l carboxamide，a-chIoromethyI-N-benzyI carboxamide，and 4，5-dihydrooxazole moieties[J].J.Agric.Food Chem.2012,60，1470-9?和Song H，Liu Y et al.Design， synthesis,and insecticidal evaluation of new pyrazole derivatives containing imine，oxime ether,oxime ester,and dihydroisoxazoline groups based on the inhibitor binding pocket of respiratory complex I.J.Agric.Food Chem.2013，61， 8730-6)中記載的方法制備化合物I和化合物n D化合物I的結(jié)構(gòu)式如式（I)所示，其在文獻 中的名稱為tebufenpyrad。化合物n的結(jié)構(gòu)式如式（n )所示，其在文獻中的名稱為Ethyl 2-(4-(tert-Butyl)phenyl)-2-〇x〇3cetete。
[0052] 實施例3、供試藥抑制埃博拉假病毒感染HUH7細胞
[0053] 采用化合物I或化合物n作為供試藥，進行如下實驗：
[0054] -、埃博拉假病毒感染前給藥對埃博拉假病毒的抑制效應
[0055] 設置試驗組，進行=次重復試驗，每次重復試驗的步驟均如下：
[0056] 1、用膜蛋白酶消化HUH7細胞，然后用含10 % (體積比）胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基重懸 并稀釋，獲得細胞密度為1 X IO5個/mL的細胞懸浮液。
[0057] 2、用二甲基亞諷(DMSO)溶解供試藥，獲得供試藥溶液。
[005引3、取96孔板，每孔接種I(K)化步驟1獲得的細胞懸浮液，然后置于37°C、5%C02的培 養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h。
[0059] 4、完成步驟3后，取所述96孔板，棄上清，每孔加入DMEM培養(yǎng)基10化L，再加入步驟2 制備的供試藥溶液，得到處理體系（當供試藥為化合物I時，處理體系中的供試藥的濃度為 29.95測、7.48祉M、1.872咖、0.46祉M或0.116咖；當供試藥為化合物n時，處理體系中的供 試藥的濃度為27.4祉M、6.87咖、1.71祉M、0.43咖或0.10祉M;每個濃度設置4個復孔），然后 置于37 °C、5 % C〇2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30min。
[0060] 5、完成步驟4后，取所述96孔板，每孔加入10化L實施例1制備的埃博拉假病毒稀釋 液，置于37°C、5 % C〇2的培養(yǎng)箱中解育化。
[OOW] 6、取所述96孔板，吸棄孔內(nèi)的液體，每孔加入10化L PBS緩沖液洗涂一次;然后每 孔加入10化L含5 % (體積比）胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)4她。
[0062] 7、取所述96孔板，吸棄孔內(nèi)的液體，每孔加入10化L PBS緩沖液洗涂一次。
[0063] 8、完成步驟7后，取所述96孔板，每孔加入30化Luciferase Cell Culture Ly S i 巧 X Reagent，裂解 30min。
[0064] 9、完成步驟8后，取所述96孔板，加入Luciferase Assay System 10-Pack，采用巧 光酶標儀檢測巧光值。
[0065] 設置陰性對照組：用等體積二甲基亞諷代替供試藥溶液，其它操作同試驗組。設置 4個復孔。
[0066] 設置陽性對照組：用等體積ZMapp 2G4單克隆抗體代替供試藥溶液，其它操作同試 驗組。陽性對照組中ZMapp 2G4單克隆抗體的濃度為66.667iiM。設置4個復孔。
[0067] 根據(jù)下述公式計算不同濃度的供試藥處理后HUH7細胞的抑制率：
[006引抑制率=(陰性對照組的檢測巧光值-試驗組的檢測巧光值)/陰性對照組的檢測 巧光值X 100%。
[0069] 化合物I對埃博拉假病毒的抑制率的實驗結(jié)果見圖UW供試藥在處理體系中的濃 度W10為底的對數(shù)值為橫坐標，抑制率為縱坐標）。結(jié)果表明，隨著化合物I在處理體系中的 濃度的增加，抑制率也增加?？梢姡２├俨《靖腥厩敖o予化合物I可W抑制埃博拉假病 毒對HUH7細胞的侵染作用。
[0070] 化合物n對埃博拉假病毒的抑制率的實驗結(jié)果見圖2( W供試藥在處理體系中的 濃度WiO為底的對數(shù)值為橫坐標，抑制率為縱坐標）。結(jié)果表明，隨著化合物n在處理體系 中的濃度的增加，抑制率也增加?？梢姡２├俨《靖腥厩敖o予化合物n可W抑制埃博拉 假病毒對HUH7細胞的侵染作用。
[0071 ]二、埃博拉假病毒感染后給藥對埃博拉假病毒的抑制效應
[0072] 設置試驗組，進行=次重復試驗，每次重復試驗的步驟均如下：
[0073] 1、用膜蛋白酶消化HUH7細胞，然后用含10 % (體積比）胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基重懸 并稀釋，獲得細胞密度為1 X IO5個/cm2的細胞懸浮液。
[0074] 2、取96孔板，每孔接種I(K)化步驟1獲得的細胞懸浮液，然后置于37°C、5%C02的培 養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h。
[00巧]3、用二甲基亞諷(DMSO)溶解供試藥，獲得供試藥溶液。
[0076] 4、另取一 96孔板，每孔加入10化L步驟一制備的埃博拉假病毒稀釋液和步驟3制備 的供試藥溶液，得到處理體系（當供試藥為化合物I時，處理體系中的供試藥的濃度為 14.975測、3.74化M、0.936測、0.234測或0.05祉M;當供試藥為化合物n時，處理體系中的供 試藥的濃度為13.740測、3.435iiM、0.859測、0.215測或0.05化M;每個濃度設置4個復孔），然 后置于37°C、5 % C〇2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30min，得到混合液。
[0077] 5、取完成步驟2后的96孔板，吸棄孔內(nèi)的液體，每孔加入10化L PBS緩沖液洗涂一 次;然后每孔加入100化步驟4制備的混合液，置于37°C、5 % C〇2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)化。
[007引6、完成步驟5后，取所述96孔板，吸棄孔內(nèi)的液體，每孔加入10化L PBS緩沖液洗涂 一次，然后每孔加入10化L含5% (體積比）胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)4她。
[OOW] 7、完成步驟6后，取所述96孔板，每孔加入30化Luciferase Cell Culture Ly S i 巧 X Reagent，裂解 30min。
[0080] 8、完成步驟7后，取所述96孔板，加入Luciferase Assay System 10-Pack，采用巧 光酶標儀檢測巧光值。
[0081] 設置陰性對照組：用等體積二甲基亞諷代替供試藥溶液，其它操作同試驗組。設置 4個復孔。
[0082] 設置陽性對照組：用等體積ZMapp 2G4單克隆抗體代替供試藥溶液，其它操作同試 驗組。陽性對照組中ZMapp 2G4單克隆抗體的濃度為66.667iiM。設置4個復孔。
[0083] 根據(jù)下述公式計算不同濃度的供試藥處理后HUH7細胞的抑制率：
[0084] 抑制率=(陰性對照組的檢測巧光值-試驗組的檢測巧光值)/陰性對照組的檢測 巧光值X 100%。
[0085] 供試藥對埃博拉假病毒的抑制率的實驗結(jié)果見表1。結(jié)果表明，隨著供試藥在處理 體系中的濃度的增加，抑制率也增加?？梢?，供試藥可W抑制埃博拉假病毒對HUH7細胞的侵 染作用。
[0086] 表1.供試藥對埃博拉假病毒感染宿主細胞的抑制作用
【主權(quán)項】
1. 含吡螨胺結(jié)構(gòu)的化合物在制備抗埃博拉病毒感染藥物中的應用。2. 含吡螨胺結(jié)構(gòu)的化合物在制備抑制埃博拉病毒侵染哺乳動物細胞的產(chǎn)品中的應用。3. 如權(quán)利要求2所述的應用，其特征在于:所述哺乳動物細胞為人肝癌細胞。4. 含吡螨胺結(jié)構(gòu)的化合物在制備抑制埃博拉病毒的囊膜糖蛋白的活性的產(chǎn)品中的應 用。5. 如權(quán)利要求4所述的應用，其特征在于:所述埃博拉病毒的囊膜糖蛋白為al)或a2): al)氣基酸序列是序列表序列2所不的蛋白質(zhì)； a2)將al)所示的蛋白質(zhì)經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加得到 的與埃博拉病毒的囊膜糖蛋白功能相關(guān)的蛋白質(zhì)。6. 如權(quán)利要求1至5任一所述的應用，其特征在于:所述含吡螨胺結(jié)構(gòu)的化合物為式（I) 所示化合物或式（Π )所示化合物；7. -種產(chǎn)品，其活性成分為含吡螨胺結(jié)構(gòu)的化合物;所述產(chǎn)品為如下bl)或b2)或b3): bl)抗埃博拉病毒感染藥物； b2)抑制埃博拉病毒侵染哺乳動物細胞的產(chǎn)品； b3)抑制埃博拉病毒的囊膜糖蛋白的活性的產(chǎn)品。8. 如權(quán)利要求7所述的產(chǎn)品，其特征在于：所述b2)中，所述哺乳動物細胞為人肝癌細 胞。9. 如權(quán)利要求7所述的產(chǎn)品，其特征在于:所述b3)中，所述埃博拉病毒的囊膜糖蛋白為 al)或a2): al)氣基酸序列是序列表序列2所不的蛋白質(zhì)； a2)將al)所示的蛋白質(zhì)經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加得到 的與埃博拉病毒的囊膜糖蛋白功能相關(guān)的蛋白質(zhì)。10. 如權(quán)利要求7至9任一所述的產(chǎn)品，其特征在于： 所述含吡螨胺結(jié)構(gòu)的化合物為式(I)所示化合物或式（Π )所示化合物；
【專利摘要】本發(fā)明公開了含吡螨胺結(jié)構(gòu)的化合物在制備抗埃博拉病毒感染藥物中的應用。本發(fā)明所提供的含吡螨胺結(jié)構(gòu)的化合物為式(Ⅰ)所示化合物或式(Ⅱ)所示化合物。實驗證明，在埃博拉假病毒感染前后，本發(fā)明提供的含吡螨胺結(jié)構(gòu)的化合物均可以抑制埃博拉假病毒對HUH7細胞的侵染作用。因此，含吡螨胺結(jié)構(gòu)的化合物可抑制埃博拉病毒感染靶細胞，在制備抗埃博拉病毒感染藥物中具有重要的應用價值。
【IPC分類】A61K31/415, A61P31/14
【公開號】CN105663123
【申請?zhí)枴緾N201610172558
【發(fā)明人】張立新, 汪清民, 高福, 馬榮, 宋紅健, 李燕, 代煥琴, 王茲穩(wěn), 宋福行, 劉玉秀
【申請人】中國科學院微生物研究所, 南開大學
【公開日】2016年6月15日
【申請日】2016年3月24日