本發(fā)明涉及萊菔硫烷的新用途技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及萊菔硫烷在治療白血病藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

萊菔硫烷（sulforaphane，sfn）是一種存在于西蘭花和其它十字花科蔬菜中的異硫氰酸鹽物質(zhì)，具有抗增殖能力，目前研究發(fā)現(xiàn)sfn對(duì)卵巢癌、膀胱癌、前列腺癌等多種惡性腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)具有抑制作用，是一種新型的抗癌成分。但是，sfn對(duì)造血腫瘤細(xì)胞的作用及機(jī)制則報(bào)道較少。

細(xì)胞周期失控是引起惡性增殖性疾病的重要原因之一。急性白血病是一類造血干細(xì)胞惡性克隆性疾病，白血病細(xì)胞因?yàn)樵鲋呈Э?、分化障礙、凋亡受阻等機(jī)制在骨髓和其它造血組織中大量增殖，并浸潤(rùn)其它組織和器官，同時(shí)正常造血受抑制。bcl-2基因家族是與細(xì)胞凋亡緊密相關(guān)的家族，其中bcl-2和bax分屬bcl-2家族中的抑制凋亡和促進(jìn)凋亡的兩部分，bcl-2發(fā)揮保護(hù)細(xì)胞的作用，減少細(xì)胞凋亡，而bax則發(fā)揮誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用，兩者在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)維持在平衡狀態(tài)，形成一個(gè)凋亡調(diào)節(jié)系統(tǒng)，共同調(diào)控細(xì)胞增殖和凋亡。當(dāng)bax過度表達(dá)時(shí)形成bax-bax同源二聚體，促進(jìn)細(xì)胞凋亡；隨著bcl-2表達(dá)量上升，bax同源二聚體便分開，bcl-2與bax可以形成比bax-bax更穩(wěn)定的bax-bcl-2二聚體，則抑制細(xì)胞的凋亡。因此，bax/bcl-2兩蛋白之間的比例關(guān)系是決定對(duì)細(xì)胞凋亡抑制作用強(qiáng)弱以及惡性腫瘤預(yù)后的關(guān)鍵因素。含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解（caspase），caspase是一組存在于細(xì)胞質(zhì)中具有類似結(jié)構(gòu)的蛋白酶。caspase與真核細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，并參與細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化與凋亡調(diào)節(jié)，也是細(xì)胞凋亡通路的重要組成部分。其中，caspase-3被認(rèn)為是一個(gè)涉及在不同的細(xì)胞系凋亡執(zhí)行最常見的成員，這些蛋白質(zhì)控制線粒體外膜通透性（momp）和線粒體膜間隙蛋白如細(xì)胞色素c的釋放。

在各類成人白血病中，以急性髓系白血?。╝cutemyeloidleukaemia，aml）發(fā)病率最高，且化療緩解率較低。kgla細(xì)胞和k562細(xì)胞是分別來源于急性髓系白血病耐藥的細(xì)胞株和慢性白血病急性變的患者中分離建立的細(xì)胞株，是目前研究急性髓系白血病的理想模型，本發(fā)明以不同濃度的sfn作用kg1a細(xì)胞和k562細(xì)胞，觀察其對(duì)白血病細(xì)胞增殖、凋亡及相關(guān)基因表達(dá)的影響，分析sfn抑制白血病細(xì)胞增殖的作用和機(jī)制。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供萊菔硫烷的新用途，即萊菔硫烷在制備治療白血病藥物中的新應(yīng)用。

實(shí)際上，本發(fā)明涉及萊菔硫烷在制備治療白血病藥物中的新應(yīng)用，即萊菔硫烷通過調(diào)控細(xì)胞凋亡抑制白血病細(xì)胞的增殖。

具體的，本發(fā)明涉及萊菔硫烷在制備治療白血病藥物中的新應(yīng)用，即萊菔硫烷通過調(diào)控bax基因、bcl-2基因和caspase-3基因誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡進(jìn)而抑制白血病細(xì)胞的增殖。

本發(fā)明所涉及萊菔硫烷在制備治療白血病藥物中的新應(yīng)用，即萊菔硫烷通過上調(diào)bax基因和caspase-3基因及下調(diào)bcl-2基因促進(jìn)白血病細(xì)胞凋亡進(jìn)而抑制白血病細(xì)胞的增殖。

進(jìn)一步限定，所述的白血病細(xì)胞為kg1a細(xì)胞和k562細(xì)胞。

本發(fā)明首次系統(tǒng)探討了sfn對(duì)急性白血病細(xì)胞kg1a和k562細(xì)胞凋亡的影響，結(jié)果證明sfn可以通過調(diào)控bax基因、bcl-2基因和caspase-3基因促進(jìn)急性白血病細(xì)胞凋亡，這不僅是理論上的突破，而且具有潛在的臨床意義，為治療白血病提供了一種全新的思路和潛在的治療路徑。

附圖說明

圖1是sfn對(duì)kgla細(xì)胞和k562細(xì)胞增殖活力的影響圖，cck8檢測(cè)和顯微鏡觀察顯示不同濃度的sfn（0、4、8、12μmol/l）作用于kgla細(xì)胞和k562細(xì)胞后，細(xì)胞增殖活力隨著細(xì)胞濃度和作用時(shí)間延長(zhǎng)而降低；

圖2是流式細(xì)胞儀檢測(cè)sfn對(duì)kgla細(xì)胞和k562細(xì)胞凋亡的影響圖，結(jié)果顯示不同濃度的sfn（0、4、8、12μmol/l）作用kgla細(xì)胞48h的早期凋亡率分別為0、3.12%、13.33%、28.18%，不同濃度的sfn（0、4、8、12μmol/l）作用k562細(xì)胞48h的早期凋亡率分別為0、2.81%、10.68%、30.27%；

圖3是westernblotting檢測(cè)sfn對(duì)白血病細(xì)胞中bax基因、bcl-2基因和caspase-3基因蛋白表達(dá)的影響圖；

圖4是rt-pcr檢測(cè)sfn在白血病細(xì)胞中對(duì)凋亡基因bax、bcl-2和caspase-3的影響圖。

具體實(shí)施方式

以下通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的上述內(nèi)容做進(jìn)一步詳細(xì)說明，但不應(yīng)該將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)施例，凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。

實(shí)施例

1、實(shí)驗(yàn)材料

萊菔硫烷（批號(hào)28911701）購(gòu)自美國(guó)lktlaboratories公司，純度98%。1640培養(yǎng)液和胎牛血清為美國(guó)gibco公司產(chǎn)品。cck-8試劑盒購(gòu)自日本dojindo公司，annexin-v/pi細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑（美國(guó)bd公司，批號(hào)5121706），rna提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、pcr試劑2×taqpcrmastermix、dnamarker均購(gòu)自上海天根，瓊脂糖（西班牙biowest），引物由上海生物工程公司合成，兔抗人baxmab、兔抗人bcl-2mab、兔抗人caspase-3mab為美國(guó)abcam公司產(chǎn)品，抗人gapdhpab及hrp-羊抗兔pab為世紀(jì)康為公司提供。流式細(xì)胞儀（facscaibur型）為美國(guó)bd公司產(chǎn)品，mk3酶標(biāo)儀和nd2000超微量分光光度計(jì)系美國(guó)thermo公司產(chǎn)品，凝膠圖像分析系統(tǒng)由英國(guó)genegenius公司生產(chǎn)，流式細(xì)胞儀為美國(guó)bd公司，eclipseti-s倒置顯微鏡購(gòu)自日本nikon公司。

2、細(xì)胞培養(yǎng)

人急性髓系白血病細(xì)胞kgla和k562細(xì)胞株由本實(shí)驗(yàn)室保存，以含10%胎牛血清rpmi1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)基中預(yù)先加入青霉素l00u/ml、鏈霉素100μg/ml、谷氨酰胺100μmol/l，置體積分?jǐn)?shù)為5%的co2培養(yǎng)箱于37℃培養(yǎng)，根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)及時(shí)換液傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞做后續(xù)試驗(yàn)。

3、細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

將傳代培養(yǎng)的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，計(jì)數(shù)，按照每孔細(xì)胞密度為1×10⁵/l接種于96孔培養(yǎng)板內(nèi)，分別加入終濃度分別為0、2、4、6、8、10、12μmol/l的sfn（0.9%ns溶解稀釋為2×10³μmol/l），37℃培養(yǎng)24h、48h、72h后，每孔加入cck-8試劑10ul繼續(xù)孵育4h，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀od值為450nm處測(cè)量各孔的od值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。細(xì)胞相對(duì)存活率=（實(shí)驗(yàn)組-空白組）/（對(duì)照組-空白組）×100%。根據(jù)kg1a細(xì)胞存活率，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，選取合適sfn濃度做后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

4、流式分析細(xì)胞凋亡

收集0、4、8、12μmol/lsfn處理后的kg1a細(xì)胞1×10⁶/l，用預(yù)冷pbs洗滌細(xì)胞2次，加入100μl的1×bindingbuffer懸浮細(xì)胞；加5μl的annexinv-fitc混勻后，再加入5μl的pi染色，4℃避光孵育15min后，加入400μl的1×bindingbuffer懸浮細(xì)胞，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。每管獲取10000個(gè)細(xì)胞，用cellquest分析軟件分析凋亡率。

5、westernbloting分析bax、bcl-2和caspase-3的蛋白

收集0、4、8、12μmol/lsfn作用48h后的kg1a細(xì)胞，用冰預(yù)冷的sds裂解緩沖液溶解20min，12000×g離心15min，抽提蛋白，bca蛋白濃度檢測(cè)試劑盒測(cè)定蛋白含量，蛋白上樣量為30μg，10wt%sds-page電泳；電轉(zhuǎn)到pvdf膜，5wt%的脫脂奶粉封閉，1:1000一抗4℃過夜，tbst洗膜3次之后，1:5000二抗室溫2h，再用tbst洗滌3次，ecl化學(xué)發(fā)光液顯影拍照。用imagej對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。

6、rt-pcr檢測(cè)bax、bcl-2和caspase-3的mrna表達(dá)

收集0、4、8、12μmol/lsfn處理48h后的kg1a細(xì)胞，用trizol法提取總rna，用核酸蛋白定量?jī)x檢測(cè)rna純度和濃度，純度在1.8-2.0之間，濃度在1-3μg/μl。用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cdna，轉(zhuǎn)錄體系為20ul。bax引物序列上游引物：5’-tttgcttcagggtttcatcc-3’，下游引物5’-cagttgaagttgccgtcaga-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物246bp；bcl-2引物序列上游引物：5’-ggatgcctttgtggaactgt-3’，下游引物：5’-agcctgcagctttgtttcat-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物236bp；caspase-3：5’-tgtttgtgtgcttctgagcc-3’，5’-cacgccatgtcatcatcaac-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物817bp；內(nèi)參β-actin引物序列上游引物：5’-agagctacgagctgcctgac-3’，下游引物5’-agcactgtgttggcgtacag-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物183bp。所用引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。pcr反應(yīng)體系為20μl，pcr擴(kuò)增試劑盒taqpcrmastermix10μl，上下游引物各0.4μl，cdna1μl，95℃預(yù)變性3min，94℃30s，擴(kuò)增參數(shù)55℃30s，72℃60s，30個(gè)循環(huán)，72℃延伸5min。取5μlpcr產(chǎn)物上樣于1wt%的瓊脂糖凝膠中，于80v電泳30min。取出凝膠置于凝膠成像分析系統(tǒng)中觀察，imagej軟件進(jìn)行掃描灰度值并分析結(jié)果。

7、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1、從圖1可以清楚看到sfn對(duì)kg1a細(xì)胞和k562細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖具有明顯的抑制現(xiàn)象，并且隨著sfn作用時(shí)間延長(zhǎng)和劑量增大其增殖呈明顯下降趨勢(shì)。

2、從圖2可以看出sfn可以誘導(dǎo)白血病細(xì)胞的凋亡，在sfn作用kg1a細(xì)胞和k562細(xì)胞48h后，經(jīng)過annexinv-fitc/pi雙染，流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)隨著sfn濃度的增加，kg1a細(xì)胞的早期凋亡率逐漸增加，0、4、8、12μmol/lsfn作用kg1a細(xì)胞和k562細(xì)胞48h后，早期凋亡率分別為0、3.12%、13.33%、28.18%和0、2.81%、28.18%和30.27%。由此可知sfn可以誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡，并且隨著sfn濃度的增加，kg1a細(xì)胞和k562細(xì)胞的早期凋亡率呈逐漸增加趨勢(shì)。

3、從圖3可以看出用0、4、8、12μmol/l的萊菔硫烷干預(yù)kg1a細(xì)胞、k562細(xì)胞48h后，bax和caspase-3蛋白表達(dá)顯著增高，各濃度組與0μmol/l比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p﹤0.05），而bcl-2表達(dá)有所下降，12μmol/l與0μmol/l比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p﹤0.05）。結(jié)果表明萊菔硫烷可能通過上調(diào)bax基因，下調(diào)bc-l2基因表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞凋亡，并且這種表達(dá)調(diào)控存在于蛋白表達(dá)水平。

4、圖4采用了pt-pcr檢測(cè)方法，結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了萊菔硫烷具有上調(diào)bax基因和caspase-3基因及下調(diào)bcl-2基因的功能，萊菔硫烷可以通過上調(diào)bax基因和caspase-3基因及下調(diào)bcl-2基因促進(jìn)白血病細(xì)胞凋亡，進(jìn)而抑制白血病細(xì)胞的增殖。

以上實(shí)施例描述了本發(fā)明的基本原理、主要特征及優(yōu)點(diǎn)，本行業(yè)的技術(shù)人員應(yīng)該了解，本發(fā)明不受上述實(shí)施例的限制，上述實(shí)施例和說明書中描述的只是說明本發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明原理的范圍下，本發(fā)明還會(huì)有各種變化和改進(jìn)，這些變化和改進(jìn)均落入本發(fā)明保護(hù)的范圍內(nèi)。

sequencelisting

<110>新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院

<120>萊菔硫烷在制備治療白血病藥物中的應(yīng)用

<130>2017

<160>8

<170>patentinversion3.3

<210>1

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<213>人工序列

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