一種四齒β二酮配體-銪熒光配合物及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種四齒P二酮配體-銪(III)熒光配合物及制備和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 稀土離子(包括Eu3+、Tb3+、Sm3+、Dy3+)與配位體形成的熒光配合物具有許多特殊的 性質(zhì)：（1)熒光壽命非常長，通常在IOOUs以上，這是由于稀土配合物的發(fā)光是經(jīng)過配體三 重態(tài)的能量轉(zhuǎn)移所致；（2)熒光發(fā)光的Stokes位移非常大，大部分在250nm以上；（3)稀土 離子的熒光發(fā)光的特征峰非常尖銳，半峰寬通常在l〇_15nm。這些性質(zhì)為其在時間分辨熒 光免疫分析、時間分辨熒光核酸雜交分析和時間分辨熒光生物成像等方面的應(yīng)用提供了前 提。
[0003] 在時間分辨熒光分析與成像方面，最關(guān)鍵的一步就是對各種生物分子如抗體、抗 原、蛋白質(zhì)和核酸等用稀土離子熒光配合物進(jìn)行標(biāo)記。到目前為止，可用于生物分子熒 光標(biāo)記的稀土配合物熒光探針主要包括三價銪離子與3-二酮類配位體形成的熒光配 合物及三價銪離子與芳香胺類配位體形成的熒光配合物。（文獻(xiàn)1:1 .Hemmila，v.-M. Mukkala,Crit.Rev.Clin.Lab.Sci.，2001，38, 441;文獻(xiàn) 2 :J.Yuan,G.Wang,TrendsAnal. Chem.，2006, 25, 490)。相對于三價稀土的芳香胺類配合物熒光標(biāo)記探針來說，三價銪離子 的@ -二酮類配合物發(fā)光效率更高，合成更簡單，成本更低廉，故這類熒光探針在時間分辨 分析和成像方面的應(yīng)用具有較高的實用意義。
[0004] 基于上述原因，近年來合成了許多氯磺?；凝X(6-二酮類配位體：包括 4,4' -二（1"，1"，1"，2"，2"，3"，3"-七氟-4"，6"-己二酮-6"-基）氯磺酰基-鄰二 苯基苯（簡稱BHHCT，文獻(xiàn) 3J.Yuan,K.Matsumoto,H.Kimura,Anal.Chem.，1998, 70, 596); 4,4'-二（1"，1"，1"，2"，2"-五氟-3"，5"-戊二酮-5"-基）氯磺酰基-鄰二苯基苯 (簡稱BPPCT，文獻(xiàn) 4 :R.Connally,D.Veal,J.Piper,FEMSMicrobiol.Ecol.，2002, 41，239); 4,4' -biS(r'，r'，r'-三氟-2"，4"-丁二酮-4"-基）氯磺?；?鄰二苯基苯(簡 稱BTBCB，文獻(xiàn) 5:F.B.Wu，C.Zhang，Anal.Biochem.，2002,311，57);l，10-二（4，，-氯 磺?；?1'，1"_聯(lián)苯-4' -基）-4, 4, 5, 5, 6, 6, 7, 7-八氟癸烷-1，3, 8, 10-四酮(簡稱 BCD0T，文獻(xiàn) 6J.Yuan,K.Matsumoto,Anal.Sci.，1996, 12,695) ;1，10-二（8,-氯磺酰 基-二苯并噻吩-2' _基）4, 4, 5, 5, 6, 6, 7, 7-八氟癸烷-1，3, 8, 10-四酮(簡稱BC0T，文 獻(xiàn) 7 :J.Yuan,K.Matsumoto,J.Pharm.Biomed.Anal. ,1997, 15, 1397) ;1，10-二（5'_ 氯 磺?；?噻吩-2' -基）_4, 4, 5, 5, 6, 6, 7, 7-八氟癸烷-1，3, 8, 10-四酮（簡稱BCT0T， 文獻(xiàn) 8 :F.Wu,S.Han,C.Zhang,Y.F.He,Anal.Chem.，2002, 74, 5882)，以及最新的 1，2-二 (1"，1"，1"，2"，2"，3"，3" -七氟-4"，6"-己二酮-6" -基-對芐基）-4-氯磺?；?苯（簡稱BHHBCB，文獻(xiàn) 9 :L.Zhang,Y.J.Wang,Z.Q.Ye,D.Y.Jin,J.L.Yuan,Bioconjugate Chem.，2012, 23, 1244)等被先后研制了出來。這幾種配位體不僅可與三價銪離子形成穩(wěn)定 的強熒光性配合物，其氯磺?；€可與含有氨基的生物分子共價鍵合，進(jìn)而對生物分子進(jìn) 行熒光標(biāo)記。其中BHHCT已經(jīng)被商品化，根據(jù)BHHCT的結(jié)構(gòu)而改造研制的BHHBCB相對于目 前已有的三價銪離子熒光配合物具有更佳的熒光性質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn)，三價銪離子的BHHCT配 合物以及由其衍生而來的配合物，不僅在生物標(biāo)記方面具有很好的應(yīng)用價值，而且其在功 能性納米稀土熒光材料的制備及復(fù)雜樣品的時間分辨熒光生物成像測定方面也具有很好 的應(yīng)用價值。
[0005] 雖然BHHCT以及BHHBCB為代表的配合物已經(jīng)研制出來，但是由于目前稀土離子 熒光配合物仍然種類有限，商品化的探針價格昂貴，而且這些配合物的激發(fā)波長均很短 (360nm以下)，所以對于BHHCT等化合物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計，制備具有更優(yōu)熒光性質(zhì)與穩(wěn) 定性的配合物仍具有很大的意義。
[0006] 本發(fā)明在對BHHBCB配位體結(jié)構(gòu)設(shè)計的基礎(chǔ)上，設(shè)計合成出一種新型的含有1，3二 芐基苯骨架結(jié)構(gòu)的四齒0 -二酮-銪(III)熒光配合物，并建立了蛋白質(zhì)標(biāo)記的應(yīng)用方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是提供一種新型的含有1，3二芐基苯骨架結(jié)構(gòu)的四齒(6-二酮-銪 (III)熒光配合物標(biāo)記探針，并將其用于蛋白質(zhì)分子標(biāo)記和AFP(甲胎蛋白）抗原的測定。
[0008] 本發(fā)明的技術(shù)方案如下：
[0009] 以三價銪離子與一種氯磺酰化四齒P_二酮類配位體所形成的熒光配合物為生 物標(biāo)記分子探針，其結(jié)構(gòu)為：
[0010]
[0011] R1為氯磺?；?SO2Cl)、異硫睛基（-NCS)、氨基（-NH2)、肼磺?；?SO2NHNH2)等 可與生物分子共價反應(yīng)的活性取代基，R2為CnF2n+1，其中，n=l，2, 3, 4,即三氟甲基（-CF3)、五 氟乙基（-C2F5)、七氟丙基（-C3F7)和九氟丁基（-C4F9)等取代基。
[0012] 以上結(jié)構(gòu)的配位體，在弱堿性（pH>8)的緩沖溶液中可以共價鍵合的形式與含有氨 基的蛋白質(zhì)(抗體、抗原、親和素、鏈霉親和素等)、氨基酸、肽、核酸等生物分子結(jié)合，當(dāng)在溶 液中加入三價銪離子后，銪離子可以與結(jié)合在生物分子上的配位體形成穩(wěn)定的強熒光配合 物，進(jìn)而得到銪(III)熒光配合物標(biāo)記的生物分子，以用于各種時間分辨熒光測定。
[0013] 所述四齒P-二酮配位體-EU3+在時間分辨熒光測定法中的應(yīng)用，其中的時間分辨 熒光測定法為時間分辨熒光免疫測定法或時間分辨熒光DNA雜交測定法。所述四齒(6-二 酮配位體-Eu3+作為標(biāo)記物應(yīng)用在臨床診斷用試劑盒中。
[0014] 本發(fā)明的熒光探針具有如下優(yōu)點：
[0015] 1.合成步驟簡單，原料易得，成本低。
[0016] 2.相對于已報道的三價銪離子氯磺?；凝X(6-二酮熒光配合物生物標(biāo)記探針 熒光發(fā)光更強（熒光量子產(chǎn)率可以達(dá)到36%)，熒光壽命更長（0. 84ms)。
[0017] 3.作為熒光探針，具有高的穩(wěn)定性，能長期保存使用。
[0018] 4.生物分子的熒光標(biāo)記方法操作簡單。
[0019] 5.水溶液中標(biāo)記生物分子后仍具有強熒光和長熒光壽命，可用于高靈敏度時間分 辨成像測定。
【附圖說明】
[0020] 圖1是該種四齒P-二酮配位體（R1=SO2Cl,R2=C3F7)的合成路線。
[0021] 圖2是1，3-二(七氟代丙基鄰-二酮基-對芐基）苯的質(zhì)譜分析結(jié)果 (734+Na=756)。
[0022] 圖3是第一步產(chǎn)物1,3-二（4' -乙?；S基）苯與第二步產(chǎn)物1,3-二(七氟代丙 基-P-二酮基-對芐基）苯的紅外譜圖對比。
[0023] 圖4是MQT-I-Eu3+標(biāo)記碳納米粒子后在碳酸緩沖溶液中以330nm激發(fā)的復(fù)合發(fā)射 光譜。
[0024] 圖5是MQT-I-Eu3+標(biāo)記BSA在pH7. 8的0? 05MTris-HCl緩沖溶液中的時間分辨熒 光激發(fā)與發(fā)射光譜。
[0025] 圖6是MQT-I-Eu3+標(biāo)記BSA在pH9. 1的0. 05M硼酸緩沖溶液中的時間分辨熒光激 發(fā)與發(fā)射光譜。
[0026] 圖7是MQT-I-Eu3+作為熒光探針檢測AFP的工作曲線。
【具體實施方式】
[0027] 下面通過實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。本實施例僅用于對本發(fā)明進(jìn)行說明，基 于相同原理和類似原料的方法也屬于本發(fā)明的范圍。
[0028] 實施例1 :一種氯磺?；凝XP_二酮配位體的合成該種氯磺?；凝XP_二酮 配位體的合成路線如圖1所示，具體實驗過程如下。
[0029] (1) 1，3-二（4' -乙?；S基）苯的合成。
[0030] 將I.Og(3. 8mmol) 1，3_ 二（漠甲基）苯，2. 23g(13. 68mmol) 4_ 乙醜基苯砸酸， 2. 62g( 19mmol)碳酸鉀加入含有60ml丙酮及20ml水的圓底燒瓶中，在冰水浴冷卻下攪拌至 大部分溶解，再加入26. 94mg(0. 15mmol)氯化鈀，氬氣保護(hù)下加熱至50°C，攪拌12小時。反 應(yīng)結(jié)束后旋蒸除去溶劑，生成物用氯仿萃取，經(jīng)無水硫酸鈉干燥后蒸干濾液得粗產(chǎn)品。粗產(chǎn) 品以石油醚-乙酸乙酯（4:1)為洗脫液過硅膠柱提純，真空干燥，得目標(biāo)產(chǎn)物863. 5mg，產(chǎn)率 66.44%/HNMR(CDCl3)測定結(jié)果：8=7.86 (d，J=8. 0Hz，4H)，7. 28-7. 24 (m，4H)，7. 01-7. 03 (m，4H)，3.98 (s，4H)，2.57 (s，6H)。
[0031] (2) 1，3-二(七氟代丙基-(6-二酮基-對芐基）苯的合成
[0032] 將I.Og(2. 92mmol) 1，3-二（4' -乙?；S基）苯和2. 04g七氟丁酸乙酯 (8. 75mmol)溶于30ml的干燥乙醚中，加入0. 47g(8. 75mmol)甲醇鈉，室溫攪拌反應(yīng)42 小時。反應(yīng)結(jié)束后加入20ml的15%硫酸水溶液，攪拌20分鐘，蒸出乙醚，過濾收集沉淀， 并用水充分洗滌。粗產(chǎn)物用無水乙醇重結(jié)晶后真空干燥，即得到目標(biāo)產(chǎn)物1，3-二(七氟 代丙