專利名稱：一種大腸桿菌熱不穩(wěn)定腸毒素的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，更具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及一種利用酵母細(xì)胞表達(dá)大腸桿菌熱不穩(wěn)定腸毒素的制備方法。
背景技術(shù)：
大腸桿菌熱不穩(wěn)定腸毒素(heat-labile enterotoxin，簡(jiǎn)稱LT)是導(dǎo)致人畜腹瀉的毒性因子，由產(chǎn)毒性大腸桿菌(Enterotoxigenic Escherichia，ETEC)合成的六聚體蛋白。編碼和翻譯大腸桿菌熱不穩(wěn)定腸毒素的1t基因全長(zhǎng)1148bp，位于野生型產(chǎn)毒性大腸桿菌的質(zhì)粒上，分子量約61×106u。
LT是由A、B兩種亞單位組成的，分別記為L(zhǎng)TA、LTB，其中LT中含有同源五聚體的LTB。LTA有258個(gè)氨基酸，其中前18個(gè)氨基酸為信號(hào)肽；LTB124個(gè)氨基酸，前21個(gè)氨基酸是信號(hào)肽。LTB能夠識(shí)別人或動(dòng)物腸粘膜上皮細(xì)胞膜的神經(jīng)節(jié)苷脂GM1，并與之結(jié)合形成復(fù)合物然后跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入靶細(xì)胞漿中，LTA進(jìn)入細(xì)胞，持續(xù)活化腺苷酸環(huán)化酶系統(tǒng)，水解ATP產(chǎn)生大量的cAMP，引起小腸液過(guò)度分泌超過(guò)腸道再吸收能力，從而導(dǎo)致人或動(dòng)物腹瀉。
除了很強(qiáng)的毒性以外，LT及其B亞單位也具有很強(qiáng)的免疫原性并且能夠輔佐其他抗原通過(guò)粘膜免疫途徑使機(jī)體產(chǎn)生特異抗體，是公認(rèn)的強(qiáng)效粘膜免疫原和粘膜免疫佐劑，迄今在人和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中業(yè)已鑒定的最有效的粘膜免疫原之一。LT及其B亞單位與多種蛋白抗原或非蛋白抗原聯(lián)合或融合經(jīng)不同免疫途徑共同免疫機(jī)體后，可增強(qiáng)機(jī)體的系統(tǒng)免疫及黏膜免疫應(yīng)答；同時(shí)，還能消除機(jī)體對(duì)免疫原的耐受，誘發(fā)長(zhǎng)期免疫記憶。因而LT全毒素，尤其是其無(wú)毒或低毒突變體作為粘膜免疫佐劑，在粘膜免疫研究中以及粘膜免疫疫苗開(kāi)發(fā)中具有重要醫(yī)學(xué)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。
由于LT有很高的毒性，因而阻礙了將野生型毒素作為疫苗的佐劑用于人體。目前常用基因突變的方法使野毒型LT脫毒同時(shí)保留其佐劑活性，現(xiàn)有超過(guò)60種不同的LT突變體已通過(guò)點(diǎn)突變方法改變其氨基酸序列而表現(xiàn)為低毒或無(wú)毒，其中的部分突變體與不同的抗原混合或融合在不同的動(dòng)物模型上進(jìn)行了佐劑實(shí)驗(yàn)，已有一些LT突變體作為疫苗的粘膜免疫佐劑用于臨床試驗(yàn)。常見(jiàn)的LT A亞單位的突變體有LTR7K、LTH44A、LTV53D、LTS61F、LTS63K、LTA69G、LTA72R、LTE112K、LTG118E、LTR146E、LTR192G；B亞單位的突變體有LTG33D。
對(duì)于LT及其突變體或亞基的生物制備，公知的方法是在細(xì)菌中通過(guò)基因工程手段表達(dá)LT蛋白，但是在細(xì)菌中表達(dá)LT或其突變體、或其亞單位的產(chǎn)量較低，國(guó)外報(bào)道的LT產(chǎn)量均低于20ml/L(Rodighiero et al.J Biol Chem.1999，274(7)3962，Uesaka et al.Microb.Pathg，1994，16(1)71；Pronket al.J Biol Chem，1985，260(25)13580；Verwei j et al Vaccine，1998，16(20)2069；Ryan et al.Infect Immun，1999，67(4)1694；Haan et al.Vaccine，2001，19(20-22)2898)，國(guó)內(nèi)王靜等在水弧菌中分泌表達(dá)LTB，產(chǎn)率最高不超過(guò)26mg/L(王靜等，中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志，2003，23(6)432)；馮強(qiáng)等將LT突變體基因在強(qiáng)啟動(dòng)子的作用下，在大腸桿菌中的表達(dá)量提高到46mg/L(馮強(qiáng)，生物過(guò)程學(xué)報(bào)，2003，19(5)532；中國(guó)專利，CN1696291，2004)。
本發(fā)明人通過(guò)分析LT及其突變體的基因序列發(fā)現(xiàn)，野生型LT及其突變體的基因序列中含有大腸桿菌的稀有密碼子較多，使得LT及其突變體在大腸桿菌中的表達(dá)水平較低。但是野生型LT及其突變體的基因序列使用酵母表達(dá)時(shí)沒(méi)有稀有密碼子，因此設(shè)想采用酵母細(xì)胞來(lái)表達(dá)野生型LT及其突變體。
近年來(lái)，有將LT的B亞單位分別在畢赤酵母(Fingerut et al.Vaccine，2005，234685)、釀酒酵母(Rezaee et al.Journal of microbiology(Seoul，Korea)，2005，43354；Schonberger et al.Molecular microbiology，1991，52663)中表達(dá)的報(bào)導(dǎo)，但產(chǎn)量較低，最高僅有5～8mg/L，均是采用了單拷貝表達(dá)盒，以及產(chǎn)生LTB時(shí)的酵母細(xì)胞密度OD600值僅有1.0～2.0，因此LTB的產(chǎn)量較低。此外，國(guó)外一些學(xué)者在植物中也表達(dá)了LTB(Wagner etal.J Immunol Methods，2004，287203；Kang et al.Transgenic Res，2003，12683；Walmsley et al.Plant Cell Rep，2003，211020；休.S.梅森，中國(guó)專利CN99814963.2，1999)，但是產(chǎn)率并不高，介于37.8～75μg/g之間。
目前產(chǎn)毒性大腸桿菌自身合成野生型LT以及通過(guò)基因工程方式在細(xì)菌、酵母或植物中表達(dá)的LT或其突變體或其亞單位的產(chǎn)率都較低，從而限制了LT及其突變體的規(guī)?；a(chǎn)和臨床應(yīng)用。這是本領(lǐng)域一個(gè)急待解決的技術(shù)難題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種大腸桿菌熱不穩(wěn)定腸毒素的制備方法。該法是一種在酵母細(xì)胞中表達(dá)LT的方法，這種表達(dá)可以有效地提高重組大腸桿菌熱不穩(wěn)定腸毒素表達(dá)水平。
本發(fā)明的目的通過(guò)下述技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)。
本發(fā)明提供了一種大腸桿菌熱不穩(wěn)定腸毒素的制備方法，該法以野生型LT或其突變體或其亞單位中的一種LT和一種亞基LTB為例進(jìn)行說(shuō)明制備方法。
除非另有說(shuō)明，本發(fā)明中所采用的百分?jǐn)?shù)均為重量百分?jǐn)?shù)。
本發(fā)明所提供的方法，采用下述順序的步驟(1)在酵母細(xì)胞中進(jìn)行胞內(nèi)表達(dá)LT或LTB將LT的兩個(gè)亞基A和B的基因通過(guò)PCR擴(kuò)增和酶切分別重組到酵母細(xì)胞的表達(dá)載體pA0815上，形成重組表達(dá)載體LTA/pA0815和LTB/pA0815，這兩個(gè)重組質(zhì)粒經(jīng)體外重組法構(gòu)建10拷貝雜合重組載體(AOX-LTB)10(AOX-LTA)2/pA0815或10拷貝的重組載體(AOX-LTB)10/pA0815。多拷貝重組載體線性化后電轉(zhuǎn)化畢赤酵母，營(yíng)養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基篩選酵母轉(zhuǎn)化子，PCR擴(kuò)增確認(rèn)轉(zhuǎn)化子中是否含有目的基因。含有目的基因的酵母轉(zhuǎn)化子進(jìn)一步液體發(fā)酵并用甲醇誘導(dǎo)表達(dá)。收集并破碎酵母細(xì)胞，經(jīng)親和層析純化就獲得了LT或LTB蛋白，SDS-PAG和Western blot鑒定LT和LTB的分子量和免疫原性。
(2)在酵母細(xì)胞中分泌表達(dá)LT和LTBLT的A和B兩個(gè)亞基的基因通過(guò)PCR擴(kuò)增和雙酶切后重組到分泌信號(hào)肽α因子基因的下游，構(gòu)建成融合基因αLTA和αLTB，再經(jīng)酶切后重組到酵母表達(dá)載體pA0815上，通過(guò)體外重組法構(gòu)建多拷貝雜合表達(dá)載體(AOX-αLTB)10(AOX-αLTA)2/pA0815或10拷貝重組載體(AOX-αLTB)10/pA0815，多拷貝重組載體線性化后電轉(zhuǎn)化畢赤酵母，營(yíng)養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基篩選酵母轉(zhuǎn)化子，PCR擴(kuò)增確認(rèn)轉(zhuǎn)化子中是否含有目的基因。含有目的基因的酵母轉(zhuǎn)化子進(jìn)一步液體發(fā)酵并用甲醇誘導(dǎo)表達(dá)。培養(yǎng)上清超濾濃縮后親和層析純化就獲得了LT蛋白或LTB，SDS-PAG和Western blot鑒定LT和LTB的分子量和免疫原性。
(3)LT或LTB蛋白性質(zhì)的鑒定LT或LTB的生物學(xué)活性是用ELISA法來(lái)測(cè)定其與神經(jīng)節(jié)苷脂GM1的結(jié)合能力。LT或LTB的佐劑活性采用LT或LTB與牛血清白蛋白(BSA)聯(lián)合免疫小鼠，ELISA檢測(cè)小鼠的唾液、腸胃沖洗液中是否含有分泌型sIgA，如果有sIgA，表明LT具有粘膜佐劑活性。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果(1)在真核酵母細(xì)胞中外源表達(dá)LT及其突變體或其亞單位，能夠大幅提高其表達(dá)水平，是因?yàn)楸景l(fā)明構(gòu)建了多拷貝的LT或LTB亞基，并同時(shí)表達(dá)了LT的兩個(gè)亞單位，增加了LT或LTB在酵母中的基因劑量；其次，原來(lái)LT及其突變體在大腸桿菌中的稀有密碼子而在酵母細(xì)胞中卻不是稀有密碼子，不會(huì)影響LT在酵母細(xì)胞中的翻譯及合成速度，最終提高LT及其突變體在酵母細(xì)胞中的表達(dá)水平；最后，本發(fā)明將LT或LTB基因重組在畢赤酵母表達(dá)載體的強(qiáng)啟動(dòng)子醇脫氫酶(AOX)啟動(dòng)子之后，由甲醇誘導(dǎo)外源蛋白高表達(dá)。
(2)使用酵母細(xì)胞制備LT，避免了傳統(tǒng)方法由細(xì)菌制備時(shí)的內(nèi)毒素污染而造成的后續(xù)純化工藝的繁瑣，使得下游純化更為方便簡(jiǎn)單，臨床使用更為安全可靠。
(3)如果使用酵母細(xì)胞分泌表達(dá)時(shí)，由于不受宿主菌體細(xì)胞內(nèi)蛋白的影響，減少了純化工藝，提高了回收率；同時(shí)酵母細(xì)胞結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、生長(zhǎng)快速、易于培養(yǎng)和發(fā)酵、生產(chǎn)成本低、目的蛋白產(chǎn)量高，這對(duì)于規(guī)?；a(chǎn)粘膜佐劑及其臨床應(yīng)用具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。


圖1是設(shè)計(jì)構(gòu)建的畢赤酵母胞內(nèi)表達(dá)LT的多拷貝雜合重組質(zhì)粒；圖2是設(shè)計(jì)構(gòu)建的畢赤酵母分泌表達(dá)LT的多拷貝雜合重組質(zhì)粒；圖3是設(shè)計(jì)構(gòu)建的畢赤酵母胞內(nèi)表達(dá)LTB的多拷貝重組質(zhì)粒；圖4是設(shè)計(jì)構(gòu)建的畢赤酵母分泌表達(dá)LTB的多拷貝重組質(zhì)粒；圖5是PCR擴(kuò)增的LTA和LTB；(1.100bp DNA ladder Marker；2.LTA；3.LTB)圖6是PCR擴(kuò)增的αLTA和αLTB(1.DL2000+2700bp Marker；2.αLTA；3.αLTB)；圖7是12拷貝(AOX-LTB)10(AOX-LTA)2/pA0815的酶切圖譜(1.λ-EcoT14 I Marker；2.pA0815的Bgl II和BamH I酶切；3.(AOX-LTB)10(AOX-LTA)2/pA0815的Bgl II和BamH I雙酶切；4.DL15000Marker)；圖8是12拷貝(AOX-αLTB)10(AOX-αLTA)2/pA0815的雙酶切圖譜(1.λ-EcoT14 I Marker；2.DL15000 Marker；3.(AOX-αLTB)10(AOX-αLTA)2/pA0815的Bgl II和BamH I雙酶切)；圖9是10拷貝(AOX-LTB)10/pA0815的酶切圖譜(1.pPIC9K/Pst IMarker；2.DL15000 Marker；3.(AOX-LTB)10/pA0815的Bgl II和BamH I雙酶切)；圖10是10拷貝(AOX-αLTB)10/pA0815的酶切圖譜(1.DL15000 Marker；2.(AOX-LTB)10/pA0815的BamH I酶切；3.AOX-LTB)10/pA0815的Bgl II和BamHI雙酶切；4.pPIC9K/Pst I Marker)；圖11是重組酵母表達(dá)并純化的LT的SDS-PAGE和Western blot；圖12是重組酵母表達(dá)并純化的LTB的SDS-PAGE和Western blot。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。由于篇幅所限，為了表述方便，實(shí)施例以畢赤酵母(P.pastoris)及其表達(dá)載體pA0815進(jìn)行構(gòu)建胞內(nèi)表達(dá)和分泌表達(dá)野生型LT或LTB來(lái)說(shuō)明。但是，需要指出的是，本發(fā)明所提供的制備方法也完全適用于其它LT突變體，例如LTR7K、LTH44A、LTV53D、LTS61F、LTS63K、LTA69G、LTA72R、LTE112K、LTG118E、LTR146E、LTR192G、LTG33D。
實(shí)施例1——畢赤酵母細(xì)胞中進(jìn)行胞內(nèi)表達(dá)LT(1)重組表達(dá)載體LTA/pA0815和LTB/pA0815的構(gòu)建LT A及B亞單位基因分別用其上下游特異的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增不含其信號(hào)肽序列的基因，并在引物兩端引入EcoR I酶切點(diǎn)，PCR產(chǎn)物大小LTA(727bp)、LTB(320bp)純化后用EcoR I于37℃酶切2小時(shí)，回收純化；酵母表達(dá)載體pA0815同樣用EcoR I酶切，再經(jīng)堿性磷酸酶于37℃處理1小時(shí)，酚/氯仿抽提，乙醇沉淀，TE懸浮載體DNA片段，與EcoR I酶切的LTA和LTB分別用T4 DNA連接酶于16℃連接過(guò)夜，連接產(chǎn)物通過(guò)熱休克法轉(zhuǎn)化用CaCl2制備的E.coli DH5α，涂布Amp+-LB平板，37℃培養(yǎng)16小時(shí)，挑取數(shù)個(gè)單菌落接種Amp+-LB培養(yǎng)液，37℃振蕩培養(yǎng)12小時(shí)，堿裂解法抽提質(zhì)粒，EcoR I酶切質(zhì)粒鑒定是否含有LTA、LTB，然后酶切鑒定目的基因的插入方向，對(duì)于LTA/pA0815重組質(zhì)粒使用HindIII單切，瓊脂糖電泳后出現(xiàn)條帶大小為579、7847bp時(shí)，則LTA為正向插入，若條帶為280、8146bp時(shí)，則為反向插入；用內(nèi)切酶Mun I單切重組質(zhì)粒LTB/pA0815，電泳后出現(xiàn)條帶大小為119、368、829、1834、4877bp時(shí)表明LTB為正向插入，若出現(xiàn)108、119、829、2094、4877bp的條帶，表明是反向插入。挑選正向插入目的基因的重組質(zhì)粒LTA/pA0815、LTB/pA0815，用于下一步的亞克隆。
(2)體外重組構(gòu)建多拷貝表達(dá)盒的重組質(zhì)粒(AOX-LTB)10(AOX-LTA)2/pA0815LTB/pA0815重組質(zhì)粒使用BglII和BamHI雙酶切37℃2小時(shí)，膠回收小片段(AOX-LTB)(1596bp)，再插入到用BamH I酶切和堿性磷酸酶處理的LTB/pA0815質(zhì)粒上，T4 DNA連接酶16℃連接過(guò)夜，并以熱休克法轉(zhuǎn)化CaCl2制備的E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)菌，涂布Amp+-LB平板，37℃培養(yǎng)16小時(shí)，挑取單菌落，接種Amp+-LB培養(yǎng)液，振蕩培養(yǎng)12小時(shí)，堿裂解法抽提質(zhì)粒，用Bgl II和BamH I雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳鑒定是否含有3192bp的2拷貝表達(dá)盒(AOX-LTB)，獲得的2(AOX-LTB)/pA0815重組質(zhì)粒，進(jìn)一步在其基礎(chǔ)上，按上述同樣的方法構(gòu)建含有5拷貝表達(dá)盒的重組質(zhì)粒5(AOX-LTB)/pA0815；然后用Bgl II和BamH I雙酶切LTA/pA0815，回收大小為1995bp的(AOX-LTA)，將其按上述方法插入到5(AOX-LTB)/pA0815中，形成雜合多拷貝表達(dá)盒重組質(zhì)粒(AOX-LTB)5(AOX-LTA)/pA0815，再次用Bgl II和BamH I將(AOX-LTB)5(AOX-LTA)雙切下，重組到(AOX-αLTB)5(AOX-LTA)/pA0815上，最終構(gòu)建成(AOX-LTB)10(AOX-LTA)2/pA0815雜合多拷貝重組質(zhì)粒。
(3)(AOX-LTB)10(AOX-LTA)2/pA0815電轉(zhuǎn)化畢赤酵母及重組酵母的鑒定(AOX-LTB)10(AOX-LTA)2/pA0815經(jīng)Sal I于37℃酶切2小時(shí)，酚/氯仿抽提，乙醇沉淀，20μ1ddH2O懸浮DNA，使用電轉(zhuǎn)儀于電壓1500V、電阻200Ω、電容25μF下將線性化質(zhì)粒轉(zhuǎn)化山梨醇制備的畢赤酵母GS115感受態(tài)(按Invitrogen公司的畢赤酵母說(shuō)明書(shū)操作)，涂布MD平板，28℃培養(yǎng)3天，挑取較大的菌落少許，用Lyticase酶消化10分鐘，取10μl用5AOX和3AOX引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，在瓊脂糖電泳凝膠上出現(xiàn)大小為913bp、514bp的條帶時(shí)，表明該酵母轉(zhuǎn)化子中含有LTA和LTB基因。這樣就可篩選出含有多拷貝表達(dá)盒目的基因的重組酵母。
(4)畢赤酵母細(xì)胞內(nèi)LT的誘導(dǎo)表達(dá)、純化及鑒定挑取重組酵母菌落，接種到BMGY培養(yǎng)液中，30℃振蕩(250～300rpm)培養(yǎng)，OD600達(dá)到3～5時(shí)，3000rpm離心5分鐘收集重組酵母細(xì)胞，用BMMY培養(yǎng)液懸浮，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)5天，離心收集酵母細(xì)胞，玻璃珠研磨破碎細(xì)胞，TEAN(pH7.3)懸浮，13000rpm、4℃離心30分鐘，上清液用0.22μm濾膜過(guò)濾，濾液用Immobilized D(+)-galactose親和層析純化，洗滌純化柱，半乳糖洗脫緩沖液洗脫LT，這樣就得到了純化的LT蛋白。通過(guò)上述實(shí)驗(yàn)程序每升發(fā)酵液可獲得101.3mg的純化LT蛋白。LT與上樣緩沖液混和煮沸5分鐘，取10μl用10％的聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行蛋白電泳(SDS-PAGE)，考馬斯亮蘭染色，觀察LTA和LTB的分子量大小分別為27KD和11KD。將SDS-PAGE上的LT通過(guò)半干電轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，按照Western blot的操作程序?qū)T進(jìn)行免疫學(xué)鑒定，結(jié)果表明LT可與抗LT抗體發(fā)生免疫反應(yīng)。
實(shí)施例2——畢赤酵母分泌表達(dá)LT的構(gòu)建和鑒定(1)重組表達(dá)載體αLTA/pA0815和αLTB/pA0815的構(gòu)建對(duì)不含信號(hào)肽序列的LT A及B亞單位基因分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并在引物上下兩端引入Xho I和EcoR I酶切點(diǎn)，PCR產(chǎn)物L(fēng)TA(727bp)、LTB(328bp)純化后用Xho I和EcoR I于37℃酶切2小時(shí)，回收純化；含有酵母分泌信號(hào)肽α-因子重組載體pALPHA同樣用Xho I和EcoR I雙酶切，膠回收大片段，與雙酶切并純化的LTA和LTB分別用T4 DNA連接酶于16℃連接過(guò)夜，連接產(chǎn)物通過(guò)熱休克法轉(zhuǎn)化用CaCl2制備的E.coli DH5α，涂布Amp+-LB平板，37℃培養(yǎng)16小時(shí)，挑取數(shù)個(gè)單菌落接種Amp+-LB培養(yǎng)液，37℃振蕩培養(yǎng)12小時(shí)，堿裂解法抽提質(zhì)粒，Xho I和EcoR I雙酶切質(zhì)粒鑒定是否含有LTA、LTB。對(duì)于構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒分別對(duì)應(yīng)記為pαLTA、pαLTB，LTA和LTB分別連接在α-因子之后。然后再次用引物通過(guò)PCR擴(kuò)增αLTA、αLTB，在引物兩端都引入EcoR I酶切位點(diǎn)，αLTA、αLTB大小分別為982bp、583bp。按照實(shí)施例1中(1)的方法將αLTA和αLTB重組到酵母表達(dá)載體pA0815上，構(gòu)建成αLTA/pA0815、αLTB/pA0815重組載體。對(duì)于αLTA/pA0815上的αLTA插入方向鑒別，使用Xho I和EcoR I雙酶切，若電泳條帶上出現(xiàn)1058、7623bp時(shí)則為正向插入，而出現(xiàn)584、8097bp時(shí)則是反向插入；對(duì)于αLTB/pA0815上的αLTB插入方向使用Mun I單酶切鑒定，如果電泳條帶上出現(xiàn)119、623、829、1834、4874bp則是正向插入，如果出現(xiàn)108、119、829、2349、4877bp則為反向插入。挑選正向插入目的基因的重組質(zhì)粒αLTA/pA0815、αLTB/pA0815，用于下一步的亞克隆。
(2)體外重組構(gòu)建多拷貝表達(dá)盒的重組質(zhì)粒(AOX-αLTB)10(AOX-αLTA)2/pA0815按照實(shí)施例1中(2)的方法構(gòu)建多拷貝重組載體(AOX-αLTB)10(AOX-αLTA)2/pA0815，不同之處是幾個(gè)DNA片段大小不同AOX-αLTA為2250bp，AOX-αLTB為1848bp，2拷貝表達(dá)盒(AOX-αLTB)為3696，5(AOX-LTB)為9240bp，DNA片段(AOX-LTB)5(AOX-αLTB)大小為11490bp，DNA片段(AOX-LTB)10(AOX-αLTB)2大小為22980bp。
(3)重組質(zhì)粒(AOX-αLTB)10(AOX-αLTA)2/pA0815電轉(zhuǎn)化畢赤酵母及重組酵母的鑒定按照實(shí)施例1中(3)的方法將(AOX-αLTB)10(AOX-αLTA)2/pA0815重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化畢赤酵母，同樣用5AOX和3AOX引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增畢赤酵母轉(zhuǎn)化子，電泳凝膠上出現(xiàn)大小為1168bp、769bp的條帶時(shí)，表明該酵母轉(zhuǎn)化子中含有αLTA和αLTB基因。這樣就可篩選出含有多拷貝表達(dá)盒目的基因的重組酵母。
(4)畢赤酵母分泌LT的誘導(dǎo)表達(dá)、純化及鑒定挑取重組酵母菌落，接種到BMGY培養(yǎng)液中，30℃振蕩(250～300rpm)培養(yǎng)，OD600達(dá)到3～5時(shí)，3000rpm離心5分鐘收集重組酵母細(xì)胞，用BMMY培養(yǎng)液懸浮，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)5天，13000rpm、4℃離心30分鐘，收集培養(yǎng)上清，用TEAN(pH7.3)緩沖液于4℃透析3次，透析液用0.22μm濾膜過(guò)濾，濾液按照實(shí)施例1中(4)的方法進(jìn)行親和層析純化及鑒定。畢赤酵母分泌表達(dá)LT每升發(fā)酵液可獲得126.3mg的純化蛋白。
實(shí)施例3——LTB亞單位在畢赤酵母細(xì)胞中的胞內(nèi)表達(dá)和分泌表達(dá)(1)LTB在畢赤酵母細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的構(gòu)建、誘導(dǎo)表達(dá)及鑒定由實(shí)施例1中構(gòu)建成功的5拷貝表達(dá)盒(AOX1-LTB)5/pA0815重組質(zhì)粒，繼續(xù)按照實(shí)施例1中的方法構(gòu)建10拷貝表達(dá)盒(AOX1-LTB)10/pA0815重組質(zhì)粒、電轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115、鑒定畢赤酵母轉(zhuǎn)化子(用引物5AOX和3AOX擴(kuò)增的片段為514bp)、用甲醇誘導(dǎo)表達(dá)、親和層析純化以及進(jìn)行SDS-PAGE和Western blot鑒定。在10％SDS-PAGE凝膠上大小為11KD，LTB的胞內(nèi)表達(dá)產(chǎn)率為116.8mg/L。
(2)LTB在畢赤酵母細(xì)胞中分泌表達(dá)的構(gòu)建、誘導(dǎo)表達(dá)及鑒定由實(shí)施例2中構(gòu)建成功的5拷貝表達(dá)盒(AOX1-αLTB)5/pA0815重組質(zhì)粒，繼續(xù)按照實(shí)施例1中的方法構(gòu)建10拷貝表達(dá)盒(AOX1-αLTB)10/pA0815重組質(zhì)粒、電轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115、鑒定畢赤酵母轉(zhuǎn)化子(用引物5AOX和3AOX擴(kuò)增的片段為769bp)、用甲醇誘導(dǎo)表達(dá)、親和層析純化以及進(jìn)行SDS-PAGE和Western blot鑒定。在10％SDS-PAGE凝膠上大小為11KD，畢赤酵母分泌表達(dá)LTB的產(chǎn)量為143.7mg/L。
實(shí)施例4
——LT或LTB的生物學(xué)活性以及免疫佐劑活性鑒定LT或LTB的生物學(xué)活性是將其100μl加入到用GM1神經(jīng)節(jié)苷脂包被的ELISA板孔中，37℃1小時(shí)，PBST洗板三次，加入小鼠抗LB抗體100μl，37℃1小時(shí)，PBST洗板三次，加入100μl HRP標(biāo)記的羊抗小鼠抗體，37℃1小時(shí)，PBST洗板三次，用100μl鄰苯二胺顯色液顯色5分鐘，加入20μl 2NH2SO4終止顯色，用酶標(biāo)儀波長(zhǎng)為492nm測(cè)定OD值。結(jié)果表明LT和LTB都具有與GM1神經(jīng)節(jié)苷脂結(jié)合的能力。
LT或LTB與抗原牛血清白蛋白(BSA)被Al(OH)3膠體吸附后，通過(guò)口服進(jìn)行0、2、4周三次免疫小鼠，收集小鼠的唾液和腸粘液的沖洗液以及血清。通過(guò)ELISA試劑盒可檢測(cè)到血清中含有抗BSA的抗體，而且唾液和腸粘液中含有抗BSA的sIgA抗體，表明酵母細(xì)胞表達(dá)的LT或LTB具有粘膜佐劑活性。
權(quán)利要求
1.一種大腸桿菌熱不穩(wěn)定腸毒素的制備方法，該方法采用下述順序的步驟(1)在酵母細(xì)胞中進(jìn)行胞內(nèi)表達(dá)LT或LTB將LT的兩個(gè)亞基A和B的基因通過(guò)PCR擴(kuò)增和酶切分別重組到酵母細(xì)胞的表達(dá)載體pAO815上，形成重組表達(dá)載體LTA/pAO815和LTB/pAO815，這兩個(gè)重組質(zhì)粒經(jīng)體外重組法構(gòu)建包含10拷貝LTB和2拷貝LTA的雜合重組表達(dá)載體或10拷貝LTB的重組表達(dá)載體；多拷貝重組表達(dá)載體線性化后電轉(zhuǎn)化畢赤酵母，營(yíng)養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基篩選酵母轉(zhuǎn)化子，PCR擴(kuò)增確認(rèn)轉(zhuǎn)化子中是否含有目的基因；含有目的基因的酵母轉(zhuǎn)化子進(jìn)一步液體發(fā)酵并用甲醇誘導(dǎo)表達(dá)；收集并破碎酵母細(xì)胞，經(jīng)親和層析純化就獲得了LT或LTB蛋白，SDS-PAG和Western blot鑒定LT和LTB的分子量和免疫原性；(2)在酵母細(xì)胞中分泌表達(dá)LT或LTBLT的A和B兩個(gè)亞基的基因通過(guò)PCR擴(kuò)增和雙酶切后重組到分泌信號(hào)肽α因子基因的下游，構(gòu)建成融合基因αLTA和αLTB，再經(jīng)酶切后重組到酵母表達(dá)載體pAO815上，通過(guò)體外重組法在pAO815上構(gòu)建含10拷貝αLTB和2拷貝αLTA雜合重組表達(dá)載體或10拷貝αLTB重組表達(dá)載體，多拷貝重組載體線性化后電轉(zhuǎn)化畢赤酵母，營(yíng)養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基篩選酵母轉(zhuǎn)化子，PCR擴(kuò)增確認(rèn)轉(zhuǎn)化子中是否含有目的基因；含有目的基因的酵母轉(zhuǎn)化子進(jìn)一步液體發(fā)酵并用甲醇誘導(dǎo)表達(dá)；培養(yǎng)上清超濾濃縮后親和層析純化即獲得了LT或LTB蛋白，SDS-PAG和Western blot鑒定LT和LTB的分子量和免疫原性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的大腸桿菌熱不穩(wěn)定腸毒素的制備方法，其中所述的酵母細(xì)胞為畢赤酵母屬。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的大腸桿菌熱不穩(wěn)定腸毒素的制備方法，其中所述的大腸桿菌熱不穩(wěn)定腸毒素包括了野生型、各種突變體LTR7K、LTH44A、LTV53D、LTS61F、LTS63K、LTA69G、LTA72R、LTE112K、LTG118E、LTR146E、LTR192G、LTG33D和其B亞單位。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種大腸桿菌熱不穩(wěn)定腸毒素的制備方法，該法通過(guò)在酵母細(xì)胞中進(jìn)行胞內(nèi)表達(dá)或者分泌表達(dá)LT或LTB。在真核酵母細(xì)胞中外源表達(dá)LT及其突變體或其亞單位，能夠大幅提高其表達(dá)水平。本發(fā)明構(gòu)建了多拷貝的LT或LTB亞基表達(dá)盒，增加了LT或LTB在酵母中的基因劑量，同時(shí)將LT或LTB基因重組在畢赤酵母表達(dá)載體的強(qiáng)啟動(dòng)子醇脫氫酶(AOX)啟動(dòng)子之后，由甲醇誘導(dǎo)外源蛋白在酵母細(xì)胞中高表達(dá)，最終提高了LT及其突變體或LTB在酵母細(xì)胞中的表達(dá)水平，使得下游純化更簡(jiǎn)單，臨床使用更安全。本發(fā)明生產(chǎn)成本低、目的蛋白產(chǎn)量高，這對(duì)于規(guī)模化生產(chǎn)粘膜佐劑及其臨床應(yīng)用具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。
文檔編號(hào)C12R1/84GK1821398SQ20061001073
公開(kāi)日2006年8月23日 申請(qǐng)日期2006年3月9日 優(yōu)先權(quán)日2006年3月9日
發(fā)明者井申榮, 魏云林, 林連兵, 李光 申請(qǐng)人:昆明理工大學(xué)