專利名稱：一種龍血竭的人工培育方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種利用真菌發(fā)酵技術(shù)人工培育龍血竭的方法。
背景技術(shù)：
血竭為珍稀名貴中藥，具有活血化瘀、消腫止痛，收斂止血，生肌斂瘡、補(bǔ)血之功效，常用于各種血癥，被喻為“和血之圣藥”(見《本草綱目》)。血竭最初來源于西域，近代來自東南亞的蘇門達(dá)臘。七十年代，中國科學(xué)院西雙版納熱帶植物園的蔡希陶教授在云南南部發(fā)現(xiàn)了產(chǎn)生血竭的植物資源——劍葉龍血樹(Dracaena cochinchinensis)，并通過植物化學(xué)和藥理學(xué)研究，開發(fā)出國產(chǎn)血竭，稱為龍血竭。實驗證明國產(chǎn)龍血竭與《本草綱目》中所記載的由西域來的血竭(dragon’s blood)最為接近，完全可以作為東南亞進(jìn)口血竭的國產(chǎn)替代用品。我國現(xiàn)有龍血竭生產(chǎn)企業(yè)十余家，以劍葉龍血樹含脂木為原料生產(chǎn)的血竭藥物多達(dá)60多種，年產(chǎn)值達(dá)5億多元。
在自然狀態(tài)下，劍葉龍血樹因雷電、風(fēng)暴及植食性動物啃食而損傷后，由于微生物的侵入而產(chǎn)生出的防衛(wèi)性化合物，即為龍血竭。但該過程十分緩慢，往往長達(dá)數(shù)十年乃至上百年，很難滿足日益增長的市場需求。目前，對劍葉龍血樹共生真菌及其與龍血竭形成的關(guān)系僅有少量的初步探討，雖提出了利用真菌誘導(dǎo)龍血竭產(chǎn)生的假說，但現(xiàn)有技術(shù)中尚未見有龍血竭誘導(dǎo)微生物的分離培養(yǎng)及利用真菌發(fā)酵技術(shù)在室內(nèi)培育生產(chǎn)龍血竭的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種人工培育龍血竭的方法，利用龍血竭誘導(dǎo)菌株進(jìn)行人工擴(kuò)繁，實現(xiàn)龍血竭的工業(yè)化生產(chǎn)。
本發(fā)明提供了一種龍血竭的人工培育方法，該方法由以下步驟組成1、龍血竭誘導(dǎo)真菌的采樣和分離培養(yǎng)將野生劍葉龍血樹活體莖株上正在形成血竭的部位割下，經(jīng)消毒、培養(yǎng)、分離和鑒定后得到龍血竭誘導(dǎo)菌株，并在4℃下保藏備用；該菌株現(xiàn)保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，學(xué)名鑒定為Fusarium culmorum，菌株命名為龍血竭誘導(dǎo)菌株Brwg，保藏編號為CGMCC No 1621，保藏日期2006年2月20日。
2、菌株培養(yǎng)液的配制將劍葉龍血樹的新鮮莖干風(fēng)干后，粉碎成60～100目的粉末備用。將100份蒸餾水、20份馬鈴薯汁、2份葡萄糖、0.2份瓊脂和0.5份劍葉龍血樹莖干組織粉末攪拌均勻后制成菌株培養(yǎng)液，消毒備用；3、誘導(dǎo)菌株的活化將龍血竭誘導(dǎo)菌株置于活化培養(yǎng)基中使其活化；4、將剛活化的龍血竭誘導(dǎo)菌株加入所述菌株培養(yǎng)液中培養(yǎng)，每1000ml培養(yǎng)液中放入0.5～1.5g的菌絲體，在無光照、25℃～27℃恒溫和280～320r/min下振蕩培養(yǎng)7～21天；5、培養(yǎng)液中龍血竭成分的提取將發(fā)酵后的培養(yǎng)液倒入分液漏斗，加入相同容積的正丁醇，充分振蕩混勻后，反復(fù)提取3次，分離出正丁醇部位，將正丁醇蒸餾掉，得到的即為龍血竭。
步驟3所述的活化培養(yǎng)基為馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基。
所述的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基的重量份配比為馬鈴薯汁20，葡萄糖2，瓊脂1.5和蒸餾水76.5。
步驟4所述的培養(yǎng)時間最佳為14～21天。
本發(fā)明克服了現(xiàn)有技術(shù)的不足，率先實現(xiàn)了龍血竭誘導(dǎo)微生物的分離培養(yǎng)，進(jìn)而利用這些微生物進(jìn)行人工擴(kuò)繁，在室內(nèi)培育生產(chǎn)龍血竭，實現(xiàn)了龍血竭的工業(yè)化生產(chǎn)。本發(fā)明方法簡便、成本低廉，其實施為更好地利用龍血竭這一傳統(tǒng)醫(yī)藥中的瑰寶創(chuàng)造了有利的條件，具有良好的市場應(yīng)用前景。
保藏生物材料的說明本發(fā)明涉及的龍血竭誘導(dǎo)菌株現(xiàn)保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，學(xué)名鑒定為Fusarium culmorum，菌株命名為龍血竭誘導(dǎo)菌株Brwg，保藏編號為CGMCC No 1621，保藏日期2006年2月20日。


圖1為中國藥品生物制品檢定所用于龍血竭質(zhì)檢的標(biāo)準(zhǔn)樣品(4’-羥基-2，4，6-三甲氧基二氫查耳酮)的分子式；圖2為本發(fā)明培育龍血竭時的情況。
具體實施例方式
下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明，但它們不是對本發(fā)明的限定。
實施例1將野生劍葉龍血樹活體莖株上正在形成血竭的部位割下，用0.1％升汞(HgCl2)進(jìn)行5分鐘的表面消毒和6次蒸餾水漂洗；在超凈工作臺里將消毒后的劍葉龍血樹組織切成0.8×0.5×0.3厘米的長方塊后，放入馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(20％馬鈴薯之汁，2％葡萄糖和1.5％瓊脂，其余為蒸餾水)中培養(yǎng)；經(jīng)分離、鑒定真菌后得到龍血竭誘導(dǎo)菌株Brwg(Fusarium culmorum)，在4℃下保藏備用。將劍葉龍血樹的新鮮莖干風(fēng)干后，粉碎成80目的粉末備用。取100份蒸餾水、20份馬鈴薯汁、2份葡萄糖、0.2份瓊脂和0.5份劍葉龍血樹莖干組織粉末攪拌均勻后制成菌株培養(yǎng)液，消毒備用。將龍血竭誘導(dǎo)菌株置于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(20％馬鈴薯之汁，2％葡萄糖和1.5％瓊脂，其余為蒸餾水)中使其活化。將活化后的龍血竭誘導(dǎo)菌株加入所述菌株培養(yǎng)液中培養(yǎng)，每1000ml培養(yǎng)液中放入1g的菌絲體，在無光照、26℃恒溫和250r/min下振蕩培養(yǎng)7天；將發(fā)酵后的培養(yǎng)液倒入分液漏斗，加入相同容積的正丁醇，充分振蕩混勻后，反復(fù)提取3次，分離出正丁醇部位，將正丁醇蒸餾掉，得到的即為龍血竭，經(jīng)高效液相色譜檢測，其龍血素含量達(dá)0.011～0.013％。
實施例2重復(fù)實施例1，有以下不同點振蕩培養(yǎng)14天，得到的龍血竭經(jīng)高效液相色譜檢測，其龍血素含量達(dá)0.121～0.142％。
實施例3重復(fù)實施例1，有以下不同點振蕩培養(yǎng)17天，得到的龍血竭，經(jīng)高效液相色譜檢測，其龍血素含量達(dá)0.192～0.212％。
實施例4重復(fù)實施例1，有以下不同點振蕩培養(yǎng)21天，得到的龍血竭，經(jīng)高效液相色譜檢測，其龍血素含量達(dá)0.378～0.391％。
權(quán)利要求
1.一種龍血竭的人工培育方法，該方法由以下步驟組成(1)龍血竭誘導(dǎo)真菌的采樣和分離培養(yǎng)將野生劍葉龍血樹活體莖株上正在形成血竭的部位割下，經(jīng)消毒、培養(yǎng)、分離和鑒定后得到龍血竭誘導(dǎo)菌株，并在4℃下保藏備用；(2)菌株培養(yǎng)液的配制將劍葉龍血樹的新鮮莖干風(fēng)干后，粉碎成60～100目的粉末備用；將100份蒸餾水、20份馬鈴薯汁、2份葡萄糖、0.2份瓊脂和0.5份劍葉龍血樹莖干組織粉末攪拌均勻后制成菌株培養(yǎng)液，消毒備用；(3)誘導(dǎo)菌株的活化將龍血竭誘導(dǎo)菌株置于活化培養(yǎng)基中使其活化；(4)將剛活化的龍血竭誘導(dǎo)菌株加入所述菌株培養(yǎng)液中培養(yǎng)，每1000ml培養(yǎng)液中放入0.5～1.5g的菌絲體，在無光照、25～27℃恒溫和220～280r/min下振蕩培養(yǎng)7～21天；(5)培養(yǎng)液中龍血竭成分的提取將發(fā)酵后的培養(yǎng)液倒入分液漏斗，加入相同容積的正丁醇，充分振蕩混勻后，反復(fù)提取3次，分離出正丁醇部位，將正丁醇蒸餾掉，得到的即為龍血竭。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的龍血竭的人工培育方法，其特征在于步驟3所述的活化培養(yǎng)基為馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的龍血竭的人工培育方法，其特征在于所述的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基的重量份配比為馬鈴薯汁20，葡萄糖2，瓊脂1.5和蒸餾水76.5。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的龍血竭的人工培育方法，其特征在于步驟4所述的培養(yǎng)時間最佳為14～21天。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種龍血竭的人工培育方法。將野生劍葉龍血樹活體莖株上正在形成血竭的部位割下，經(jīng)消毒、培養(yǎng)、分離和鑒定后得到龍血竭誘導(dǎo)菌株，在每1000ml的培養(yǎng)液中放入0.5～1.5g的菌絲體，在無光照、25～27℃恒溫和220～280r/min下振蕩培養(yǎng)7～28天后，用正丁醇提取，分離正丁醇后，得到的即為龍血竭。本發(fā)明開辟了龍血竭生產(chǎn)的新途徑，其方法簡便、成本低廉，具有良好的市場應(yīng)用前景。
文檔編號C12N5/04GK1821388SQ20061001073
公開日2006年8月23日 申請日期2006年3月9日 優(yōu)先權(quán)日2006年3月9日
發(fā)明者宋啟示, 楊曉虹, 陳定芳 申請人:中國科學(xué)院西雙版納熱帶植物園