(一)技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種用于腫瘤微酸性敏感的銅離子-藥物共配位自組裝納米粒及應(yīng)用。

(二)

背景技術(shù)：

腫瘤(tumor)是一種常見病、多發(fā)病，其中惡性腫瘤(cancer)是目前危害人類健康最嚴(yán)重的一類疾病。在歐美一些國(guó)家，惡性腫瘤的死亡率僅次于心血管系統(tǒng)疾病而居第二位。而我國(guó)最為常見和危害性嚴(yán)重的腫瘤為肺癌、鼻咽癌、食管癌、胃癌、大腸癌、肝癌、乳腺癌、宮頸癌、白血病及淋巴瘤等。而目前惡性腫瘤的治療多以手術(shù)切除為主，但很多患者在確診時(shí)因腫瘤部位，身體耐受狀態(tài)影響而失去手術(shù)治療機(jī)會(huì)。而局部放療、化療等輔助治療會(huì)誘發(fā)病人機(jī)體對(duì)放療、化療產(chǎn)生耐受性，并且治療所帶來(lái)的毒副作用，影響病人的生存期與生活質(zhì)量。其中，耐藥的本質(zhì)在于惡性腫瘤的快速增殖，導(dǎo)致新生血管生長(zhǎng)不完全，發(fā)生局部血管畸形，導(dǎo)致腫瘤組織的血液循環(huán)不暢，致使機(jī)體對(duì)實(shí)體腫瘤實(shí)質(zhì)的血氧供應(yīng)不足，致使腫瘤組織局部的含氧量在0.1％以下缺氧環(huán)境，而這一普遍而獨(dú)特的性質(zhì)會(huì)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞啟動(dòng)缺氧誘導(dǎo)因子hif-1α的高表達(dá)，而hif-1α的高表達(dá)與腫瘤細(xì)胞對(duì)放、化療的耐受性有很高相關(guān)性。因此，急需開發(fā)一種新藥用于抑制或?qū)鼓[瘤微氧或缺氧環(huán)境下存活的腫瘤細(xì)胞。

近年來(lái)，腫瘤乏氧選擇性活化前藥——生物還原類新藥，以腫瘤特有的內(nèi)源酶為靶標(biāo)引起醫(yī)學(xué)和科學(xué)界的廣泛關(guān)注和深度研究。banoxantrone(aq4n)是一種針對(duì)低氧或缺氧狀態(tài)發(fā)生生物還原類新藥(蒽環(huán)類藥物)，此藥已經(jīng)進(jìn)入臨床三期試驗(yàn)。其原理是，aq4n在低氧或缺氧狀態(tài)，還原活化成細(xì)胞毒素aq4，aq4與細(xì)胞核內(nèi)dna具有高親和性，其對(duì)dna拓?fù)洚悩?gòu)酶ii具有強(qiáng)烈的抑制作用，抑制dna的轉(zhuǎn)錄與復(fù)制，導(dǎo)致細(xì)胞死亡；而在正常氧分壓下，aq4n與dna無(wú)親和性，且僅定位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，并容易被腫瘤細(xì)胞外排，降低藥物生物利用率。而阿霉素dox(doxorubicin)是一類廣譜抗腫瘤藥物(蒽環(huán)類藥物)，其可定位于細(xì)胞核內(nèi)，抑制rna和dna的合成，對(duì)rna的抑制作用最強(qiáng)，對(duì)多種腫瘤均有作用，屬周期非特異性藥物，對(duì)各種生長(zhǎng)周期的腫瘤細(xì)胞都有殺滅作用。但在低氧或缺氧條件下，dox容易被腫瘤細(xì)胞外排以及誘發(fā)腫瘤產(chǎn)生耐受性。因此，將生物還原類前藥aq4n與dox聯(lián)用，通過(guò)納米技術(shù)，將其制備成納米級(jí)藥物共載體，改善腫瘤對(duì)藥物的攝取方式，并以優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)為原則，將有助于提高臨床對(duì)癌癥的治療效果。

(三)

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明涉及一種用于腫瘤微酸性敏感的銅離子-藥物共配位自組裝納米粒及應(yīng)用。

本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：

一種用于腫瘤微酸性敏感的銅離子-藥物共配位自組裝nanodrug納米粒，由生物還原類腫瘤增敏劑aq4n和阿霉素dox共同與二價(jià)銅離子配位自組裝而成，所述納米粒直徑為80～100nm，其中增敏劑aq4n、阿霉素dox、二價(jià)銅離子質(zhì)量之比為1∶1～3：0.1～0.5。cu(ii)分別與aq4n和dox的羰基c＝o與甲氧基c-o配位，并在親-疏水作用力，π堆積力，范德華力作用、金屬配位作用力共同作用下，自組裝形成nanodrug納米粒。

所述nanodrug納米?？捎扇缦路椒ㄖ频茫?/p>

(1)由dox-hcl和aq4n按比例混合，并向其中加入一定量的cucl2中性溶液，得到含有配體aq4n-cu(ii)-dox-hcl的混合液；

(2)將(1)得到的混合液中，加入適量三乙胺脫鹽24～36h，得到兩性的aq4n-cu(ii)-dox，然后將其逐滴加入到10ml的去離子水中，攪拌12～24h，然后用10000～20000da的透析袋透析1～2天，得到所述納米粒nanodrug。

具體方法如下：在去離子水中，加入一定比例的aq4n與dox-hcl粉末，強(qiáng)烈攪拌1～2hrs后，加入cucl2(ph7.4)溶液，并強(qiáng)烈攪拌1hr后，加入三乙胺并持續(xù)攪拌24～36hrs后，然后，將混合液逐滴加入到去離子水中，并攪拌12～24hrs；然后放入透析袋中透析，每4hrs更換一次1l的去離子水，透析1～2天后，低速離心去除大聚集體，然后高速離心獲得沉淀后，分散在pbs緩沖溶液中備用。

銅是參與人體內(nèi)多種酶類所必須的微量元素，微量對(duì)人體有益。本發(fā)明基于aq4n和dox同屬蒽環(huán)類化合物，在空間上具有一定的平面結(jié)構(gòu)，并且aq4n與dox的羰基c＝o和甲氧基c-o均與二價(jià)金屬銅離子cu(ii)配位，設(shè)計(jì)合成了一種用于腫瘤微環(huán)境ph敏感性成像、藥物緩釋及協(xié)同抗腫瘤作用的nanodrug納米粒。其合成操作簡(jiǎn)便，aq4n與dox的羰基c＝o和甲氧基c-o均與二價(jià)金屬銅離子cu(ii)配位，并利用aq4n的親水性、脫鹽后dox的疏水性、以及aq4n與dox范德華力作用、π堆積力及配位作用力下，在水中自組裝而制備出納米尺度均勻的nanodrug納米粒。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)nanodrug納米粒具有良好的生物相容性、生理穩(wěn)定性和ph梯度敏感性，以及良好的藥物滲透作用，可用于腫瘤微環(huán)境ph敏感性成像、藥物緩釋，降低對(duì)正常組織、細(xì)胞的毒副作用，并在有氧、缺氧條件下對(duì)腫瘤發(fā)揮良好的協(xié)同抗腫瘤作用，具有良好的臨床應(yīng)用前景。

為提高腫瘤細(xì)胞對(duì)其納米粒的攝取，降低網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(reticuloendothelialsystem)的吞噬作用，本發(fā)明利用aq4n電中性，其可有效提高藥物體循環(huán)時(shí)間，降低網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的吞噬。因此，本發(fā)明納米粒具有良好的腫瘤組織富集與治療選擇性。

本發(fā)明構(gòu)建的nanodrug納米粒，可依據(jù)腫瘤微酸環(huán)境，智能調(diào)節(jié)納米尺度，有效滲透入腫瘤實(shí)質(zhì)，并靶向定位于腫瘤細(xì)胞核內(nèi)，在有氧、低氧狀態(tài)下，發(fā)揮其良好的協(xié)同化療作用。同時(shí)，dox與aq4n的熒光因聚集而引起淬滅，當(dāng)其被腫瘤細(xì)胞攝取后，由于腫瘤細(xì)胞內(nèi)的低ph條件下，引起nanodrug納米?？焖俦澜猓尫懦龃罅縜q4n與dox，導(dǎo)致熒光恢復(fù)，可用于實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)藥物釋放與細(xì)胞成像。

優(yōu)選的，所述增敏劑aq4n、阿霉素dox、二價(jià)銅離子質(zhì)量之比為1∶2.4∶0.25。

所述的nanodrug納米粒在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。進(jìn)一步，所述藥物為控釋藥物或梯度酸性敏感藥物。

本發(fā)明還涉及所述nanodrug納米粒在腫瘤細(xì)胞熒光成像中的應(yīng)用。進(jìn)一步，所述成像為腫瘤微環(huán)境ph成像。所述的熒光成像可用于細(xì)胞的近紅外熒光成像。

本發(fā)明以臨床應(yīng)用的分子藥物dox與臨床二期前藥aq4n通過(guò)cu(ii)配位搭橋，形成具有均一納米尺度、良好的生物相容性的納米粒，其設(shè)計(jì)獨(dú)特，在于以，cu(ii)配位作用力，以及親疏水作用力為前提，設(shè)計(jì)合成可自組裝的納米粒，其藥物生理?xiàng)l件下穩(wěn)定性高，改善了腫瘤細(xì)胞攝取藥物途徑，降低了蒽環(huán)類藥物正常細(xì)胞與心肌細(xì)胞的毒副作用，提高了腫瘤細(xì)胞對(duì)納米藥物的攝取效率，提高了化療藥物對(duì)有氧或缺氧環(huán)境下的腫瘤組織細(xì)胞的治療效率。

本發(fā)明所構(gòu)建的nanodrug納米?？赏ㄟ^(guò)不同的劑量給藥，這取決于早期成像診斷的癌癥患者臨床狀況。本發(fā)明的nanodrug納米粒的給藥劑量和濃度，可由臨床醫(yī)生例行確定。用藥方案取決于各種因素，例如成像的癌細(xì)胞，組織或腫瘤是分散還是局部，患者的健康程度，年齡等。

本發(fā)明所構(gòu)建的nanodrug納米?？赏ㄟ^(guò)三種已知的給藥途徑給藥，包括靜脈給藥，腹腔給藥，以及局部給藥的區(qū)域遞送形式。

本發(fā)明的nanodrug納米粒，可根據(jù)腫瘤微環(huán)境ph，智能調(diào)節(jié)納米尺度，有效滲透腫瘤實(shí)質(zhì)，并在有氧、低氧或缺氧條件下，發(fā)揮藥物緩釋與協(xié)同抗腫瘤活性，降低癌癥患者因腫瘤實(shí)質(zhì)性缺氧而導(dǎo)致的藥力下降或耐藥性，提高腫瘤細(xì)胞的藥物敏感性，降低用藥劑量，減輕蒽環(huán)類化療藥物對(duì)患者潛在的毒副作用。

(四)附圖說(shuō)明

圖1為nanodrug納米粒的掃描電鏡圖；

圖2為aq4n，dox，nanodrug，aq4n與dox的混合液的紫外可見近紅外吸收光譜；

圖3為nanodrug納米粒在不同ph條件下dox(a)與aq4n(b)的可控釋放曲線。

圖4為nanodrug納米粒在肝癌細(xì)胞中的定位。

圖5為nanodrug納米粒在缺氧條件下對(duì)肝癌細(xì)胞的聯(lián)合治療效果。

(五)具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此：

實(shí)施例1：

利用電子天平稱取1mg的阿霉素鹽酸鹽doxorubicin-hcl((2r,4s)-4-(3-amino-2,3,6-trideoxy-α-l-lyxo-hexopyranosyloxy)-2-hydroxyacetyl-1,2,3,4-tetrahydro-2,5,12-trihydroxy-7-methoxynaphthacene-6,11-dione，sigma公司)的紅色粉末和1mg的banoxantrone(1,4-bis[2-(dimethylamino-n-oxide)ethylamino]-5,8-dihydroxyanthracene-9,10-dione，abcam公司)藍(lán)色粉末溶解在盛有2ml去離子水中，攪拌1h后，加入0.1ml的1mg/mlcucl2-ph7.4(用naoh調(diào)節(jié)ph)，并攪拌4h，然后加入0.45ml的三乙胺溶液于混合液中脫鹽。在避光條件下攪拌24hrs后，將混合液逐滴加入到10ml的去離子水中，并1000rpm/min攪拌。然后置于14400da的透析袋中進(jìn)行透析，每間隔4h更換一次1l的去離子水。透析2天后，將其中溶液以1000rpm/min低速離心，去除聚集體，然后再利用13500rpm/min收集納米粒，并分散在pbs緩沖液中備用。

實(shí)施例2：

實(shí)施例1制備的nanodrug納米粒的直徑約80～100nm，并具備了ph敏感的近紅外熒光成像、藥物控釋，及有氧、乏氧性協(xié)同抗腫瘤作用。

使用掃描電鏡(sem)、紫外－可見分光光度計(jì)(uv-vis-nir)對(duì)nanodrug納米粒進(jìn)行表征，并利用共聚焦顯微鏡研究nanodrug納米粒的細(xì)胞器定位。并利用細(xì)胞活力檢測(cè)試劑盒(cck8)檢測(cè)nanodrug納米粒對(duì)肝癌細(xì)胞的協(xié)同化療效果。具體測(cè)試結(jié)果如下：

(1)掃描電鏡(sem)

掃描電鏡圖像表示nanodrug納米粒的形貌和納米尺寸。結(jié)果參照?qǐng)D1，表示在1μm的標(biāo)尺下，檢測(cè)nanodrug納米粒分布及形貌，其說(shuō)明nanodrug納米粒束尺寸均一，形貌一致。

(2)紫外-可見-近紅外分光光度計(jì)(uv-vis-nir)

紫外-可見-近紅外吸收光譜，表示nanodrug納米粒的特征光譜。結(jié)果參照?qǐng)D2，dox的吸收峰在498nm,aq4n的吸收峰在600nm，nanodrug納米粒的吸收峰在540nm并高于dox和aq4n的吸收峰，其原因在于配位的cu(ii)的特征吸收在540nm，其特征吸收同時(shí)高于dox與aq4n的混合液的吸收。證明通過(guò)配位作用制備出新的藥物劑型nanodrug納米粒。

(3)nanodrug納米粒在不同ph條件下的可控釋放曲線

結(jié)果見圖3。由圖可見，制備的nanodrug納米粒具有不同ph敏感性，中性ph7.4條件下，極為穩(wěn)定；ph6.5下，微量釋放，ph5.0下大量釋放；ph2.5下，全部釋放，并在釋放過(guò)程中，其dox熒光恢復(fù)，aq4n的熒光恢復(fù)用于成像診斷與藥物釋放指示。

(4)共聚焦顯微鏡研究nanodrug納米粒在肝癌細(xì)胞中的定位

結(jié)果見圖4。由圖可見，nanodrug納米粒進(jìn)被腫瘤細(xì)胞攝取后，其因腫瘤細(xì)胞內(nèi)的低ph條件下，導(dǎo)致aq4n與dox顯著釋放，其中aq4n主要定位于細(xì)胞質(zhì)及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜，dox主要定位于細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核內(nèi)，為進(jìn)一步發(fā)揮藥效提供有利條件。

(5)細(xì)胞活力檢測(cè)試劑盒(日本同仁化工)檢測(cè)nanodrug納米粒在缺氧條件下(1％o2)對(duì)肝癌細(xì)胞的協(xié)同治療效果

按照試劑盒操作規(guī)程進(jìn)行操作，結(jié)果見圖5。由圖可見，nanodrug納米粒的腫瘤細(xì)胞抑制率(63.8％)高于同等濃度下的aq4n(37.6％)以及dox(58.3％)，證明nanodrug納米粒具有良好的聯(lián)合治療效果。