含吡螨胺結(jié)構(gòu)的化合物在制備抗埃博拉病毒感染藥物中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體設(shè)及含化蛾胺結(jié)構(gòu)的化合物的一種新用途，更具 體設(shè)及含化蛾胺結(jié)構(gòu)的化合物在制備抗埃博拉病毒感染藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 埃博拉病毒化bola Virus,EBOV)是傳染病埃博拉出血熱的病原體，該出血熱于 1976年首次在扎伊爾發(fā)現(xiàn)，其高傳染性的爆發(fā)流行和高致死性很快引起了世界各國(guó)研究人 員的注意。埃博拉病毒具有極強(qiáng)的感染性，可引起人類和其他靈長(zhǎng)類動(dòng)物高致死性的出血 熱綜合征。研究表明，埃博拉病毒的所有組分對(duì)疾病的發(fā)展都有一定的促進(jìn)作用，尤其是埃 博拉病毒的囊膜糖蛋白（Glycoprotein,GP)可與祀細(xì)胞發(fā)生吸附，進(jìn)而進(jìn)入祀細(xì)胞，在介導(dǎo) 病毒進(jìn)入祀細(xì)胞過程中發(fā)揮重要作用。埃博拉病毒的囊膜糖蛋白被認(rèn)為是決定埃博拉病毒 致病性一個(gè)重要因素，體外通過轉(zhuǎn)染編碼囊膜糖蛋白基因的質(zhì)粒或腺病毒進(jìn)入祀細(xì)胞，能 夠?qū)е蚂爰?xì)胞的脫落，表明埃博拉病毒的囊膜糖蛋白具有細(xì)胞毒性，但是其機(jī)理不詳。因 此，抑制埃博拉病毒的囊膜糖蛋白活性是抑制埃博拉病毒感染祀細(xì)胞的重要途徑。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題如何制備抗埃博拉病毒感染藥物。
[0004] 為解決上述問題，本發(fā)明首先提供了含化蛾胺結(jié)構(gòu)的化合物在制備抗埃博拉病毒 感染藥物中的應(yīng)用。
[0005] 所述抗埃博拉病毒感染藥物可為治療型抗埃博拉病毒感染藥物和/或預(yù)防型抗埃 博拉病毒感染藥物。
[0006] 含化蛾胺結(jié)構(gòu)的化合物在制備抑制埃博拉病毒侵染哺乳動(dòng)物細(xì)胞的產(chǎn)品中的應(yīng) 用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0007] 所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞具體可為人細(xì)胞。所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞具體可為哺乳動(dòng)物肝癌細(xì) 胞。所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞具體可為人肝癌細(xì)胞。所述人肝癌細(xì)胞具體可為HUH7細(xì)胞。
[000引含化蛾胺結(jié)構(gòu)的化合物在制備抑制埃博拉病毒囊膜糖蛋白活性的產(chǎn)品中的應(yīng)用 也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0009] 上述應(yīng)用中，所述埃博拉病毒的囊膜糖蛋白可為al)或a2):
[0010] al)氨基酸序列是序列表序列2所不的蛋白質(zhì)；
[0011] a2)將al)所示的蛋白質(zhì)經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加 得到的與埃博拉病毒的囊膜糖蛋白功能相關(guān)的蛋白質(zhì)。
[0012] 上述任一所述的應(yīng)用中，所述含化蛾胺結(jié)構(gòu)的化合物可為式（I)所示化合物或式 (H)所示化合物；
[0014] 為解決上述問題，本發(fā)明還提供了一種產(chǎn)品。
[0015] 本發(fā)明所提供的產(chǎn)品，其活性成分為含化蛾胺結(jié)構(gòu)的化合物;所述產(chǎn)品可為如下 bl)或 b2)或 b3):
[0016] bl)抗埃博拉病毒感染藥物；
[0017] b2)抑制埃博拉病毒侵染哺乳動(dòng)物細(xì)胞的產(chǎn)品；
[001引b3)抑制埃博拉病毒囊膜糖蛋白活性的產(chǎn)品。
[0019] 上述產(chǎn)品中，所述抗埃博拉病毒感染藥物可為治療型抗埃博拉病毒感染藥物和/ 或預(yù)防型抗埃博拉病毒感染藥物。
[0020] 上述產(chǎn)品中，所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞具體可為人細(xì)胞。上述產(chǎn)品中，所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞 具體可為哺乳動(dòng)物肝癌細(xì)胞。上述產(chǎn)品中，所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞具體可為人肝癌細(xì)胞。所述人 肝癌細(xì)胞具體可為HUH7細(xì)胞。
[0021] 上述產(chǎn)品中，所述埃博拉病毒的囊膜糖蛋白可為al)或a2):
[0022] al)氨基酸序列是序列表序列2所示的蛋白質(zhì)；
[0023] a2)將al)所示的蛋白質(zhì)經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加 得到的與埃博拉病毒的囊膜糖蛋白功能相關(guān)的蛋白質(zhì)。
[0024] 上述任一所述產(chǎn)品中，所述含化蛾胺結(jié)構(gòu)的化合物可為式（I)所示化合物或式 (H)所示化合物；
[00%] 上述任一所述埃博拉病毒可為扎伊爾亞型，具體為H. sapiens wt/GIN/2014/ Gueckedou-COTO
[0027]由于高致病性和傳染性，本發(fā)明中所述埃博拉病毒可用埃博拉假病毒代替，所述 埃博拉假病毒的制備方法可如下：
[002引 1、向質(zhì)粒pcDNA?4/HisMax的限制性內(nèi)切酶BamH巧肋h(yuǎn)oi的識(shí)別序列之間插入核巧 酸序列是序列表中的序列1所示的雙鏈DNA分子，得到重組質(zhì)粒PCDNA4-EB0V-GP。
[00巧]2、將重組質(zhì)粒PCDNA4-EB0V-GP和pNL4.3-Luc-R-E-載體質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染皿K 293T細(xì) 胞，置于37°C、5%C02培養(yǎng)箱解育化，用PBS緩沖液沖洗2次，然后加入DMEM培養(yǎng)基，置于37 °C、5 % C〇2培養(yǎng)箱繼續(xù)解育48h，收集細(xì)胞上清。
[0030] 3、取步驟2收集的細(xì)胞上清，300化pm離屯、lOmin，收集上清液并用0.22皿微孔濾膜 過濾，收集過濾后的液體。
[0031] 4、取步驟3過濾后的液體，30000巧m離屯、2 .化，獲得的沉淀用ImL DMEM培養(yǎng)基溶 解，得到所述埃博拉假病毒的病毒液。
[0032] 序列表中序列2所示的埃博拉病毒的囊膜糖蛋白為埃博拉病毒的扎伊爾亞型的 H. sapiens wt/GIN/2014/Gueckedou-C07的囊膜糖蛋白。因此，含[I比蛾胺結(jié)構(gòu)的化合物具有 抑制具有序列表中序列2所示的埃博拉病毒的囊膜糖蛋白的假病毒的侵染能力，應(yīng)該也具 有抑制扎伊爾亞型的埃博拉病毒的侵染能力。扎伊爾亞型的埃博拉病毒具體可為 H.sapiens wt/GIN/2014/Gueckedou-C07。
[0033] 實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明提供的含化蛾胺結(jié)構(gòu)的化合物在埃博拉假病毒感染前或感染后 對(duì)埃博拉假病毒的感染均具有抑制作用。因此，本發(fā)明提供的含化蛾胺結(jié)構(gòu)的化合物可抑 制埃博拉病毒感染祀細(xì)胞，在制備抗埃博拉病毒感染藥物中具有重要的應(yīng)用價(jià)值。
【附圖說明】
[0034] 圖1為埃博拉假病毒感染前給予化合物I對(duì)埃博拉假病毒感染冊(cè)H7細(xì)胞的抑制作 用。
[0035] 圖2為埃博拉假病毒感染前給予化合物n對(duì)埃博拉假病毒感染HUH7細(xì)胞的抑制作 用。
【具體實(shí)施方式】
[0036] 下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的詳細(xì)描述，給出的實(shí)施例僅為了闡 明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。
[0037] 下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0038] 下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0039] 冊(cè)H7細(xì)胞（人肝癌細(xì)胞）購(gòu)自日本細(xì)胞庫(kù)（Japanese Collection Of Research Bioresources，JCRB)，編號(hào)為JCRB0403。胎牛血清為Sera Pro公司產(chǎn)品。DMEM培養(yǎng)基為 G;Lbco公司產(chǎn)品。二甲基亞諷為Amresco公司產(chǎn)品。Luciferase Cell Culture Lysis 5X Reagent為Promega公司產(chǎn)品，貨號(hào)為E1531。皿K 293T細(xì)胞為中國(guó)普通微生物保藏管理中屯、 (簡(jiǎn)稱CGMCC)產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號(hào)為8.00020。質(zhì)粒pcDNA?4/HisMax為L(zhǎng)ife technologies公司 產(chǎn)品，貨號(hào)為V8642(LPBS緩沖液為BioTopped公司產(chǎn)品，貨號(hào)為top0027eLuciferase Assay System IO-Pack為Promega公司產(chǎn)品，貨號(hào)為E1501。
[0040] ZMapp 2G4單克隆抗體的制備方法參考如下文獻(xiàn)：Q Xiangguo，W Gary, et al.Reversion of advanced Ebola virus disease in nonhuman primates with ZMapp.NaUire.2014,514(10):47-61.
[0041 ] p化4.3-Luc-R-E-載體質(zhì)粒購(gòu)自BioVecto;r中國(guó)質(zhì)粒載體菌株細(xì)胞基因保藏中屯、-NTCC國(guó)家典型培養(yǎng)物保藏中屯、（網(wǎng)址為hUp: //www.biovector.net/)，貨號(hào)為3767994。
[0042] 實(shí)施例1、埃博拉假病毒稀釋液的制備方法
[0043] 由于埃博拉病毒的高致病性和傳染性，埃博拉假病毒能夠代替活病毒的部分研 究。本發(fā)明中使用的埃博拉假病毒的制備方法如下：
[0044] 1、向質(zhì)粒pcDNA?4/HisMax的限制性內(nèi)切酶BamHI和化Ol的識(shí)別序列之間插入核巧 酸序列是序列表中的序列1所示的雙鏈DNA分子，得到重組質(zhì)粒PCDNA4-邸0V-GP。重組質(zhì)粒 PCDNA4-EB0V-GP表達(dá)序列表中序列2所示的埃博拉病毒的囊膜糖蛋白（Glycoprotein,GP)， W下簡(jiǎn)稱GP蛋白。
[0045] 2、將步驟1構(gòu)建的重組質(zhì)粒PCDNA4-邸OV-GP和pNL4.3-Luc-R-E-載體質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染 皿K 293T細(xì)胞（每1 X IO6個(gè)皿K 293T細(xì)胞約轉(zhuǎn)染IOiig重組質(zhì)粒PCDNA4-EB0V-GP和IOiig P化4.3-Luc-R-E-載體質(zhì)粒），置于37 °C、5 % C〇2培養(yǎng)箱解育化，用PBS緩沖液沖洗2次，然后 加入DMEM培養(yǎng)基，置于37°C、5 % C〇2培養(yǎng)箱繼續(xù)解育48h，收集細(xì)胞上清。
[0046] 3、取步驟2收集的細(xì)胞上清，300化pm離屯、lOmin，收集上清液并用0.22皿微孔濾膜 過濾，收集過濾后的液體。
[0047] 4、取步驟3過濾后的液體，30000巧m離屯、2 .化，獲得的沉淀用ImL DMEM培養(yǎng)基溶 解，得到埃博拉假病毒的病毒液。該埃博拉假病毒的病毒液可表達(dá)GP蛋白。
[0048] 取埃博拉假病毒的病毒液，用DMM培養(yǎng)基稀釋至35倍體積，得到埃博拉假病毒稀 釋液。
[0049] 實(shí)施例2、制備化合物I和化合物n
[0051] 按照文獻(xiàn)（Song H，Liu Y et al . Desi即，synthes is，and insecticidal activity of novel pyrazole derivatives containinga-hydroxymethyl-N-benzy