專利名稱：赤星病菌對二甲酰亞胺類殺菌劑抗藥性的分子檢測方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種赤星病菌對二甲酰亞胺類殺菌劑抗藥性的分子檢測方法，屬于分子生物學和植物病理學領域。
背景技術：
煙草赤星病是普遍存在于世界各個煙葉生產(chǎn)國家，而且危害很大的一種廣譜性植物病害，其病原菌是鏈格孢菌[Alternaria alternate(Freis)Kissler]。鏈格孢菌除引起煙草赤星病外，還引起多種其他植物病害。該病菌使其宿主植物(果樹、蔬菜、農(nóng)作物、經(jīng)濟作物等)的葉子和果實產(chǎn)生黑斑，造成葉子的枯萎和果實的過早成熟脫落，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來嚴重危害。二甲酰亞胺類殺菌劑(包括乙烯菌核利、菌核凈、速克靈、撲海因等)是20世紀70年代初推出的一類廣譜性觸殺型保護性殺菌劑，因其殺菌譜廣，防治效果顯著等特點，已被廣泛應用于防治多種植物病原真菌。然而隨著二甲酰亞胺類殺菌劑的普遍應用，煙草赤星病菌等鏈格孢菌的抗藥性逐步產(chǎn)生，且有越來越嚴重的趨勢，使得二甲酰亞胺類殺菌劑的防止效果急劇下降甚至完全失效，造成了重大的經(jīng)濟損失。為了快速檢測煙草赤星病菌等鏈格孢菌對這類藥劑是否產(chǎn)生了抗性，指導殺菌劑的合理使用，克服或延緩抗藥性產(chǎn)生，以及更好地研究開發(fā)新型殺菌劑，只有通過深入了解這類藥劑對鏈格孢菌的分子機制以及病原菌對其產(chǎn)生抗藥性的分子機制，闡明鏈格孢菌對這類殺菌劑的抗藥性機理，才能達到預期的目的。前期研究發(fā)現(xiàn)，該類病原真菌細胞中雙組分組氨酸蛋白激酶基因的突變介導著這類病原真菌對二甲酰亞胺類殺菌劑的抗性，所以建立一種把這類病原真菌細胞中的雙組分組氨酸蛋白激酶基因快速擴增的方法，用來快速檢測該類病原真菌是否產(chǎn)生了抗性，就顯得非常的重要了。
目前克隆雙組分組氨酸蛋白激酶基因的方法是建立cDNA文庫，通過雜交篩選得到全長編碼基因，這種方法的特點是難度大，時間長，而且費用極高。
經(jīng)文獻檢索，未發(fā)現(xiàn)與本發(fā)明內(nèi)容相同文獻的公開報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術之不足，通過基因克隆的方法，研究開發(fā)一種經(jīng)濟快速檢測煙草赤星病菌是否對二甲酰亞胺類殺菌劑產(chǎn)生抗性的新方法。
本發(fā)明根據(jù)2004年Ian B.Dry等人發(fā)表在Fungal genetic and biology上的文章(Dicarboximide resistance in field isolates of Alternaria alternata is mediated by a mutationin a two-component histidine kinase gene)中所克隆的部分長度雙組分組氨酸蛋白激酶基因序列，應用DNAWalking SpeedUpTMPremix試劑盒，用Primer Premier 5軟件設計特異性引物，通過三次PCR擴增，5’端一次，3’端兩次，將PCR擴增片段純化出來并和pMD18-T載體連接，然后通過轉(zhuǎn)化，將含有目的片段的克隆子培養(yǎng)液送測序公司測序，將三次測序結(jié)果和Ian B.Dry等人發(fā)表的部分長度的雙組分組氨酸蛋白激酶基因序列拼接，然后在NCBI(美國國立生物技術信息中心，http//www.ncbi.nlm.nih.gov/)進行檢索，確定得到了一株敏感型煙草赤星病菌13-3菌株的雙組分組氨酸蛋白激酶基因的全序列SEQ IDNO.1。
然后根據(jù)該全序列，應用Primer Premier 5軟件，在全序列5’端和3’端設計特異性引物(AaHKFp I5’-CTGTCCATCTTGCCCGTTCC-3’；AaHKRp II5’-CGGCTAAAACAGTTCTT TCGGTA-3’)，應用高保真的primeSTARTMHS DNA聚合酶(TAKARA)，對全基因進行PCR擴增，產(chǎn)物直接送測序公司測序?？焖倌玫搅?株敏感(13-3)，2株抗性菌株(Bt40和R41)煙草赤星病菌的雙組分組氨酸蛋白激酶基因，它們的全序列分別為SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.5。另外，據(jù)文獻報導，鏈格孢菌(包括煙草赤星病菌)等病原真菌的雙組分組氨酸蛋白激酶由一個激酶區(qū)，一個反應調(diào)節(jié)區(qū)以及N端的六個90氨基酸的重復區(qū)組成。敏感菌和抗性菌的主要區(qū)別是敏感菌在N端的氨基酸的重復區(qū)發(fā)生了突變，使敏感菌變成了抗性菌。
為了快速得到N端的六個90氨基酸的重復區(qū)，我們根據(jù)雙組分組氨酸蛋白激酶基因全序列SEQ ID NO.1，應用Primer Premier 5軟件，在氨基酸重復區(qū)的5’端和3’端，設計另一對特異性引物(HKFwd5’-AGGCTGACAGACAACAGACAA-3’；HKRev5’-CGAGCGTAAGTTGGGTCAT-3’)，單獨對N端的六個90氨基酸的重復區(qū)進行PCR擴增，產(chǎn)物直接送測序公司測序后分別獲得了敏感菌株13-3，抗性菌株Bt40和R41的N端六個90氨基酸的重復區(qū)序列SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.6。
DNA Walking SpeedUpTMPremix試劑盒的使用如下DNA Walking SpeedUpuTMPremix試劑盒是韓國Seegene公司的產(chǎn)品，他主要是用來擴增已知序列兩端的未知序列。DNA Walking SpeedUpTMPremix試劑盒包括PCR Master混合液和用來捕獲已知序列兩端未知序列中目的位點的高度特異性DNA Walking ACP(DW-ACP)引物。試劑盒里的引物包括第一次PCR引物DW-ACP15′-ACP-AGGTC-3′；DW-ACP25′-ACP-TGGTC-3′；DW-ACP35′-ACP-GGGTC-3′；DW-ACP45′-ACP-CGGTC-3′；第二次PCR引物DW-ACPN5′-ACPN-GGTC-3′；以及第三次PCR引物Uni-primer5′-TCACAGAAGTATGCCAAGCGA-3′。應用DNA Walking SpeedUpTMPremix試劑盒，需要根據(jù)已知序列設計三組特異性引物(TSP1，TSP2，TSP3)，分別與試劑盒里的三次PCR引物組成一對PCR引物。擴增的過程包括三次PCR，第一次PCR用DW-ACP1/2/3/4四種引物的一種與TSP1，PCR Master混合液，模板DNA和滅菌水，配成50ul的反應體系，進行第一次PCR擴增，第二次PCR用DW-ACPN引物與TSP2，PCRMaster混合液，純化的第一次PCR產(chǎn)物和滅菌水，配成20ul的反應體系，進行第二次PCR擴增，第三次PCR用Uni-primer與TSP3，PCR Master混合液，第二次PCR產(chǎn)物和滅菌水，配成20ul的反應體系，進行第三次PCR擴增，然后從第三次PCR產(chǎn)物中收集目的條帶進行后續(xù)實驗。本發(fā)明用于三次DNA Walking的引物序列如下(表1)表1 用于擴增雙組分組氨酸蛋白激酶基因的DNA Walking引物

表1中所設計的引物用途說明如下DW-ACP1/2/3/4，DW-ACPN和Uni-primer分別是試劑盒里三次PCR的引物，其中DW-ACP1/2/3/4的1，2，3，4分別代表四種DW-ACP引物中的一種。TSP1，TSP2和TSP3是根據(jù)已知序列設計的分別與試劑盒里的三次PCR引物相對應的特異性引物。
應用Primer Premier 5軟件，將野生型敏感鏈格孢菌13-3，野生型抗性鏈格孢菌Bt40和R41的cDNA序列翻譯成氨基酸，然后用DNAman軟件比對氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)在抗性菌的N端六個90氨基酸重復區(qū)存在突變。在抗性菌Bt40氨基酸的420位，氨基酸由甘氨酸突變成天冬氨酸；在抗性菌R41中，氨基酸從582到688缺失。比對圖如附圖所示。
本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的真菌培養(yǎng)，從菌絲中提取基因組DNA作為模板，應用DNA Walking SpeedUpTMPremix試劑盒和以上設計的DNA Walking引物進行PCR擴增，擴增片段測序，將測序結(jié)果拼接處理，然后將拼接的全序列在NCBI中利用BLAST N(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)進行檢索，根據(jù)檢索結(jié)果判斷擴增序列的性質(zhì)，然后，在全序列的5’端和3’端和N端六個90氨基酸重復區(qū)的5’端和3’端分別設計特異性引物，對雙組分組氨酸蛋白激酶全基因和N端六個90氨基酸重復區(qū)快速擴增，擴增片段測序，測序結(jié)果在NCBI中利用BLASTN(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)進行檢索，根據(jù)檢索結(jié)果判斷擴增序列的性質(zhì)。
1、真菌的分離與培養(yǎng)按常規(guī)的方法分離目的真菌，將目的真菌保存到-20℃的冰箱里。植物病原真菌一般用PDA培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，不同真菌的營養(yǎng)要求可能有所差異，本發(fā)明不做特殊要求。等菌絲長好以后，用常規(guī)的封口塑料袋收集，并用液體氮氣進行速凍，速凍的菌絲可以放在-70℃進行長期保存。
2、真菌基因組DNA的提取以常用的CTAB(十六烷基三甲基溴化銨)法進行提取，常規(guī)的提取步驟如下1)收集在平板或者液體培養(yǎng)基中新鮮菌絲；2)用液氮研磨或者用石英砂研磨(100mg石英砂，100mg菌體，300ml CTAB溶液)，菌體磨好后再加300ml CTAB溶液，混合均勻；3)65℃水浴1小時，20分鐘翻轉(zhuǎn)一次；如果要除去RNA，可以在水浴40分鐘的時候加入1μl的RNA酶(10mg/ml)；4)加入300μl苯酚和300μl三氯甲烷，混合均勻；5)6500rpm離心30分鐘；6)把上清溶液轉(zhuǎn)移到新的EP管中，注意不要吸到中間的沉淀物質(zhì)，在上清液中加入300μl苯酚和300μl三氯甲烷，混合均勻；7)6500rpm離心20分鐘；8)把上清溶液轉(zhuǎn)移到新的EP管中，加入0.5倍體積的異丙醇或2倍體積的乙醇，混合均勻；9)12000rpm離心5分鐘，棄上清；10)沉淀用70％的乙醇清洗兩遍；11)把殘余的乙醇真空抽干，加入20-30μl的水溶解沉淀；12)取2-3μl樣品電泳檢測(1％agarose)，DNA樣品-20℃保存?zhèn)溆谩?br> 3、PCR擴增把基因組DNA稀釋5-20倍(根據(jù)提取質(zhì)量)，利用以上所設計的引物配制PCR反應體系，PCR擴增程序采用降落(Touch-down)PCR程序。
(1)應用DNA Walking SpeedUpTMPremix試劑盒擴增第一次PCR1)PCR擴增體系


2)降落(Touch-down)PCR程序

第二次PCR1)PCR擴增體系

2)降落(Touch-down)PCR程序

第三次PCR1)PCR擴增體系

2)降落(Touch-down)PCR程序

純化第一次PCR產(chǎn)物用的是e.z.N.ATM.cycle-pure試劑盒，最后用35μl水洗脫。
(2)應用特異引物AaHKFp I和AaHKRp II對雙組分組氨酸蛋白激酶全基因擴增1)PCR擴增體系

2)降落(Touch-down)PCR程序

(3)應用特異引物HKFwd和HKRev對雙組分組氨酸蛋白激酶的N端六個90氨基酸重復區(qū)進行擴增1)PCR擴增體系

2)降落(Touch-down)PCR程序

4、PCR擴增片段測序直接把PCR擴增產(chǎn)物直接送給專業(yè)的公司進行測序，或者把PCR擴增片段純化出來并和商業(yè)化的測序載體連接，再送給專業(yè)的公司進行測序。
5、測序結(jié)果分析測序結(jié)果出來后，可以利用NCBI上的核苷酸序列同源性分析工具BLAST N(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)進行分析，根據(jù)檢索結(jié)果判斷擴增序列是否是雙組分組氨酸蛋白激酶的編碼基因或者是雙組分組氨酸蛋白激酶N端六個90氨基酸重復區(qū)，然后用DNAman軟件比對測試菌和敏感菌13-3的氨基酸序列，如發(fā)現(xiàn)兩者不同，說明測試菌已產(chǎn)生了抗性。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比，具有準確、快捷、簡便、經(jīng)濟等優(yōu)點。


附圖是抗性菌的N端六個90氨基酸重復區(qū)中氨基酸缺失的比對圖。
具體實施例方式以下是本發(fā)明的實施例，但本發(fā)明的內(nèi)容并不局限于此。實施例的詳細步驟同發(fā)明內(nèi)容部分所述。
實施例一煙草赤星病菌(Alternaria.alternata)Bt40菌株對二甲酰亞胺類殺菌劑抗藥性的分子檢測將野生型抗性鏈格孢菌Bt40菌株接種到PDA平板上，26℃培養(yǎng)6-8天，收集菌絲并提取基因組DNA，以該基因組DNA作為模板，用引物AaHKFp I和AaHKRp II進行擴增得到雙組分組氨酸蛋白激酶基因SEQ ID NO.3。然后用引物HKFwd和HKRev進行擴增得到雙組分組氨酸蛋白激酶基因的N端六個90氨基酸重復區(qū)序列SEQ ID NO.4。然后用DNAman軟件比對測試菌和敏感菌13-3的氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)抗性菌Bt40氨基酸的420位氨基酸由甘氨酸突變成天冬氨酸，說明測試菌對二甲酰亞胺類殺菌劑產(chǎn)生了抗性。
實施例二煙草赤星病菌(Alternaria.alternata)R41菌株對二甲酰亞胺類殺菌劑抗藥性的分子檢測將野生型抗性鏈格孢菌R41菌株接種到PDA平板上，26℃培養(yǎng)6-8天，收集菌絲并提取基因組DNA，以該基因組DNA作為模板，用引物AaHKFp I和AaHKRp II進行擴增得到雙組分組氨酸蛋白激酶基因SEQ ID NO.5。然后用引物HKFwd和HKRev進行擴增得到雙組分組氨酸蛋白激酶基因的N端六個90氨基酸重復區(qū)序列SEQ ID NO.6。然后用DNAman軟件比對測試菌和敏感菌13-3的氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)抗性菌R41中氨基酸從582到688缺失，說明測試菌對二甲酰亞胺類殺菌劑產(chǎn)生了抗性。
SEQ ID NO1SEQUENCE LISTING<110>云南省煙草科學研究所<120>赤星病菌對二甲酰亞胺類殺菌劑抗藥性的分子檢測方法<130>01<160>1<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>4302<212>DNA<213>Alternaria alternata<220>
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SEQ ID NO2SEQUENCE LISTING<110>云南省煙草科學研究所<120>赤星病菌對二甲酰亞胺類殺菌劑抗藥性的分子檢測方法<130>01<160>1<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1745<212>DNA<213>Alternaria alternata<220>
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SEQ ID NO3SEQUENCE LISTING<110>云南省煙草科學研究所<120>赤星病菌對二甲酰亞胺類殺菌劑抗藥性的分子檢測方法<130>01<160>1<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>4302<212>DNA<213>Alternaria alternata<220>
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<400>1atggccgcag agacgtactc gagcgtctca gccatcatcc gcaacctcgc ccgccaacac 60gaccctacgc gagaccccag cttcagcgca caagtttctg ccaacggagc caagacggct120gcaaatgcca tcgcgctgcc aggcccggag agcgaggaga agacgcaact agagcaggag180ctgtcggcgc tatgctcaag aatagacttt ctcgagcaca agagcagcca tgctccaaac240cagcagggcc agttccctct gacacccgca caagagccgc ccgaggaggg cgcgttatat300actccagcag gagtcttccg cggcaatagc ggcccacccg cccaaggacg tcgtggatcc360aacaaggagc gcgccatctg ggtctccaac tggctcgccg ccaaggagtc gaatggcgac420ccagaacagc ccgcggcagc ccttaccgaa gagcagctca actacctgcg agtgcacttg480aaccagcaag ccgaccagat tagaaaccag cgcgagcaca ttggtgggag cccacagaag540acctctgcat gcgcccaggc tgacagacaa cagacaacct aagccaggaa gtgaataagc600aactaacgac acagagcatg gtattcgaac atggcattga ggacatcggc gcactgaaaa660gggaactcgg caagcatcaa cagggtatgc tctatagtct tgaaaaggca acgttgtggc720tgacatttca cagccaacct ggctttccaa aaggcactgc gggaaatcgg cgccatcgtc780actgccgtcg ctatgggtga cttgagcaag aaggtcttga ttcatgctaa ggagatggac840cctgaaatca ccctgttcaa gcgcacgatc aacaccatgg tggaccagct ccaggagttt900gccagtcaag tcacgttcct cgctcgagag gtcggtaccg aaggcagatt gggcggtcaa960gccaacctac caggagttgc tggtatttgg gctgagctga ctgacagtgg tacgttgtga1020ttagggttcc actatcgggc cgatgctaac gtgtcctgca gttaatggga tggccaagaa1080tcttaccgac caggtgcgag agatcgccgt agtcacaacc gctgtcgcta tgggcgatct1140cagtcgtaag attgagcgtc cggcccgagg agaaatcttg cagctgcaac agacgatcaa1200cagcatggtg gatcaactgc aatcatttgc tacccaggtc accaaagtcg ctagagatgt1260cggaactgaa ggcaagcttg gtggtcaggc tgagattgct ggcgtcaagg gcatgtggaa1320cgaattgaca gtgaatgtga acgccatggc tcaaaacctc accacccagg tgcgagacat1380cgcccaggtc acaacggccg tcgcacagga taacctcaca cggaaggtcg aagccgaatg1440caagggtgaa atcttggaac tcaagaacac aatcaatcgc atggtggacc agctgcagca1500gtttgctcac gaagtcacca agattgcgcg agaggtcgga tctgagggtc gacttggtgg1560acaggctaca gtgcatggcg ttgagggtac ctggaaagat ctcactgaga atgtgaacgg1620tatggccatg aacctcacaa cacaagtgcg agaaatcgcc gaagtcacta cagccgtcgc1680aagaggagat ctcagcagga aggtcaaggc agaagttcag ggtgagattt tgtcacttaa1740gattaccatc aacaccatgg tggaccgctt gaacacgttt gcacaagagg ttagcaaggt1800
SEQ ID NO3cgcccgtgag gtcggaaccg acggtattct gggcggccaa gcacaggtcg acaacgttga1860gggcaagtgg aaggatctga ccaacaatgt caacactatg gctcagaatc tcacgctgca1920agtacgaagt atttccgagg tcacccaggc catcgccaag ggagacatga gccgcagagt1980tcacgtggac gccgagggag agatccgatt actcaaagac accgtcaacg acatggttat2040gagactcgac gaatggtctc tagctgtgaa gcgtgtagct cgcgatgtag gcgtagacgg2100aaagatgggc ggtcaagcag acgtgagaga tatcgacggc cgatggaaag aaatcaccac2160agacgtcaac accatggccc agaaccttac gtcacaagtg cgtgctttcg gtgacatcac2220caacgctgca atggagggca agttcactca aatcaccgtc gaggcttctg gtgagatgga2280tgaattgaag aggaagatca accagatggt gtccagtttg cgagagagta ttcaaagaaa2340cacggctgcg agggaagcag ccgagttggc caacaaaaca aaatccgagt tcctcgccaa2400catgtctcac gagatccgaa cgcccatgaa cggtatcatt ggaatgaccc aacttacgct2460cgacaccgac cttacgcatg cgcaacgaga gatgttgacc attgttcata atctggctgg2520tcaattactg acaatcatcg acgatatcct tgatatctcc aagatcgagg cgaaccgcat2580ggtaatggaa gagattccat tctcaatgcg cggcactata ttcaacgcac tcaagtcatt2640agcatcaaga gccaacgagc ggaagttgaa ccttgcttac gacgtctctt acaaggtgcc2700cgactacgtt gttggtgatt ccttcaggtt gaggcagatc attctcaacc tggttggtaa2760cgctatcaag tttactgagc tcggagaagt caaggtggct atatccatgg cgcaagaaca2820agaatgcgac ccagatcact atgtgttcca atttgccgtt tccgacaccg gaataggtat2880ccgtggcgat aagctcaatc ttatttttga caccttccag caggcggacg gctcgacaac2940aagaaagttt ggaggcactg gactcggtct gtctatctcc aaacgtctcg tcactctcat3000gggtggtcgc atgtgggtcg aatcagacgt tggcaagggc agtgtgttct actttacatg3060caaagtgcgt ctcggcaagc cggcaattca agccattcag cctcagctcg tggcatacaa3120gcagcacacg gttctctttg tcgaccaagg caacactggg ttctcggatc aaattatcga3180gcaccttaag acactcgatc ttgtgcctat ggtggttcac tcggttgagg aggtacccga3240gacgacgaag aggactgaca tgccgtacga ctgcgtcatt gtcgacaatg acaagacggc3300acgggagctt aggattgcgg aacgcttcaa gtacattcct ctcgtcatgc tcacgccaca3360cgtatgcatc agcctcaggt ctgcgctaga aaacggtatc tcgagctata tgacgacgcc3420ctgtctacca atcgacttgg gcaatgcgct cattccggca cttgatggcc gtgccgcacc3480tctggtctca gaccattcca aatcgttcca gattcttctg gccgaagaca atgctgtcaa3540tcagaagctt gccgtcagga ttctggagaa gtatcatcac agagtcactg tggctaacaa3600cggtcttgag gcctttgaac acattcaaaa gaagcgttac gattgcgtac ttatggatgt3660gcaaatgcca gtcatggtaa gctaggctct cgctaactcg aggttcgcag ctaacaacat3720tttagggtgg tttcgaagcc acggcgaaga tccgtgaatg ggaacgcgac aacggcattc3780cttcaacacc agtcattgca ctgacggcgc acgccatggt tggcgatcgc gagaagtgtc3840tcgctgcaca gatggacgta cgttactact attccattac gtttttccac tactaaatta3900gctctcagga ctacctttcc aaacctctac gccaaaacca actcatccaa acaatcctcc3960ggtgcgccac agtcggcagt acaatgtacg accattccag cgagccacgc tacacagcgt4020
SEQ ID NO3catcccacct ccccaacatt gctcttcccg caaagggtaa cgacaatgga ggcgcgtcat4080catcatctgg gggactgcct agtcccggca agaagcgccc acagctcgat acacgaggct4140tcacagaacg aggtggtggg gcacagagcc caaatcttct ggcggtggat cagacggata4200atggcagtgt cgagagagta cgttccttgt ccgctagttt gtgagtaaat tgaccctaat4260atgtgtgtgt tgtagctttt gctgcggagt catagtagct ga 4302
SEQ ID NO4SEQUENCE LISTING<110>云南省煙草科學研究所<120>赤星病菌對二甲酰亞胺類殺菌劑抗藥性的分子檢測方法<130>01<160>1<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1746<212>DNA<213>Alternaria alternata<220>
<221>N_region<222>(1)..(1746)<223>
<400>1tgaggacatc ggcgcactga aaagggaact cggcaagcat caacagggta tgctctatag 60tcttgaaaag gcaacgttgt ggctgacatt tcacagccaa cctggctttc caaaaggcac 120tgcgggaaat cggcgccatc gtcactgccg tcgctatggg tgacttgagc aagaaggtct 180tgattcatgc taaggagatg gaccctgaaa tcaccctgtt caagcgcacg atcaacacca 240tggtggacca gctccaggag tttgccagtc aagtcacgtt cctcgctcga gaggtcggta 300ccgaaggcag attgggcggt caagccaacc taccaggagt tgctggtatt tgggctgagc 360tgactgacag tggtacgttg tgattagggt tccactatcg ggccgatgct aacgtgtcct 420gcagttaatg ggatggccaa gaatcttacc gaccaggtgc gagagatcgc cgtagtcaca 480accgctgtcg ctatgggcga tctcagtcgt aagattgagc gtccggcccg aggagaaatc 540ttgcagctgc aacagacgat caacagcatg gtggatcaac tgcaatcatt tgctacccag 600gtcaccaaag tcgctagaga tgtcggaact gaaggcaagc ttggtggtca ggctgagatt 660gctggcgtca agggcatgtg gaacgaattg acagtgaatg tgaacgccat ggctcaaaac 720ctcaccaccc aggtgcgaga catcgcccag gtcacaacgg ccgtcgcaca ggataacctc 780acacggaagg tcgaagccga atgcaagggt gaaatcttgg aactcaagaa cacaatcaat 840cgcatggtgg accagctgca gcagtttgct cacgaagtca ccaagattgc gcgagaggtc 900ggatctgagg gtcgacttgg tggacaggct acagtgcatg gcgttgaggg tacctggaaa 960gatctcactg agaatgtgaa cggtatggcc atgaacctca caacacaagt gcgagaaatc 1020gccgaagtca ctacagccgt cgcaagagga gatctcagca ggaaggtcaa ggcagaagtt 1080cagggtgaga ttttgtcact taagattacc atcaacacca tggtggaccg cttgaacacg 1140tttgcacaag aggttagcaa ggtcgcccgt gaggtcggaa ccgacggtat tctgggcggc 1200caagcacagg tcgacaacgt tgagggcaag tggaaggatc tgaccaacaa tgtcaacact 1260atggctcaga atctcacgct gcaagtacga agtatttccg aggtcaccca ggccatcgcc 1320aagggagaca tgagccgcag agttcacgtg gacgccgagg gagagatccg attactcaaa 1380gacaccgtca acgacatggt tatgagactc gacgaatggt ctctagctgt gaagcgtgta 1440gctcgcgatg taggcgtaga cggaaagatg ggcggtcaag cagacgtgag agatatcgac 1500ggccgatgga aagaaatcac cacagacgtc aacaccatgg cccagaacct tacgtcacaa 1560gtgcgtgctt tcggtgacat caccaacgct gcaatggagg gcaagttcac tcaaatcacc 1620gtcgaggctt ctggtgagat ggatgaattg aagaggaaga tcaaccagat ggtgtccagt 1680ttgcgagaga gtattcaaag aaacacggct gcgagggaag cagccgagtt ggccaacaaa 1740acaaaa 1746
SEQ ID NO5SEQUENCE LISTING<110>云南省煙草科學研究所<120>赤星病菌對二甲酰亞胺類殺菌劑抗藥性的分子檢測方法<130>01<160>1<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>3981<212>DNA<213>Alternaria alternata<220>
<221>gene<222>(1)..(3981)<223>
<400>1atggccgcag agacgtactc gagcgtctca gccatcatcc gcaacctcgc ccgccaacac 60gaccctacgc gagaccccag cttcagcgca caagtttctg ccaacggagc caagacggct120gcaaatgcca tcgcgctgcc aggcccggag agcgaggaga agacgcaact agagcaggag180ctgtcggcgc tatgctcaag aatagacttt ctcgagcaca agagcagcca tgctccaaac240cagcagggcc agttccctct gacacccgca caagagccgc ccgaggaggg cgcgttatat300actccagcag gagtcttccg cggcaatagc ggcccacccg cccaaggacg tcgtggatcc360aacaaggagc gcgccatctg ggtctccaac tggctcgccg ccaaggagtc gaatggcgac420ccagaacagc ccgcggcagc ccttaccgaa gagcagctca actacctgcg agtgcacttg480aaccagcaag ccgaccagat tagaaaccag cgcgagcaca ttggtgggag cccacagaag540acctctgcat gcgcccaggc tgacagacaa cagacaacct aagccaggaa gtgaataagc600aactaacgac acagagcatg gtattcgaac atggcattga ggacatcggc gcactgaaaa660gggaactcgg caagcatcaa cagggtatgc tctatagtct tgaaaaggca acgttgtggc720tgacatttca cagccaacct ggctttccaa aaggcactgc gggaaatcgg cgccatcgtc780actgccgtcg ctatgggtga cttgagcaag aaggtcttga ttcatgctaa ggagatggac840cctgaaatca ccctgttcaa gcgcacgatc aacaccatgg tggaccagct ccaggagttt900gccagtcaag tcacgttcct cgctcgagag gtcggtaccg aaggcagatt gggcggtcaa960gccaacctac caggagttgc tggtatttgg gctgagctga ctgacagtgg tacgttgtga1020ttagggttcc actatcgggc cgatgctaac gtgtcctgca gttaatggga tggccaagaa1080tcttaccgac caggtgcgag agatcgccgt agtcacaacc gctgtcgcta tgggcgatct1140cagtcgtaag attgagcgtc cggcccgagg agaaatcttg cagctgcaac agacgatcaa1200cagcatggtg gatcaactgc aatcatttgc tacccaggtc accaaagtcg ctagagatgt1260cggaactgaa ggcaagcttg gtggtcaggc tgagattgct ggcgtcaagg gcatgtggaa1320cgaattgaca gtgaatgtga acgccatggc tcaaaacctc accacccagg tgcgagacat1380cgcccaggtc acaacggccg tcgcacaggg taacctcaca cggaaggtcg aagccgaatg1440caagggtgaa atcttggaac tcaagaacac aatcaatcgc atggtggacc agctgcagca1500gtttgctcac gaagtcacca agattgcgcg agaggtcgga tctgagggtc gacttggtgg1560acaggctaca gtgcatggcg ttgagggtac ctggaaagat ctcactgaga atgtgaacgg1620tatggccatg aacctcacaa cacaagtgcg agaaatcgcc gaagtcacta cagccgtcgc1680aagaggagat ctcagcagga aggtcaaggc agaagttcag ggtgagattt tgtcacttaa1740gattaccatc aacaccatgg tggaccgctt gaacacgttt gcacaagagg ttagcaaggt1800
SEQ ID NO5cgcccgtgag gtcggaaccg acggtattct gggcggccaa gcacaggtcg acaacgttga1860gggcaagtgg aaggatctga ccaacaatgt caacatcacc aacgctgcaa tggagggcaa1920gttcactcaa atcaccgtcg aggcttctgg tgagatggat gaattgaaga ggaagatcaa1980ccagatggtg tccagtttgc gagagagtat tcaaagaaac acggctgcga gggaagcagc2040cgagttggcc aacaaaacaa aatccgagtt cctcgccaac atgtctcacg agatccgaac2100gcccatgaac ggtatcattg gaatgaccca acttacgctc gacaccgacc ttacgcatgc2160gcaacgagag atgttgacca ttgttcataa tctggctggt caattactga caatcatcga2220cgatatcctt gatatctcca agatcgaggc gaaccgcatg gtaatggaag agattccatt2280ctcaatgcgc ggcactatat tcaacgcact caagtcatta gcatcaagag ccaacgagcg2340gaagttgaac cttgcttacg acgtctctta caaggtgccc gactacgttg ttggtgattc2400cttcaggttg aggcagatca ttctcaacct ggttggtaac gctatcaagt ttactgagct2460cggagaagtc aaggtggcta tatccatggc gcaagaacaa gaatgcgacc cagatcacta2520tgtgttccaa tttgccgttt ccgacaccgg aataggtatc cgtggcgata agctcaatct2580tatttttgac accttccagc aggcggacgg ctcgacaaca agaaagtttg gaggcactgg2640actcggtctg tctatctcca aacgtctcgt cactctcatg ggtggtcgca tgtgggtcga2700atcagacgtt ggcaagggca gtgtgttcta ctttacatgc aaagtgcgtc tcggcaagcc2760ggcaattcaa gccattcagc ctcagctcgt ggcatacaag cagcacacgg ttctctttgt2820cgaccaaggc aacactgggt tctcggatca aattatcgag caccttaaga cactcgatct2880tgtgcctatg gtggttcact cggttgagga ggtacccgag acgacgaaga ggactgacat2940gccgtacgac tgcgtcattg tcgacaatga caagacggca cgggagctta ggattgcgga3000acgcttcaag tacattcctc tcgtcatgct cacgccacac gtatgcatca gcctcaggtc3060tgcgctagaa aacggtatct cgagctatat gacgacgccc tgtctaccaa tcgacttggg3120caatgcgctc attccggcac ttgatggccg tgccgcacct ctggtctcag accattccaa3180atcgttccag attcttctgg ccgaagacaa tgctgtcaat cagaagcttg ccgtcaggat3240tctggagaag tatcatcaca gagtcactgt ggctaacaac ggtcttgagg cctttgaaca3300cattcaaaag aagcgttacg attgcgtact tatggatgtg caaatgccag tcatggtaag3360ctaggctctc gctaactcga ggttcgcagc taacaacatt ttagggtggt ttcgaagcca3420cggcgaagat ccgtgaatgg gaacgcgaca acggcattcc ttcaacacca gtcattgcac3480tgacggcgca cgccatggtt ggcgatcgcg agaagtgtct cgctgcacag atggacgtac3540gttactacta ttccattacg tttttccact actaaattag ctctcaggac tacctttcca3600aacctctacg ccaaaaccaa ctcatccaaa caatcctccg gtgcgccaca gtcggcagta3660caatgtacga ccattccagc gagccacgct acacagcgtc atcccacctc cccaacattg3720ctcttcccgc aaagggtaac gacaatggag gcgcgtcatc atcatctggg ggactgccta3780gtcccggcaa gaagcgccca cagctcgata cacgaggctt cacagaacga ggtggtgggg3840cacagagccc aaatcttctg gcggtggatc agacggataa tggcagtgtc gagagagtac3900gttccttgtc cgctagtttg tgagtaaatt gaccctaata tgtgtgtgtt gtagcttttg3960ctgcggagtc atagtagctg a 3981
SEQ ID NO6SEQUENCE LISTING<110>云南省煙草科學研究所<120>赤星病菌對二甲酰亞胺類殺菌劑抗藥性的分子檢測方法<130>01<160>1<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1445<212>DNA<213>Alternaria alternata<220>
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1.一種赤星病菌對二甲酰亞胺類殺菌劑抗藥性的分子檢測方法，包括真菌的分離與培養(yǎng)、真菌基因組DNA的提取、用引物進行PCR擴增、擴增片段測序及測序結(jié)果分析步驟，其特征在于本方法中所用引物由下列方法設計得到(1)選擇在GenBank上發(fā)表的索引號是AF489110的部分長度的雙組分組氨酸蛋白激酶基因序列，用DNA Walking SpeedUpTMPremix試劑盒設計如下引物5′端PCR后引物TSP1(5′--3′)CTCAAGTCACCCATAGCGTSP2(5′--3′)TCACCCATAGCGACGGCAGTTSP3(5′--3′)CATAGCGACGGCAGTGACGAT；3’端第一次PCR前引物TSP1(5′--3′)TAGCATCAAGAGCCGACGAGTSP2(5′--3′)CCGACGAGCGGAAGTTGAATSP3(5′--3′)CTTACAAGGTGCCCGACTACG；3’端第二次PCR前引物TSP1(5′--3′)GCACGGGAGCTTAGGATTGTSP2(5′--3′)5’-TCAGGTCTGCGCTAGAAAACGTSP3(5′--3′)5’-TATGACGACGCCCTGTCTACC；(2)通過三次PCR擴增，5’端一次，3’端兩次，將PCR擴增片段純化出來并和pMD18-T載體連接，然后通過轉(zhuǎn)化，將含有目的片段的克隆子培養(yǎng)液送測序公司測序，根據(jù)DNA Walking SpeedUpTMPremix試劑盒得到的片段和部分長度雙組分組氨酸蛋白激酶基因片段的拼接結(jié)果得到了野生型敏感鏈格孢菌13-3菌株的雙組分組氨酸蛋白激酶基因全長序列SEQ ID NO.1；(3)根據(jù)在GenBank上發(fā)表的索引號是AF489110的部分長度雙組分組氨酸蛋白激酶基因序列以及野生型敏感鏈格孢菌13-3菌株的雙組分組氨酸蛋白激酶基因全長序列SEQID NO.1，利用生物分析軟件Primer premier5設計如下引物；擴增雙組分組氨酸蛋白激酶基因全長序列SEQ ID NO.1的引物AaHKFp I(5′--3′)CTGTCCATCTTGCCCGTTCCAaHKRp II(5′--3′)CGGCTAAAACAGTTCTTTCGGTA；擴增雙組分組氨酸蛋白激酶基因N端六個90氨基酸重復區(qū)的引物HKFwd(5′--3′)AGGCTGACAGACAACAGACAAHKRev(5′--3′)CGAGCGTAAGTTGGGTCAT。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種赤星病菌對二甲酰亞胺類殺菌劑抗藥性的分子檢測方法，屬于分子生物學和植物病理學領域。本發(fā)明設計了9條DNA Walking引物用于擴增雙組分組氨酸蛋白激酶基因，另外設計了2對特異引物用于快速擴增雙組分組氨酸蛋白激酶全基因和雙組分組氨酸蛋白激酶基因N端六個90氨基酸重復區(qū)。本發(fā)明以煙草赤星病菌(Alternaria.alternata)基因組DNA作為模板，利用所設計引物快速擴增雙組分組氨酸蛋白激酶全基因和雙組分組氨酸蛋白激酶基因N端六個90氨基酸重復區(qū)，通過基因序列比對確定煙草赤星病菌對二甲酰亞胺類殺菌劑是否產(chǎn)生抗藥性。本發(fā)明具有快捷、簡便、經(jīng)濟等優(yōu)點，在煙草赤星病抗性監(jiān)測上具有良好的應用前景。
文檔編號C12Q1/68GK1876835SQ20061001085
公開日2006年12月13日 申請日期2006年4月27日 優(yōu)先權(quán)日2006年4月27日
發(fā)明者祝明亮, 羅義勇, 李梅云, 張克勤 申請人:云南省煙草科學研究所