專利名稱：內(nèi)皮抑制素小分子多肽及編碼該多肽的核苷酸序列和互補(bǔ)鏈的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種小分子多肽及編碼該多肽的核苷酸序列和互補(bǔ)鏈。
背景技術(shù)：
通過抑制腫瘤組織新生血管的生成，切斷腫瘤細(xì)胞的營養(yǎng)供應(yīng)，迫使腫瘤細(xì)胞停止生長，甚至死亡是目前腫瘤藥物治療的一個(gè)新熱點(diǎn)。內(nèi)皮抑制素是目前國際上公認(rèn)的活性最強(qiáng)的新生血管生成抑制劑，美國基因重組人的內(nèi)皮抑制素已經(jīng)完成了III期臨床試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)內(nèi)皮抑制素對(duì)多種腫瘤都有明顯地抑制、治療作用。內(nèi)皮抑制素因其具有抗腫瘤譜廣、毒性低和不產(chǎn)生抗藥性等優(yōu)點(diǎn)，備受矚目。但目前生產(chǎn)的內(nèi)皮抑制素均大于180個(gè)氨基酸，不適合靜脈注射，只能用于肌肉和皮下注射，長期注射易產(chǎn)生硬結(jié)，影響藥物吸收。又由于目前的內(nèi)皮抑制素是通過抑制血管生成間接限制腫瘤生長，因此治療時(shí)間長，用藥劑量大，治療中只有達(dá)到20mg/kg時(shí)，腫瘤方能退化到初始狀態(tài)，腫瘤細(xì)胞休眠，停止生長。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了解決現(xiàn)有內(nèi)皮抑制素分子量大，只能用于肌肉和皮下注射，靜脈用藥不安全和用藥劑量大的缺陷，而提供的一種內(nèi)皮抑制素小分子多肽及編碼該多肽的核苷酸序列和互補(bǔ)鏈。內(nèi)皮抑制素小分子多肽的氨基酸序列為MetHisSerHisArgAspPheGlnProValLeuHisLeuValAlaLeuAsnSerProLeuSerGlyGlyMetArgGlyAspArgGlyAsp。編碼上述內(nèi)皮抑制素小分子多肽的核苷酸序列為ATGCACAGCCACCGTGACTTCCAGCCTGTTCTCCACCTGGTTGCTCTCAACAGCCCTCTGTCAGGTGGTATGCGTGGTGACCGTGGTGAC。本發(fā)明編碼上述內(nèi)皮抑制素小分子多肽的核苷酸序列全長90bp，其中T、C、G、A分別為23bp(26％)、29bp(32％)、24bp(27％)、14bp(16％)。上述內(nèi)皮抑制素小分子多肽核苷酸序列的互補(bǔ)鏈核苷酸序列為GTCACCACGGTCACCACGCATACCACCTGACAGAGGGCTGTTGAGAGCAACCAGGTGGAGAACAGGCTGGAAGTCACGGTGGCTGTGC。本發(fā)明內(nèi)皮抑制素小分子多肽核苷酸序列的互補(bǔ)鏈核苷酸序列全長88bp，其中T、C、G、A分別為13bp(15)、24bp(27％)、29bp(33％)、22bp(25％)，互補(bǔ)鏈3′端缺少與內(nèi)皮抑制素小分子多肽核苷酸序列5′端AT互補(bǔ)的兩個(gè)堿基。本發(fā)明編碼內(nèi)皮抑制素小分子多肽的核苷酸序列和互補(bǔ)鏈根據(jù)大腸桿菌對(duì)密碼的偏愛性設(shè)計(jì)，編碼內(nèi)皮抑制素小分子多肽的核苷酸序列和互補(bǔ)鏈磷酸化退火后與經(jīng)Nde I和Sma I雙酶切的pTYB載體重組，再轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)?；蚬こ叹鶥L21(DE3)經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，用幾丁質(zhì)親和層析柱便可提取純化濃度≥95％的內(nèi)皮抑制素小分子多肽。本發(fā)明設(shè)計(jì)的編碼內(nèi)皮抑制素小分子多肽的核苷酸序列和互補(bǔ)鏈通過核苷酸自動(dòng)合成儀合成，經(jīng)重組轉(zhuǎn)化后可用生物工程方法大規(guī)模生產(chǎn)內(nèi)皮抑制素。本發(fā)明中的內(nèi)皮抑制素(內(nèi)皮抑制素小分子多肽)分子量小，僅為30個(gè)氨基酸，適合靜脈、肌肉和皮下注射，易于吸收，用藥安全。本發(fā)明的內(nèi)皮抑制素小分子多肽可與細(xì)胞外基質(zhì)競爭和腫瘤細(xì)胞膜上的整合素結(jié)合，直接抑制腫瘤細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移，具有雙重的抗腫瘤活性，用于治療腫瘤，療效好，用藥劑量小。體外細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，本發(fā)明的內(nèi)皮抑制素小分子多肽(內(nèi)皮抑制素)抗腫瘤活性是現(xiàn)有其它內(nèi)皮抑制素的2～3倍，動(dòng)物體內(nèi)抑瘤實(shí)驗(yàn)抑瘤率提高11個(gè)百分點(diǎn)以上。


圖1是接種內(nèi)皮抑制素小分子多肽30h后的雞胚脲囊膜圖，圖2是接種生理鹽水30h后的雞胚脲囊膜圖，圖3是培養(yǎng)液中不加內(nèi)皮抑制素小分子多肽的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞圖，圖4是培養(yǎng)液中不加內(nèi)皮抑制素小分子多肽的小鼠肝癌細(xì)胞圖，圖5是培養(yǎng)液中加入內(nèi)皮抑制素小分子多肽的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞圖，圖6是培養(yǎng)液中加入內(nèi)皮抑制素小分子多肽的小鼠肝癌細(xì)胞圖，圖7是人肝癌細(xì)胞細(xì)胞周期圖，圖8是人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞周期圖，圖9是在培養(yǎng)液中加入內(nèi)皮抑制素小分子多肽的人肝癌細(xì)胞細(xì)胞周期圖，圖10是在培養(yǎng)液中加入內(nèi)皮抑制素小分子多肽的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞周期圖，圖11是荷瘤小鼠經(jīng)內(nèi)皮抑制素小分子多肽治療后的圖，圖12是荷瘤小鼠未經(jīng)內(nèi)皮抑制素小分子多肽治療的圖，圖13是經(jīng)內(nèi)皮抑制素小分子多肽治療的小鼠體內(nèi)腫瘤的圖，圖14是不未經(jīng)內(nèi)皮抑制素小分子多肽治療的小鼠體內(nèi)腫瘤的圖。
具體實(shí)施例方式
具體實(shí)施方式
一本實(shí)施方式內(nèi)皮抑制素小分子多肽的氨基酸序列如下所示MetHisSerHisArgAspPheGlnProValLeuHisLeuValAlaLeuAsnSerProLeuSerGlyGlyMetArgGlyAspArgGlyAsp。
本實(shí)施方式內(nèi)皮抑制素小分子多肽(內(nèi)皮抑制素)抗腫瘤活性高，為現(xiàn)有其它內(nèi)皮抑制素的2～3倍，動(dòng)物體內(nèi)抑瘤實(shí)驗(yàn)抑瘤率提高11個(gè)百分點(diǎn)以上。本實(shí)施方式內(nèi)皮抑制素小分子多肽(內(nèi)皮抑制素)分子量只有內(nèi)皮抑素的六分之一，更易于吸收，提高了用藥的安全性；在保持內(nèi)皮抑素通過抑制血管生成間接限制腫瘤生長活性的同時(shí)，還能直接抑制腫瘤細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移，提高了抗腫瘤活性，減少了用藥劑量。
本實(shí)施方式內(nèi)皮抑制素小分子多肽的抗腫瘤活性實(shí)驗(yàn)1、內(nèi)皮抑制素小分子多肽抑制新生血管生成活性實(shí)驗(yàn)用0.1μg濃度為95％的內(nèi)皮抑制素小分子多肽和等體積的生理鹽水分別接種9日齡雞胚脲囊膜。30h后接種內(nèi)皮抑制素小分子多肽的雞胚脲囊膜如圖1所示，沒有新生血管生成；30h后接種生理鹽水的雞胚脲囊膜如圖2所示，有大量新生血管生成。本實(shí)驗(yàn)證明本實(shí)施方式的內(nèi)皮抑制素小分子多肽可有效的抑制新生血管的生成，抑制腫瘤吸收營養(yǎng)和生長。
2、TUNEL法檢測內(nèi)皮抑制素小分子多肽促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞和小鼠肝癌細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)在臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞和小鼠肝癌細(xì)胞培養(yǎng)液中分別加入終濃度44μg/mL的內(nèi)皮抑制素小分子多肽后繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)。沒有加入內(nèi)皮抑制素小分子多肽的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞如圖3所示，沒有加入內(nèi)皮抑制素小分子多肽的小鼠肝癌細(xì)胞如圖4所示，加入內(nèi)皮抑制素小分子多肽的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞如圖5所示，加入內(nèi)皮抑制素小分子多肽的小鼠肝癌細(xì)胞如圖6所示。圖3～6中凋亡細(xì)胞被熒光染成亮綠色，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示加入內(nèi)皮抑制素小分子多肽凋亡細(xì)胞數(shù)明顯增多，證實(shí)內(nèi)皮抑制素小分子多肽對(duì)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞和小鼠肝癌細(xì)胞都有促凋亡作用，可抑制血管生成和直接抑制腫瘤細(xì)胞的生長。
3、用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)人肝癌細(xì)胞細(xì)胞周期如圖7所示，人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞周期如圖8所示，在培養(yǎng)液中加入內(nèi)皮抑制素小分子多肽的人肝癌細(xì)胞細(xì)胞周期如圖9所示，在培養(yǎng)液中加入內(nèi)皮抑制素小分子多肽的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞周期如圖10所示。人肝癌細(xì)胞G0-G1期細(xì)胞為58.09％，加入內(nèi)皮抑制素小分子多肽的人肝癌細(xì)胞細(xì)胞G0-G1期細(xì)胞為85.42％，人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞G0-G1期細(xì)胞為57.43％，加入內(nèi)皮抑制素小分子多肽的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞G0-G1期細(xì)胞為59.72％。證明內(nèi)皮抑制素小分子多肽具有將腫瘤細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞周期阻滯在G0-G1期，限制腫瘤細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的生長活性。
4、動(dòng)物體內(nèi)的抑瘤實(shí)驗(yàn)接種小鼠肝癌細(xì)胞的小鼠隨機(jī)分為兩組，一組每日皮下注射內(nèi)皮抑制素小分子多肽0.44μg/kg，另一組每日注射等量生理鹽水，在同等條件下飼養(yǎng)，21天后接受內(nèi)皮抑制素小分子多肽治療的小鼠如圖11所示，注射生理鹽水的小鼠如圖12所示。圖11～12中箭頭所指位置為腫瘤。將小鼠解剖取出體內(nèi)腫瘤，接受內(nèi)皮抑制素小分子多肽治療的小鼠體內(nèi)腫瘤直徑平均為14mm，如圖13所示；注射生理鹽水的小鼠體內(nèi)腫瘤直徑平均為21mm，如圖14所示。證明本實(shí)施方式內(nèi)皮抑制素小分子多肽(內(nèi)皮抑制素)在動(dòng)物體內(nèi)具有明顯抑制腫瘤細(xì)胞的生長的作用。
具體實(shí)施方式
二本實(shí)施方式編碼內(nèi)皮抑制素小分子多肽的核苷酸序列如下所示ATGCACAGCCACCGTGACTTCCAGCCTGTTCTCCACCTGGTTGCTCTCAACAGCCCTCTGTCAGGTGGTATGCGTGGTGACCGTGGTGAC。
本實(shí)施方式編碼內(nèi)皮抑制素小分子多肽的核苷酸序列根據(jù)大腸桿菌對(duì)密碼的偏愛性設(shè)計(jì)，編碼內(nèi)皮抑制素小分子多肽的核苷酸序列隨重組載體轉(zhuǎn)化進(jìn)入生物工程菌大腸桿菌BL21(DE3)后可穩(wěn)定、準(zhǔn)確地轉(zhuǎn)錄和翻譯成內(nèi)皮抑制素小分子多肽(內(nèi)皮抑制素)。
具體實(shí)施方式
三本實(shí)施方式內(nèi)皮抑制素小分子多肽核苷酸序列的互補(bǔ)鏈核苷酸序列如下所示GTCACCACGGTCACCACGCATACCACCTGACAGAGGGCTGTTGAGAGCAACCAGGTGGAGAACAGGCTGGAAGTCACGGTGGCTGTGC。
本實(shí)施方式互補(bǔ)鏈核苷酸序列3′端缺少與內(nèi)皮抑制素小分子多肽核苷酸序列5′端AT互補(bǔ)的兩個(gè)堿基。兩條鏈經(jīng)磷酸化后退火，一端是多出AT兩個(gè)堿基的粘端，另一端是平端，有利于與Nde I和Sma I酶切后與質(zhì)粒載體pTYB重組。
序列表<110>哈爾濱醫(yī)科大學(xué)<120>內(nèi)皮抑制素小分子多肽及編碼該多肽的核苷酸序列和互補(bǔ)鏈<160>3<210>1<211>90<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>CDS<222>(1)…(90)<223>根據(jù)內(nèi)皮抑制素小分子多肽氨基酸序列和大腸桿菌對(duì)密碼的偏愛性而設(shè)計(jì)。
<400>1atg cac agc cac cgt gac ttc cag cct gtt ctc cac ctg gtt gct ctc 16Met His Ser His Arg Asp Phe Gln Pro Val Leu His Leu Val Ala Leu1 5 10 15aac agc cct ctg tca ggt ggt atg cgt ggt gac cgt ggt gac 30Asn Ser Pro Leu Ser Gly Gly Met Arg Gly Asp Arg Gly Asp20 25 30<210>2<211>30<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)內(nèi)皮抑制素活性片段和可與細(xì)胞外基質(zhì)競爭及與腫瘤細(xì)胞膜上整合素結(jié)合的氨基酸序列而設(shè)計(jì)。
<400>2Met His Ser His Arg Asp Phe Gln Pro Val Leu His Leu Val Ala Leu1 5 10 15Asn Ser Pro Leu Ser Gly Gly Met Arg Gly Asp Arg Gly Asp20 25 30<210>3<211>88<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)編碼內(nèi)皮抑制素小分子多肽的核苷酸序列而設(shè)計(jì)，用于與pTYB載體重組再轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)。
<400>3gtcaccacgg tcaccacgca taccacctga cagagggctg ttgagagcaa ccaggtggag 60aacaggctgg aagtcacggt ggctgtgc 88
權(quán)利要求
1.內(nèi)皮抑制素小分子多肽，其特征是內(nèi)皮抑制素小分子多肽的氨基酸序列如下所示MetHisSerHisArgAspPheGlnProValLeuHisLeuValAlaLeuAsnSerProLeuSerGlyGlyMetArgGlyAspArgGlyAsp
2.編碼如權(quán)利要求1所述內(nèi)皮抑制素小分子多肽的核苷酸序列，其特征是編碼內(nèi)皮抑制素小分子多肽的核苷酸序列如下所示ATGCACAGCCACCGTGACTTCCAGCCTGTTCTCCACCTGGTTGCTCTCAACAGCCCTCTGTCAGGTGGTATGCGTGGTGACCGTGGTGAC
3.如權(quán)利要求2所述內(nèi)皮抑制素小分子多肽核苷酸序列的互補(bǔ)鏈，其特征是互補(bǔ)鏈核苷酸序列如下所示GTCACCACGGTCACCACGCATACCACCTGACAGAGGGCTGTTGAGAGCAACCAGGTGGAGAACAGGCTGGAAGTCACGGTGGCTGTGC
全文摘要
內(nèi)皮抑制素小分子多肽及編碼該多肽的核苷酸序列和互補(bǔ)鏈，它涉及一種小分子多肽及編碼該多肽的核苷酸序列和互補(bǔ)鏈。它解決了現(xiàn)有內(nèi)皮抑制素分子量大，只能用于肌肉和皮下注射，靜脈用藥不安全和用藥劑量大的缺陷。內(nèi)皮抑制素小分子多肽的氨基酸序列30個(gè)氨基酸。編碼內(nèi)皮抑制素小分子多肽的核苷酸序列全長90bp?；パa(bǔ)鏈核苷酸序列全長88bp。本發(fā)明中的內(nèi)皮抑制素(內(nèi)皮抑制素小分子多肽)分子量小，適合靜脈、肌肉和皮下注射，不產(chǎn)生藥物沉積。本發(fā)明設(shè)計(jì)的編碼內(nèi)皮抑制素小分子多肽的核苷酸序列和互補(bǔ)鏈通過核苷酸自動(dòng)合成儀合成，經(jīng)重組轉(zhuǎn)化后可用生物工程方法大規(guī)模生產(chǎn)內(nèi)皮抑制素。
文檔編號(hào)C12N15/12GK1916023SQ20061001052
公開日2007年2月21日 申請日期2006年9月8日 優(yōu)先權(quán)日2006年9月8日
發(fā)明者劉興漢, 趙煒明, 林雪松 申請人:哈爾濱醫(yī)科大學(xué)