本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及酚芐明在制備抗丙型肝炎病毒(hcv)感染藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

丙型肝炎是一種由丙型肝炎病毒(hcv)引起的肝臟疾病。hcv感染是慢性肝臟疾病的主要原因，例如肝硬化和肝癌。據(jù)世界衛(wèi)生組織報道，目前感染了丙型肝炎的患者已經(jīng)超過了兩億，并且每年有三至四百萬的新患者增加，其中每年大概有35,000-50,000人死于和丙型肝炎相關(guān)的疾病。一旦感染了丙型肝炎病毒，大約20％的人能夠自動清除病毒，但是其余80％的人將終生攜帶此病毒。10％-20％的丙型肝炎病毒慢性感染者將最終發(fā)展為肝硬化和肝炎。丙型肝炎的傳播途徑主要為血液傳播、性傳播和母嬰傳播。傳統(tǒng)治療丙型肝炎的方法主要為單獨使用α-干擾素或者和核苷類藥物聯(lián)用，例如利巴韋林。最新發(fā)展的直接抗病毒藥物(daa)索非布韋(sofosbuvir)和利巴韋林聯(lián)用可以治療丙型肝炎2型和3型。索非布韋、聚乙二醇干擾素注射液和利巴韋林聯(lián)用對治療丙型肝炎1型和4型具有良好療效。然而慢性丙型肝炎治療進(jìn)入daa時代并不意味著丙型肝炎問題已經(jīng)解決，因而還需要探索不同的治療策略。

酚芐明，英文名phenoxybenzamine，簡稱pbz，化學(xué)式c18h22clno，cas登錄號59-96-1，化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下所示。

鹽酸酚芐明是由美國食品藥品監(jiān)督管理局(fda)批準(zhǔn)的非選擇性的、不可逆的α-受體阻斷劑。鹽酸酚芐明在臨床上主要用于治療嗜鉻細(xì)胞瘤患者，控制高血壓和外周血管痙攣性等疾病。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供酚芐明在制備抗丙型肝炎病毒感染藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明的第二個目的是提供包括酚芐明的組合物在制備抗丙型肝炎病毒感染藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下：

酚芐明在制備抗丙型肝炎病毒感染藥物中的應(yīng)用。

包括酚芐明的組合物在制備抗丙型肝炎病毒感染藥物中的應(yīng)用。

組合物中酚芐明含量為0.1％-99wt％。

本發(fā)明的優(yōu)點：

試驗證實，酚芐明可以顯著地抑制huh7.5.1細(xì)胞中hcv真病毒(hcvcc)和hcv假病毒(hcvpp)的復(fù)制。

酚芐明可以顯著地抑制人原代正常肝細(xì)胞(phh)和正常肝細(xì)胞(hepg2)中hcvcc的復(fù)制。

酚芐明可以顯著地抑制各個基因型hcvcc的復(fù)制。

酚芐明可以顯著地抑制小鼠中hcvcc的復(fù)制，并且呈現(xiàn)濃度和時間依賴性。

附圖說明

圖1為酚芐明顯著地抑制huh7.5.1細(xì)胞中hcv真病毒(hcvcc)和hcv假病毒(hcvpp)的復(fù)制，酚芐明對hcvcc的半數(shù)有效濃度(ec50)為1.45±0.05μm，對hcvpp的半數(shù)有效濃度為2.85±0.09μm，并且沒有明顯的細(xì)胞毒性。

圖2為酚芐明顯著地抑制不同細(xì)胞中的hcvcc的復(fù)制，包括huh7.5.1細(xì)胞、phh細(xì)胞和hepg2細(xì)胞。

圖3為酚芐明顯著地顯著地抑制不同基因型hcvcc的復(fù)制。

圖4為酚芐明顯著地抑制小鼠中hcvcc的復(fù)制，并且呈現(xiàn)濃度和時間依賴性。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。

下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。所涉及的細(xì)胞和病毒株購于國家實驗細(xì)胞資源共享平臺。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計算。

實施例1

酚芐明抑制huh7.5.1細(xì)胞中的hcv的復(fù)制

酚芐明對hcvcc的半數(shù)有效濃度的測量如下：

以體外培養(yǎng)的帶有l(wèi)uciferase報告基因的hcv病毒株(jfh-1病毒株，2a型，hcvcc)為材料，考查不同濃度酚芐明的體外抗hcv增殖的抑制率，具體方法如下：

1)將用純dmso配制成的10mm的酚芐明儲液放于-30℃保存。

2)檢測藥物的體外抗hcv增殖的抑制率

提前一天：在96孔板內(nèi)，將huh7.5.1細(xì)胞按照每孔1.5×10⁴細(xì)胞鋪板，培養(yǎng)基為含有10％胎牛血清(fbs)的dmem培養(yǎng)基，體積為100μl，37℃下5％co2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)過夜培養(yǎng)。

試驗當(dāng)天：首先用含有0.5％dmso，10％fbs的完全培養(yǎng)基將帶有l(wèi)uciferase報告基因的jfh-1病毒按照1:10稀釋，然后將酚芐明用這種含有jfh-1病毒的培養(yǎng)基按照3倍梯度濃度稀釋，初始藥物濃度為20μm，共八個梯度，即20μm，6.67μm，2.22μm，0.74μm，0.25μm，0.082μm，0.027μm，0.0091μm。將96孔板內(nèi)的培養(yǎng)基吸出，然后將這種帶有藥物與病毒的培養(yǎng)基按照每孔100μl的量與huh7.5.1細(xì)胞孵育于37℃5％co2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時，對照細(xì)胞加入0.5％dmso的完全培養(yǎng)基。

第二天：在藥物與病毒共孵育48小時后，吸取病毒上清，加入renilla-glo^tmluciferasereagent，按照rellia-glo^tmluciferaseassaysystem說明書，檢測luciferase讀值。

3)將藥物在不同濃度處理jfh-1感染的huh7.5.1細(xì)胞的luciferase讀值輸入graphpadprism軟件，按照非線性回歸方法，計算每個藥物的ec50讀值。

酚芐明對hcvpp的半數(shù)有效濃度的測量與上述方法類似，只是在試驗當(dāng)天加入hcvpp，而非帶有l(wèi)uciferase報告基因的jfh-1病毒(hcvcc)；并且藥物與病毒的孵育時間為24小時，而非48小時。

試驗結(jié)果：如圖1所示，酚芐明對hcvcc的半數(shù)有效濃度為1.45±0.05μm，酚芐明對hcvpp的半數(shù)有效濃度為2.85±0.09μm。

實施例2

酚芐明細(xì)胞毒性實驗

1)將培養(yǎng)好的huh7.5.1細(xì)胞以每孔3000個細(xì)胞鋪96孔板，100μl每個孔的細(xì)胞鋪成單層大約90％豐富度即可。

2)用含有5％dmso的培養(yǎng)基稀釋化合物。

3)向?qū)嶒灲M中，每孔加入各濃度抑制劑50μl，dmso50μl。另取一列加入100μldmso作為細(xì)胞對照組。平行重復(fù)3次實驗。

4)將96孔板放入37℃，5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。

5)取出96孔板，吸去上清液，向每孔中加入100μlwst-1溶液，37℃反應(yīng)2-3小時，使用酶標(biāo)儀讀數(shù)(波長為450nm)，以對照組為標(biāo)準(zhǔn)計算細(xì)胞存活率。

試驗結(jié)果：如附圖1和附圖2所示，酚芐明在各個濃度下對huh7.5.1細(xì)胞無明顯細(xì)胞毒性，對phh細(xì)胞和hepg2細(xì)胞毒性較小。

實施例3

酚芐明抑制phh細(xì)胞和hepg2細(xì)胞中的hcvcc的復(fù)制

實驗具體操作與實施例2類似，將phh細(xì)胞和hepg2細(xì)胞替換huh7.5.1細(xì)胞即可。

實驗結(jié)果：如附圖2所示，酚芐明能夠顯著地抑制phh細(xì)胞和hepg2細(xì)胞中的hcvcc的復(fù)制。

實施例4：酚芐明抑制各個基因型hcvcc的復(fù)制。

實驗具體操作與實施例2類似，將不同基因型的病毒株替換jfh-1病毒株即可。

實驗結(jié)果：如附圖3所示，酚芐明能夠顯著地抑制各個基因型hcvcc的復(fù)制。

實施例5：酚芐明抑制小鼠中hcv的復(fù)制，并且呈現(xiàn)濃度和時間依賴性。

實驗方法：將10到12周大小的人cd81和閉合蛋白轉(zhuǎn)基因(c/o^tg)小鼠分成三組，每組4-6只小鼠。在0天實驗組小鼠靜脈注射5.0×10⁷單位jc-1病毒。1周后每天給小鼠腹腔注射0.2mg，1mg，2mg，或者4mg/kg體重的0.02mg/ml酚芐明dmso溶液，給藥時間持續(xù)1-2周。陰性對照組每天腹腔注射100μl/20g體重的dmso，陽性對照組每天腹腔注射20mg/kg體重的vx-950dmso溶液。取小鼠血清和肝臟樣品，使用rt-qpcr分析hcvrna含量。

實驗結(jié)果：如附圖4所示，酚芐明能夠顯著地抑制小鼠中hcv的復(fù)制，并且呈現(xiàn)出劑量和時間依賴性。

將酚芐明和藥學(xué)可接受的輔料制成組合物，組合物的劑型為湯劑、散劑、丸劑、酒劑、錠劑、膠劑、膏劑、茶劑、糕劑、露劑、棒劑、線劑、條劑、釘劑、灸熨劑、丹劑、微型膠囊、靜脈乳劑、脂質(zhì)體制劑、氣霧劑、前體藥制劑、注射劑、合劑、口服安瓿劑、片劑、膠囊劑、滴丸劑、乳劑、軟膏劑、橡膠硬劑、膜劑、海綿劑、離子透入劑或透皮吸收劑等劑型等在制備抗丙型肝炎病毒感染藥物中的應(yīng)用。在組合物中酚芐明含量為選自0.1-99wt％，例如：0.1wt％、0.5wt％、1wt％、5wt％、10wt％、20wt％、30wt％、40wt％、50wt％、60wt％、70wt％、80wt％、90wt％、99wt％。