)束時(shí)，發(fā)酵液中1，3-丙二醇濃度34. 5g/L，生產(chǎn)強(qiáng)度I. 73g/L · h。實(shí)施例4 (I)發(fā)酵方式5L機(jī)械攪拌發(fā)酵罐，通氮?dú)夥峙l(fā)酵。(2)菌種丁酸梭菌(Clostridium butyricum) Gen160。(3)培養(yǎng)基同實(shí)施例2。(4)發(fā)酵過(guò)程種子培養(yǎng)同實(shí)施例2。種子擴(kuò)大培養(yǎng)同實(shí)施例2。5L發(fā)酵罐培養(yǎng)將擴(kuò)培的種子液以10%的接種量接種于裝有含70g/L廢甘油的2L發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵溫度控制在37°C，pH用濃度為4mol/L NaOH溶液自動(dòng)調(diào)節(jié)維持在7. 0，攪拌轉(zhuǎn)速150rpm,在發(fā)酵過(guò)程中向發(fā)酵罐中通氮?dú)?O. Ivvm)來(lái)維持發(fā)酵體系的厭氧條件。當(dāng)發(fā)酵液PH明顯上升(高于7. O)時(shí)，結(jié)束發(fā)酵，發(fā)酵時(shí)間為22h。
(5)發(fā)酵結(jié)果發(fā)酵結(jié)束時(shí)，發(fā)酵液中1，3-丙二醇濃度35. 3g/L，生產(chǎn)強(qiáng)度I. 60g/L · h。實(shí)施例5 (I)發(fā)酵方式5L機(jī)械攪拌發(fā)酵罐，發(fā)酵培養(yǎng)基不進(jìn)行滅菌，通氮?dú)夥峙l(fā)酵。(2)菌種同實(shí)施例4。(3)培養(yǎng)基同實(shí)施例2。(4)發(fā)酵過(guò)程種子培養(yǎng)同實(shí)施例2。 種子擴(kuò)大培養(yǎng)同實(shí)施例2。5L發(fā)酵罐培養(yǎng)將擴(kuò)培的種子液以10%的接種量接種于裝有含70g/L廢甘油的2L發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵溫度控制在37°C，pH用濃度為4mol/L NaOH溶液自動(dòng)調(diào)節(jié)維持在7. 0，攪拌轉(zhuǎn)速150rpm,在發(fā)酵過(guò)程中向發(fā)酵罐中通氮?dú)?O. Ivvm)來(lái)維持發(fā)酵體系的厭氧條件。當(dāng)發(fā)酵液PH明顯上升(高于7. O)時(shí)，結(jié)束發(fā)酵，發(fā)酵時(shí)間為22. 5h。(5)發(fā)酵結(jié)果發(fā)酵結(jié)束時(shí)，發(fā)酵液中1，3-丙二醇濃度35. Og/L,生產(chǎn)強(qiáng)度I. 56g/L · h。在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中，鏡檢所有樣品，未發(fā)現(xiàn)染菌現(xiàn)象。其發(fā)酵結(jié)果與正常滅菌發(fā)酵過(guò)程相差甚微。實(shí)施例6:(I)發(fā)酵方式IOL機(jī)械攪拌發(fā)酵罐，通氮?dú)夥峙l(fā)酵。(2)菌種丁酸梭菌(Clostridium butyricum) Gen160。(3)培養(yǎng)基同實(shí)施例2。(4)發(fā)酵過(guò)程種子培養(yǎng)同實(shí)施例2。種子擴(kuò)大培養(yǎng)同實(shí)施例2。IOL發(fā)酵罐培養(yǎng)將擴(kuò)培的種子液以10%的接種量接種于裝有含100g/L廢甘油的5L發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵溫度控制在37°C，pH用濃度為4mol/L NaOH溶液自動(dòng)調(diào)節(jié)維持在
7.O,攪拌轉(zhuǎn)速150rpm,在發(fā)酵過(guò)程中向發(fā)酵罐中通氮?dú)?O. Ivvm)來(lái)維持發(fā)酵體系的厭氧條件。當(dāng)發(fā)酵液PH明顯上升(高于7. O)時(shí)，結(jié)束發(fā)酵，發(fā)酵時(shí)間為29h。(5)發(fā)酵結(jié)果發(fā)酵結(jié)束時(shí)，發(fā)酵液中1，3-丙二醇濃度49. 5g/L，生產(chǎn)強(qiáng)度I. 70g/L · h。實(shí)施例7:(I)發(fā)酵方式5L機(jī)械攪拌發(fā)酵罐，通氮?dú)庋a(bǔ)料分批發(fā)酵，恒速補(bǔ)料。(2)菌種丁酸梭菌(Clostridium butyricum)GenO。(3)培養(yǎng)基種子培養(yǎng)基(/L)為同實(shí)施例2。發(fā)酵培養(yǎng)基(/L)為:廢甘油(甘油含量約90%w/w) ;KH2P04，1.2g;(NH4)2S04，2g;MgSO4 · 7Η20，0· 2g ；CaCl2 · 2Η20，0· 02g ;酵母粉，5g ;微量元素溶液，ImL ;Fe 溶液 ImL ；pH
7.O。所述Fe溶液(/L)為同實(shí)施例2。所述微量元素溶液(/L)為同實(shí)施例2。
(4)發(fā)酵過(guò)程種子培養(yǎng)同實(shí)施例2。種子擴(kuò)大培養(yǎng)同實(shí)施例2。5L發(fā)酵罐培養(yǎng)將擴(kuò)培的種子液以10%的接種量接種于裝有含45g/L廢甘油的2L發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵溫度控制在37°C，pH用濃度為4mol/L NaOH溶液自動(dòng)調(diào)節(jié)維持在7. 0，攪拌轉(zhuǎn)速150rpm,在發(fā)酵過(guò)程中向發(fā)酵罐中通氮?dú)?O. Ivvm)來(lái)維持發(fā)酵體系的厭氧條件。發(fā)酵過(guò)程中流加600g/L廢甘油，當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基中甘油濃度為20g/L時(shí)(即發(fā)酵開始8h時(shí))開始補(bǔ)料，補(bǔ)料速率為10. 8g/L，當(dāng)發(fā)酵液pH明顯上升(高于7. O)時(shí)，結(jié)束發(fā)酵，發(fā)酵時(shí)間為55h。 (5)發(fā)酵結(jié)果發(fā)酵結(jié)束時(shí)，發(fā)酵液中1，3-丙二醇濃度57.98/1，生產(chǎn)強(qiáng)度1.058/1·!!。實(shí)施例8:(I)發(fā)酵方式5L機(jī)械攪拌發(fā)酵罐，通氮?dú)庋a(bǔ)料分批發(fā)酵，恒速補(bǔ)料。(2)菌種丁酸梭菌(Clostridium butyricum) Gen160。(3)培養(yǎng)基種子培養(yǎng)基(/L)為同實(shí)施例2。發(fā)酵培養(yǎng)基(/L)為同實(shí)施例6。(4)發(fā)酵過(guò)程種子培養(yǎng)同實(shí)施例2。種子擴(kuò)大培養(yǎng)同實(shí)施例2。5L發(fā)酵罐培養(yǎng)將擴(kuò)培的種子液以10%的接種量接種于裝有含45g/L廢甘油的2L發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵溫度控制在37°C，pH用濃度為4mol/L NaOH溶液自動(dòng)調(diào)節(jié)維持在7. 0，攪拌轉(zhuǎn)速150rpm,在發(fā)酵過(guò)程中向發(fā)酵罐中通氮?dú)?O. Ivvm)來(lái)維持發(fā)酵體系的厭氧條件。發(fā)酵過(guò)程中流加600g/L廢甘油，當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基中甘油濃度為20g/L時(shí)(即發(fā)酵開始8h時(shí))開始補(bǔ)料，補(bǔ)料速率為10. 8g/L，當(dāng)發(fā)酵液pH明顯上升(高于7. O)時(shí)，結(jié)束發(fā)酵，發(fā)酵時(shí)間為50h。(5)發(fā)酵結(jié)果發(fā)酵結(jié)束時(shí)，發(fā)酵液中1，3-丙二醇濃度78. 5g/L，生產(chǎn)強(qiáng)度I. 57g/L · h。實(shí)施例9:(I)發(fā)酵方式5L機(jī)械攪拌發(fā)酵罐，發(fā)酵培養(yǎng)基不進(jìn)行滅菌，通氮?dú)庋a(bǔ)料分批發(fā)酵，恒速補(bǔ)料(2)菌種丁酸梭菌(Clostridium butyricum) Gen160(3)培養(yǎng)基種子培養(yǎng)基(/L)為同實(shí)施例2發(fā)酵培養(yǎng)基(/L)為同實(shí)施例6(4)發(fā)酵過(guò)程種子培養(yǎng)同實(shí)施例2種子擴(kuò)大培養(yǎng)同實(shí)施例25L發(fā)酵罐培養(yǎng)將擴(kuò)培的種子液以10%的接種量接種于裝有含45g/L廢甘油的2L發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵溫度控制在37°C，pH用濃度為4mol/L NaOH溶液自動(dòng)調(diào)節(jié)維持在7. 0，攪拌轉(zhuǎn)速150rpm,在發(fā)酵過(guò)程中向發(fā)酵罐中通氮?dú)?O. Ivvm)來(lái)維持發(fā)酵體系的厭氧條件。發(fā)酵過(guò)程中流加600g/L廢甘油，當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基中甘油濃度為20g/L時(shí)(即發(fā)酵開始8h時(shí))開始補(bǔ)料，補(bǔ)料速率為10. 8g/L，當(dāng)發(fā)酵液pH明顯上升(高于7. O)時(shí)，結(jié)束發(fā)酵，發(fā)酵時(shí)間為52h。(5)發(fā)酵結(jié)果 發(fā)酵結(jié)束時(shí)，發(fā)酵液中1，3-丙二醇濃度77. 3g/L，生產(chǎn)強(qiáng)度I. 49g/L · h。在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中，鏡檢所有樣品，未發(fā)現(xiàn)染菌現(xiàn)象。其發(fā)酵結(jié)果與正常滅菌發(fā)酵過(guò)程相差甚微。
權(quán)利要求
1.一種菌種，所述菌種為丁酸梭菌(Clostridium butyricum) Genl60,該菌種已于2012年07月05日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCCNo. 6317，地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵政編碼 100101。
2.如權(quán)利要求I所述的丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum)Genl60的篩選方法,其特征在于其具體步驟為 取采集樣品各lg，加入到9mL白菜汁中，37°C密封富集培養(yǎng)24h后置80°C水浴lOmin，殺死非芽孢菌，轉(zhuǎn)入梭菌增殖液體培養(yǎng)基，37°C厭氧培養(yǎng)24h再置80°C水浴lOmin，轉(zhuǎn)入發(fā)酵培養(yǎng)基，37°C厭氧選擇性富集培養(yǎng)24h后進(jìn)行高效液相色譜分析發(fā)酵產(chǎn)物，選取能夠生產(chǎn)1，3-丙二醇的陽(yáng)性菌；再采用高層瓊脂柱法，分離出單菌落；同時(shí)進(jìn)行好氧和厭氧培養(yǎng)，除去兼性厭氧菌，得到嚴(yán)格厭氧菌，分析發(fā)酵產(chǎn)物，選取能夠生產(chǎn)1，3-丙二醇和培養(yǎng)特征、菌落形態(tài)均符合丁酸梭菌培養(yǎng)特征的菌株進(jìn)行16S rDNA序列分析鑒定。
3.如權(quán)利要求2所述的丁酸梭菌(Ciostridiumbutyricum)Genl60的篩選方法,其特征在于所述梭菌增殖液體培養(yǎng)基為胰蛋白胨，10g/L ;牛肉膏，10g/L ;酵母粉，3g/L ;葡萄糖，5g/L ;NaCl，3g/L ；NaAc,3g/L ;可溶性淀粉，lg/L ;半胱氨酸鹽酸鹽，O. 5g/L ；pH 7. 5。
4.如權(quán)利要求2所述的丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum)Genl60的篩選方法,其特征在于所述高層瓊脂柱培養(yǎng)法的具體步驟為加熱融化10管加入Vc的RCM固體培養(yǎng)基，每管9mL培養(yǎng)基，待冷至80°C，在第I管中接入ImL菌液，充分振蕩均勻后，迅速將其ImL培養(yǎng)基倒入第2管，充分振蕩均勻后將其ImL培養(yǎng)基倒入第3管，依次稀釋至第10管，將試管放入冰中，迅速冷卻，待瓊脂凝固，每管加入2. 5mL滅菌的液體石蠟，置37°C恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)24h，用接種環(huán)挑選單菌落于無(wú)菌水中，振蕩混勻，用無(wú)菌注射器分別轉(zhuǎn)入RCM液體培養(yǎng)基血清瓶中，37 0C、150rpm搖床培養(yǎng)36h。
5.如權(quán)利要求I所述的丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum)Genl60的改造方法,其特征在于其具體步驟為 將丁酸梭菌(Clostridium butyricum) Genl60接入含有甘油的種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)10 20h，然后以4% 10%的接種量接種于含廢甘油濃度50g/L的發(fā)酵培養(yǎng)基的血清瓶中進(jìn)行搖瓶厭氧培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為31 39°C,發(fā)酵培養(yǎng)基中加入7 15g/L碳酸I丐以維持穩(wěn)定的pH，培養(yǎng)12 24h后，以4% 10%的接種量接種于另一瓶同樣培養(yǎng)基成分的血清瓶中，如此循環(huán)20次，將菌種保存于生長(zhǎng)培養(yǎng)基中并于4°C冰箱保存，得到丁酸梭菌第20代菌株，記作Gen20 ;依次提高廢甘油濃度70、80、90、100g/L，分別采用上述步驟進(jìn)行不斷傳代培養(yǎng)，每種條件培養(yǎng)20代，分別記為Gen40、60、80、100 ;在GenlOO基礎(chǔ)上，依次提高抑制菌體生長(zhǎng)的副產(chǎn)物丁酸濃度15、20、25g/L，分別采用上述步驟進(jìn)行不斷傳代培養(yǎng)，每種條件培養(yǎng)20代，分別記為Genl20、140、160 ;分別在分批發(fā)酵和補(bǔ)料分批發(fā)酵條件下對(duì)比保存菌株，擇優(yōu)進(jìn)行單菌落的分離，利用高層瓊脂柱法挑選出純菌株。
6.如權(quán)利要求5所述的丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum)Genl60的改造方法,其特征在于所述種子培養(yǎng)基為甘油，20g/L ；K2HPO4 · 3Η20，4· 45g/L ；KH2PO4,1. 3g/L ； (NH4)2SO4,2g/L ；MgS04 · 7H20，0. 2g/L ；CaCl2 · 2H20，0. 02g/L ;酵母粉，lg/L ;微量元素溶液，ImL ；Fe 溶液，ImL ;自然pH。
7.如權(quán)利要求5所述的丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum)Genl60的改造方法,其特征在于所述發(fā)酵的溫度為31 39°C;所述發(fā)酵的攪拌速度可為100 300rpm ;所述發(fā)酵體系的PH值可為6. O 8. O ;所述發(fā)酵的時(shí)間可為12 60h ;所述發(fā)酵的接種量的體積百分比可為4% 10%ο
8.如權(quán)利要求5所述的丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum)Genl60的改造方法,其特征在于所述發(fā)酵培養(yǎng)基為廢甘油30 120g/L ；K2HPO4 ·3Η20，0· I 2. Og/L ；KH2PO4,0. I .2. Og/L ； (NH4)2SO4,0. 5 5. Og/L ；MgS04 · 7Η20，0· I I. Og/L ；CaCl 2 · 2Η20，0· 01 0. 2g/L ;酵母粉，0. 5 5. 0g/L ;微量元素溶液，ImL ；Fe溶液ImL0
9.如權(quán)利要求5所述的丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum) Genl60的改造方法,其特征在于所述Fe溶液為FeS04 · 7H20,1 10g/L ；HCl,4mL ;所述微量元素溶液為ZnCl2，.0. 01 0. 2g/L ；MnCl2 · 4Η20，0· 01 0. 2g/L ;Η3Β03，0· 01 O. lg/L ；CoCl2 · 6Η20，0· I .0. 5g/L ；CuCl2 ·2Η20，0· 01 0. 05g/L ；NiCl2 ·6Η20，0· 02 0. 05g/L ；Na2MoO4 ·2Η20，0· 01 .0.06g/L ；HC1,0. 9mL。
10.如權(quán)利要求I所述丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum)Genl60在利用廢甘油生產(chǎn).1,3-丙二醇中的應(yīng)用。
全文摘要
一種生產(chǎn)1,3-丙二醇的菌株篩選方法與應(yīng)用，涉及1,3-丙二醇。提供丁酸梭菌(Clostridium butyricum)Gen160以及利用廢甘油生產(chǎn)1,3-丙二醇的菌株篩選方法與應(yīng)用。步驟為取采集樣品加入到白菜汁中，富集培養(yǎng)后置水浴，殺死非芽孢菌，轉(zhuǎn)入梭菌增殖液體培養(yǎng)基，厭氧培養(yǎng)再置水浴，轉(zhuǎn)入發(fā)酵培養(yǎng)基，厭氧選擇性富集培養(yǎng)后進(jìn)行高效液相色譜分析發(fā)酵產(chǎn)物，選取能生產(chǎn)1,3-丙二醇的陽(yáng)性菌；采用高層瓊脂柱法分離出單菌落；進(jìn)行好氧和厭氧培養(yǎng)，除去兼性厭氧菌，得到嚴(yán)格厭氧菌，分析發(fā)酵產(chǎn)物，選取能夠生產(chǎn)1,3-丙二醇和培養(yǎng)特征、菌落形態(tài)均符合丁酸梭菌培養(yǎng)特征的菌株進(jìn)行16S rDNA序列分析鑒定。
文檔編號(hào)C12R1/145GK102965323SQ20121056867
公開日2013年3月13日 申請(qǐng)日期2012年12月24日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月24日
發(fā)明者方柏山, 陳斌, 朱春杰, 王世珍 申請(qǐng)人:廈門大學(xué)