2-(2,2-二苯基環(huán)丙基)-4,5-二氫-1h-咪唑在制備抗神經退化性疾病藥物中的應用
【技術領域】
[0001 ]本發(fā)明設及一種西苯挫嘟化合物在制藥中的應用，尤其設及一種2-(2，2-二苯基 環(huán)丙基)-4,5-二氨-IH-咪挫在制備抗神經退化性疾病藥物中的應用。屬于生物醫(yī)學領域。
【背景技術】
[0002] 阿爾茨海默病(Alzheimer's disease,AD)，又稱老年性癡呆,是一種中樞神經退 化性疾病?；加邪柎暮Ｄ〉牟∪吮憩F(xiàn)出漸進性記憶、認知功能下降，并伴有行為上W及 精神上的癥狀;其人格的改變W及語言障礙等神經精神癥狀會嚴重影響社交、職業(yè)與生活 功能。
[0003] 自隧是一種特定的廣泛存在于從果蛹、酵母到高等脊椎動物的真核細胞中的生命 現(xiàn)象，是長命蛋白和胞質細胞器降解的主要細胞代謝通路，W細胞質、液泡在溶酶體的退化 過程為主要特征。自隧作用主要包括了S種類型：微自隧（microautophagy)、巨自隧 (macroautophagy)和分子伴侶介導的自隧（chaperone-mediated autophagy)。其中，巨自 隧在神經退行性疾病病變中的作用尤為受到關注。
[0004] 阿爾茨海默病中重要的神經病理學標志是淀粉樣蛋白斑，神經纖維纏結W及神經 元的缺失?，F(xiàn)階段普遍認為，大腦中的定粉樣蛋白（AP)的積聚導致了神經退行性病變，并最 終出現(xiàn)了慢性癡呆癥狀。
[0005] 近年來，自隧越來越多的被關聯(lián)到臨床疾病中，尤其是干擾性疾病、癌癥、神經退 化疾病和自我免疫類疾病。神經病理學證據(jù)顯示，自隧途徑與阿爾茨海默病是相禪連的。在 神經細胞內，通過化U蛋白過度憐酸化聚合形成了神經纖維纏結(NFTs),而細胞外，神經斑 主要由AP的聚集組成。運些都是阿爾茨海默病的主要神經病理學標記。另有證據(jù)顯示，在可 W發(fā)射信號的核內體中包含神經生長因子(NGF)，在顯微狀態(tài)下可W看到巧光標記的LC3能 夠逆向運輸NGF，由此可知神經生長因子可能源于或與自隧體相關。在阿爾茨海默病中，細 胞自隧受到損傷，自隧體得W積累，核內質溶酶體途徑出現(xiàn)異常。而自隧的藥理學活化作用 可W促進AP的清除，進而減輕AD癥狀。所W自隧被認為是阿爾茨海默病的一種潛在的治療 方法。
[0006] 西苯挫嘟化合物是一類重要的咪挫類化合物，既可抑制化+通道，減少化+內流，亦 可抑制Ca 2+通道，減少Ca2+內流，減弱屯、肌收縮力。W往人們對它的研究主要集中抗屯、律失 常作用等多種生物效應。而其在影響細胞自隧和神經疾病方面的研究和應用，經權威機構 (Web of knowledge、Elsevier ScienceDirect等）檢索查新，目前國內外未見報道。鑒于 此，研究和開發(fā)西苯挫嘟化合物的新用途特別是在制備抗神經退化性疾病藥物中的應用具 有重要的意義。

【發(fā)明內容】

[0007] 針對現(xiàn)有技術的不足和目前臨床對神經性變性病的治療需求，本發(fā)明要解決的問 題是提供一種2-(2,2-二苯基環(huán)丙基)-4,5-二氨-IH-咪挫在制備抗神經退化性疾病藥物中 的應用。
[000引本發(fā)明所述2-(2,2-二苯基環(huán)丙基)-4,5-二氨-IH-咪挫在制備抗神經退化性疾病 藥物中的應用。
[0009]其中：2-(2,2-二苯基環(huán)丙基)-4,5-二氨-IH-咪挫的化學結構如通式（I)所示，所 述神經退化性疾病優(yōu)選是阿爾茲海默病。
[0011] 本發(fā)明運用野生型神經膠質細胞U87MG細胞及LC3被綠色巧光蛋白（GFP)轉染的神 經膠質細胞U87MG細胞(簡稱LC3-GFP-U87細胞），對咪挫類衍生物進行了在影響細胞自隧和 神經疾病方面的研究，證實:所述化合物2-( 2，2-二苯基環(huán)丙基)-4，5-二氨-IH-咪挫在增強 細胞自隧方面具有明顯作用，并確定2-(2,2-二苯基環(huán)丙基)-4,5-二氨-IH-咪挫能有效誘 導引發(fā)細胞自隧的濃度為如M。
[0012] 為了更好的理解本發(fā)明的實質及本發(fā)明所述化合物的作用，下面結合2-(2,2-二 苯基環(huán)丙基)-4，5-二氨-IH-咪挫的藥理實驗及結果，來進一步闡述其在增強細胞自隧中的 作用。
[0013] 神經膠質瘤細胞的制備：W常規(guī)方法培養(yǎng)野生型神經膠質細胞U87MG細胞及LC3被 綠色巧光蛋白（GFP)轉染的神經膠質細胞U87MG細胞(簡稱LC3-GFP-U87細胞），收集生長狀 態(tài)良好的且處于對數(shù)期的細胞，備用。
[0014] 采用細胞生物學和分子生物學方法進行如下實驗，W觀察2-(2,2-二苯基環(huán)丙 基)-4,5-二氨-IH-咪挫對LC3-GFP-U87細胞和野生型神經膠質細胞U87MG自隧的影響。
[001引1).綠色巧光蛋白-自隧過程特征蛋白GFP-LC3方法檢測細胞內自隧小體情況，W 判斷化合物對細胞自隧的影響
[0016] 將處于對數(shù)生長期的LC3-GFP-U87細胞接種于96孔板中，經扣M的2-(2，2-二苯基 環(huán)丙基)-4,5-二氨-IH-咪挫作用2地后，用巧光倒置顯微鏡觀察LC3蛋白的變化，結果發(fā)現(xiàn) 實驗組較對照組出現(xiàn)大量巧光斑點，說明細胞產生自隧小體，LC3聚集在自隧小體內，形成 巧光斑點，證明了自隧的發(fā)生(見圖1)。
[0017] 2).蛋白質印跡法(Western Blot)分析濃度分別為化M，5iiM和IOiiM的2-(2,2-二苯 基環(huán)丙基)-4,5-二氨-IH-咪挫作用于U87MG細胞24小時(雷帕霉素作為陽性對照）后的蛋白 表達量
[0018]根據(jù)蛋白水平的表達量變化，發(fā)現(xiàn)化合物濃度為扣M和IOiiM時，皆顯著上調了LC3 n的表達量，證實了自隧的發(fā)生，并確定2-(2，2-二苯基環(huán)丙基)-4，5-二氨-IH-咪挫能有效 誘導引發(fā)細胞自隧的濃度為如M(見圖2)。
[0019] 上述實驗數(shù)據(jù)W平均值±標準誤差表示，經t檢驗，P<0.05，表示有明顯性差異。
[0020] 通過上述經統(tǒng)計學處理的實驗數(shù)據(jù)及其結果，可W得到W下結論：
[0021] 本發(fā)明所述的化合物2-(2,2-二苯基環(huán)丙基)-4,5-二氨-IH-咪挫能顯著引起細胞 自隧，實驗結果證實2-( 2，2-二苯基環(huán)丙基)-4，5-二氨-IH-咪挫有望在制備抗神經退化性 疾病藥物中具有應用。預示2-(2,2-二苯基環(huán)丙基)-4,5-二氨-IH-咪挫有望成為選擇性誘 導細胞自隧W及有效治療阿爾茲海默病的有潛力藥物，具有廣闊的科研和臨床開發(fā)前景。
【附圖說明】
[0022] 圖1:LC3-GFP-U87細胞經扣M的2-(2,2-二苯基環(huán)丙基)-4,5-二氨-IH-咪挫化合物 處理2地，顯示LC3-GFP-U87細胞發(fā)生顯著自隧的照片。
[0023] 其中：A圖為溶劑處理的對照組，B圖為化M的2-(2,2-二苯基環(huán)丙基）-4,5-二氨-IH-咪挫化合物溶液處理的實驗組。
[0024] 圖2: U87MG細胞經IiiM，5測和IOiiM的2-( 2，2-二苯基環(huán)丙基）-4，5-二氨-IH-咪挫化 合物分別處理2地，檢測顯示化合物濃度為扣M和IOiiM時，U87MG細胞中LC3 n的表達上調，細 胞發(fā)生自隧。（蛋白質印跡法）。
【具體實施方式】
[0025] 本發(fā)明所述的2-(2,2-二苯基環(huán)丙基)-4,5-二氨-IH-咪挫購于Sigma Al化ich。所 述U87MG細胞和LC3-GFP-U87細胞