專利名稱：(r)-4-氰基-3-羥基丁酸乙酯的生物制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物制藥和綠色化學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種(R) -4-氰基-3-羥基丁酸乙酯的生物制備方法
背景技術(shù)：
阿托伐他汀(atorvastatin,商品名立普妥，Lipitor)是世界上第一個(gè)年銷售額超過(guò)百億美元的藥品。它通過(guò)抑制羥甲基戊二酰CoA還原酶，阻礙肝臟中膽固醇合成的限速步驟來(lái)降低血液中膽固醇的含量?，F(xiàn)在工藝的關(guān)鍵步驟是利用(S)-4_氯-3-羥基丁酸乙酯(A4) —步法合成(R) -4-氰基-3-羥基丁酸乙酯(A5) (Angew. Chem.1nt. Ed. 2005，44:362-365)。 在該步反應(yīng)中，由于生物法避免了化學(xué)法中存在的堿性條件下形成副產(chǎn)物過(guò)多，分離純化困難的缺點(diǎn)，因此利用齒代醇脫齒酶(halohydrin dehalogenase, HHDH)從A4合成A5的工藝已經(jīng)被研究。美國(guó)專利US 7125693和US 7132267公布了 Codexis公司對(duì)于該項(xiàng)目的研究，其酶投料量為底物的1.5%(w/w)，粗收率為93%。之后國(guó)內(nèi)的專利CN102168117A對(duì)該工藝進(jìn)行了改良，實(shí)現(xiàn)了氰化鈉的回收利用，但是其酶投料量高達(dá)底物的8. 0%(w/w)，粗收率僅為 83. 8%ο綜合以上文獻(xiàn)檢索信息，我們發(fā)現(xiàn)目前存在的工藝中，存在著酶用量過(guò)高，反應(yīng)條件不適當(dāng)?shù)热毕荨?br>
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種改進(jìn)的(R)-4_氰基-3-羥基丁酸乙酯的生物制備方法。為解決以上技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案一種(R)-4_氰基-3-羥基丁酸乙酯的生物制備方法，其以(S)-4_氯-3-羥基丁酸乙酯為底物，該底物在生物催化劑的作用下，與氰化鈉反應(yīng)生成目標(biāo)產(chǎn)物(R)-4-氰基-3-羥基丁酸乙酯，所述的生物催化劑為重組鹵代醇脫鹵酶，所述的重組鹵代醇脫鹵酶的制備方法為將鹵代醇脫鹵酶單菌落接種到含氨芐青霉素抗性的液體LB培養(yǎng)基中，于30-40°C下?lián)u床活化8-12小時(shí)，將活化后得到的培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接到含氨芐青霉素抗性的液體LB培養(yǎng)基中，于30-40°C下擴(kuò)大培養(yǎng)至0D600值達(dá)到O. 6-0. 8，加入誘導(dǎo)劑，于25_35°C繼續(xù)培養(yǎng)8-12小時(shí)，離心收集沉淀物，加入磷酸鹽緩沖液得懸浮液，將懸浮液置于冰浴中超聲波破碎8-12分鐘，再離心，分離上清液，將上清液預(yù)凍至溫度為-1(T-25°C，然后再凍干24-48小時(shí)，即得重組鹵代醇脫鹵酶，所述的反應(yīng)在PH為6-8的水相中進(jìn)行。進(jìn)一步地，在起始時(shí)的反應(yīng)體系中，所述的底物(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯的濃度為150-200mg/ml，所述的重組鹵代醇脫鹵酶為底物(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯的O.4-1% (w/w)0進(jìn)一步地,在起始時(shí)的反應(yīng)體系中,所述的氰化鈉與所述的底物(S)-4-氯-3-輕基丁酸乙酯的摩爾比為1. 5-2. 5:1。進(jìn)一步地，反應(yīng)結(jié)束后底物的轉(zhuǎn)化率為98-100%，產(chǎn)物光學(xué)純度大于99%，純度大于 97%。優(yōu)選地，所述的反應(yīng)在pH為7. O的水相中進(jìn)行。優(yōu)選地，所述的反應(yīng)中所述的重組鹵代醇脫鹵酶為底物(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯的 O. 5% (w/w)0優(yōu)選地，所述的反應(yīng)中底物(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯的濃度為200mg/ml。
優(yōu)選地，所述的誘導(dǎo)劑為異丙基_β-D-硫代半乳糖苷或乳糖。進(jìn)一步地，所述的制備方法的實(shí)施過(guò)程如下在反應(yīng)容器中依次加入水，底物
(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯，攪拌均勻后慢慢滴加氰化鈉溶液，再加入重組鹵代醇脫鹵酶，在40-60°C下攪拌反應(yīng)，利用GC檢測(cè)反應(yīng)進(jìn)程，待轉(zhuǎn)化率大于98%時(shí)，加入硫酸調(diào)節(jié)pH至2-3，加入乙酸乙酯萃取，合并有機(jī)相，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)即得(R)-4-氰基-3-羥基丁酸乙酯產(chǎn)品。根據(jù)本發(fā)明，除重組鹵代醇脫鹵酶，其余原料均可由通用渠道商購(gòu)獲得。本發(fā)明的有益效果在于本發(fā)明通過(guò)采用重組鹵代醇脫鹵酶催化反應(yīng)并通過(guò)對(duì)工藝的優(yōu)化，使得底物濃度提高，酶用量降低，從而降低了生產(chǎn)成本，并且使得產(chǎn)品的純度和收率都有所提高。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明的反應(yīng)式如下
權(quán)利要求
1.一種(R)-4-氰基-3-羥基丁酸乙酯的生物制備方法，其以(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯為底物，該底物在生物催化劑的作用下，與氰化鈉反應(yīng)生成目標(biāo)產(chǎn)物(R)_4-氰基-3-羥基丁酸乙酯，其特征在于所述的生物催化劑為重組鹵代醇脫鹵酶，所述的重組鹵代醇脫鹵酶的制備方法為將鹵代醇脫鹵酶單菌落接種到含氨芐青霉素抗性的液體LB培養(yǎng)基中，于30-40°C下?lián)u床活化8-12小時(shí)，將活化后得到的培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接到含氨芐青霉素抗性的液體LB培養(yǎng)基中，于30-40°C下擴(kuò)大培養(yǎng)至0D600值達(dá)到O. 6-0. 8，加入誘導(dǎo)劑，于25-35°C繼續(xù)培養(yǎng)8-12小時(shí)，離心收集沉淀物，加入磷酸鹽緩沖液得懸浮液，將懸浮液置于冰浴中超聲波破碎8-12分鐘，再離心，分離上清液，將上清液預(yù)凍至溫度為-1(T-25°C，然后再凍干24-48小時(shí)，即得重組鹵代醇脫鹵酶，所述的反應(yīng)在pH為6-8的水相中進(jìn)行。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的(R)-4-氰基-3-羥基丁酸乙酯的生物制備方法，其特征在于在起始時(shí)的反應(yīng)體系中，所述的底物(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯的濃度為150-200 mg/ml，所述的重組鹵代醇脫鹵酶為底物(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯的O. 4-1% (w/w)0
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的(R)-4-氰基-3-羥基丁酸乙酯的生物制備方法，其特征在于在起始時(shí)的反應(yīng)體系中，所述的氰化鈉與所述的底物(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯的摩爾比為1. 5-2. 5:1。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的(R)-4-氰基-3-羥基丁酸乙酯的生物制備方法，其特征在于所述的反應(yīng)在pH為7. O的水相中進(jìn)行。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的(R)-4-氰基-3-羥基丁酸乙酯的生物制備方法，其特征在于所述的誘導(dǎo)劑為異丙基_β -D-硫代半乳糖苷或乳糖。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的(R)-4-氰基-3-羥基丁酸乙酯的生物制備方法，其特征在于所述的制備方法的實(shí)施過(guò)程如下在反應(yīng)容器中依次加入水，底物(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯，攪拌均勻后慢慢滴加氰化鈉溶液，再加入重組鹵代醇脫鹵酶，在40-60°C下攪拌反應(yīng)，利用GC檢測(cè)反應(yīng)進(jìn)程，待轉(zhuǎn)化率大于98%時(shí)，加入硫酸調(diào)節(jié)pH至2-3，加入乙酸乙酯萃取，合并有機(jī)相，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)即得(R)-4-氰基-3-羥基丁酸乙酯產(chǎn)品。
全文摘要
一種(R)-4-氰基-3-羥基丁酸乙酯的生物制備方法，其以(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯為底物，該底物在生物催化劑的作用下，與氰化鈉反應(yīng)生成目標(biāo)產(chǎn)物(R)-4-氰基-3-羥基丁酸乙酯，所述的生物催化劑為重組鹵代醇脫鹵酶，所述的反應(yīng)在pH為6-8的水相中進(jìn)行。本發(fā)明通過(guò)采用重組鹵代醇脫鹵酶，使得底物濃度提高，酶用量降低，從而降低了生產(chǎn)成本，并且本發(fā)明通過(guò)對(duì)工藝的優(yōu)化，使得產(chǎn)品的純度和收率都有所提高。
文檔編號(hào)C12P13/00GK103014082SQ20121055637
公開(kāi)日2013年4月3日 申請(qǐng)日期2012年12月20日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月20日
發(fā)明者鞠鑫, 尹將來(lái), 張超 申請(qǐng)人:蘇州漢酶生物技術(shù)有限公司