專利名稱：籽粒特異性啟動子及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種籽粒特異性啟動子及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
啟動子是RNA聚合酶能夠識別并與之結(jié)合，從而起始基因轉(zhuǎn)錄的一段DNA序列，通常位于基因上游。一個典型的啟動子包括CAAT-box和TATA-box，它們分別是RNA聚合酶的識別和結(jié)合位點，一般位于轉(zhuǎn)錄起始位點上游幾十個堿基處。在核心啟動子上游通常會有一些特殊的DNA序列，即順式作用元件，轉(zhuǎn)錄因子與之結(jié)合從而激活或抑制基因的轉(zhuǎn)錄。一旦RNA聚合酶定位并結(jié)合在啟動子上即可啟動基因轉(zhuǎn)錄，因此啟動子是基因表達(dá)調(diào)控的重要元件，它與RNA聚合酶及其他蛋白輔助因子等反式作用因子的相互作用是啟動子調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的實質(zhì)。根據(jù)啟動子的轉(zhuǎn)錄模式可將其分為三類組成型啟動子、特異性啟動子(組織或器官特異性啟動子)和誘導(dǎo)型啟動子。在組成型啟動子調(diào)控下，不同組織器官和發(fā)育階段的基因表達(dá)沒有明顯差異， 因而稱之為組成型啟動子。雙子葉植物中最常使用的組成型啟動子是花椰菜花葉病毒 (CaMV)35S啟動子，單子葉植物中常用的組成型啟動子是玉米的泛素蛋白(ubiquitin)啟動子，水稻的肌動蛋白(actin)啟動子等。由于組成型啟動子驅(qū)動的基因在植物各組織中均有不同程度表達(dá)，在應(yīng)用中逐漸暴露出一些問題。例如外源基因在整株植物中表達(dá)，產(chǎn)生的大量異源蛋白質(zhì)或代謝產(chǎn)物在植物體內(nèi)積累，打破了植物原有的代謝平衡，有些產(chǎn)物對植物并非必需甚至有毒，因而阻礙了植物的正常生長，甚至導(dǎo)致死亡。另外，重復(fù)使用同一種啟動子驅(qū)動兩個或兩個以上的外源基因可能引起基因沉默或共抑制現(xiàn)象。因此，人們尋找更為有效的特異性啟動子代替組成型啟動子，以便更好地調(diào)控植物基因表達(dá)。特異性啟動子調(diào)控下的基因轉(zhuǎn)錄一般只發(fā)生在某些特定器官或組織中，如根、莖、 葉、果實和種子特異性啟動子。目前，已發(fā)現(xiàn)這類啟動子中一般同時存在幾種控制組織特異性表達(dá)的元件，其表達(dá)特異性由這些元件的種類、數(shù)目及相對位置等共同決定。禾谷類作物是人類主要的食物來源，種子是其可以食用的部分。隨著基因工程的發(fā)展，人們從禾谷類作物中克隆了許多種子特異性啟動子，并將它們應(yīng)用于禾谷類籽粒品質(zhì)的改良之中。應(yīng)用較多的是來源于普通小麥的高分子量麥谷蛋白亞基1Dx5、Bxl7、水稻的Glt等。但這些啟動子的啟動外源基因表達(dá)活性存在差異，其表達(dá)活性不能滿足基因工程的需要，而且在需要多基因串聯(lián)時，如果利用同一啟動子驅(qū)動不同的基因表達(dá)，很容易導(dǎo)致基因沉默。因此，多途徑尋找轉(zhuǎn)錄效率更高的種子特異性啟動子，對于提高目標(biāo)基因的表達(dá)，改良禾谷類植物的加工和營養(yǎng)品質(zhì)具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種籽粒特異性啟動子及其應(yīng)用。本發(fā)明提供的啟動子，獲自燕麥品種冀張燕1號，是序列表中序列1所示的DNA分子。
含有所述啟動子的重組表達(dá)載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍?？捎矛F(xiàn)有的表達(dá)載體構(gòu)建含有所述啟動子的重組表達(dá)載體。為了便于鑒定及篩選，可對所用表達(dá)載體進(jìn)行加工，如加入編碼可產(chǎn)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因、具有抗性的抗生素標(biāo)記物或是抗化學(xué)試劑標(biāo)記基因等。所述重組表達(dá)載體具體可為將所述DNA分子插入質(zhì)粒PCAMBIA3301的多克隆位點得到的重組質(zhì)粒。本發(fā)明還保護(hù)一種在植物籽粒中特異表達(dá)外源基因的方法，是將DNA片段甲導(dǎo)入植物中，從而在植物籽粒中特異表達(dá)所述外源基因；所述DNA片段甲中由所述啟動子啟動所述外源基因的表達(dá)。所述DNA片段甲具體可通過重組表達(dá)載體導(dǎo)入所述植物；所述重組表達(dá)載體可為將所述DNA分子和所述外源基因插入質(zhì)粒pCAMBIA3301的多克隆位點得到的重組質(zhì)粒。所述重組表達(dá)載體可通過使用Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、 顯微注射、電導(dǎo)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)、基因槍等常規(guī)生物學(xué)方法轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或組織，并將轉(zhuǎn)化的植物組織培育成植株。本發(fā)明還保護(hù)一種在植物籽粒中特異表達(dá)基因的方法，是將含有所述啟動子的重組表達(dá)載體導(dǎo)入植物中，由所述啟動子啟動其下游基因在植物籽粒中特異表達(dá)。所述重組表達(dá)載體具體可為將所述DNA分子插入質(zhì)粒pCAMBIA3301的多克隆位點得到的重組質(zhì)粒。 所述基因具體可為Gus基因。所述重組表達(dá)載體可通過使用Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、顯微注射、電導(dǎo)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)、基因槍等常規(guī)生物學(xué)方法轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或組織，并將轉(zhuǎn)化的植物組織培育成植株。以上任一所述的方法中，所述植物可為單子葉植物或雙子葉植物。所述單子葉植物具體可為小麥，如小麥K35。本發(fā)明提供的啟動子具有高效的啟動活性和高度的組織特異性表達(dá)，為利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)改良小麥的籽粒性狀提供了良好的基礎(chǔ)材料。


圖1為新克隆啟動子(序列1)與已有序列(序列2)的比對圖。圖2為啟動子發(fā)現(xiàn)過程中的PCR電泳圖；1-6為PCR產(chǎn)物，M為分子量標(biāo)記。圖3為構(gòu)建重組質(zhì)粒甲過程中的PCR鑒定電泳圖；M為分子量標(biāo)記，其它泳道均為連接產(chǎn)物。圖4為構(gòu)建重組質(zhì)粒甲過程中的酶切鑒定電泳圖；M為分子量標(biāo)記，其它泳道均為連接產(chǎn)物。圖5為用重組質(zhì)粒甲制備的再生苗的PCR鑒定電泳圖；M為分子量標(biāo)記；CK+為重組質(zhì)粒甲，CK-為小麥K35 ；其它泳道均為再生苗。圖6為三種轉(zhuǎn)基因植株的根和葉Gus染色后的照片；1 為轉(zhuǎn)基因植株甲；2為轉(zhuǎn)基因植株乙；3為轉(zhuǎn)基因植株丙。圖7為三種轉(zhuǎn)基因植株的籽粒Gus染色后的照片。
具體實施方式
以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設(shè)置三次重復(fù)實驗，結(jié)果取平均值。質(zhì)粒PGEM-iTeasy、質(zhì)粒pCAMBIA3301和質(zhì)粒pCAMBIA1381xb均購自長沙贏潤生物技術(shù)有限公司(http://WWW. yrbio. com)。用于質(zhì)粒DNA和基因組DNA提取的試劑盒購自天根生化科技有限公司(http://www.tiangen.com/)。金粉及基因槍轉(zhuǎn)化過程中所需的耗材均購自北京元業(yè)伯樂科技發(fā)展有限公司(http://www. ybr. com, cn)。各種無機(jī)鹽、維生素、抗生素、激素，以及Gus染色所需的試劑均購自Sigma-Aldrich中國公司(http://www. sigmaaldrich. com/china-mainland, html)。燕麥品種冀張燕1號公眾可從中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所和山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所獲得；參考文獻(xiàn)利用核不育莜麥ZY基因育成優(yōu)質(zhì)高蛋白燕麥新品種.楊才，張新軍，楊曉虹，李天亮.河北北方學(xué)院學(xué)報(自然科學(xué)版)，2009，25(1)39-41。小麥K35 是山東省農(nóng)科院作物所自行選育的具有良好幼胚培養(yǎng)能力的新種質(zhì)； 公眾可從中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所和山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所獲得；參考文獻(xiàn)隋新霞，黃承彥，楚秀生，李根英，樊慶琦.易花藥培養(yǎng)的早熟小麥新種質(zhì)K35.山東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007年第一期，116-117頁。脫分化培養(yǎng)基按照如下方法制備將2，4-D、特美汀和MS培養(yǎng)基混合，得到脫分化培養(yǎng)基；2，4-D在所述脫分化培養(yǎng)基中的濃度為ang/L，特美汀在所述脫分化培養(yǎng)基中的濃度為 150mg/L。滲透培養(yǎng)基按照如下方法制備將2，4_D、特美汀、山梨醇、甘露醇和MS培養(yǎng)基混合，得到滲透培養(yǎng)基；2，4-D在所述滲透培養(yǎng)基中的濃度為ang/L，特美汀在所述滲透培養(yǎng)基中的濃度為150mg/L，山梨醇在所述滲透培養(yǎng)基中的濃度為0. 2M，甘露醇在所述滲透培養(yǎng)基中的濃度為0. 2M。誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)基按照如下方法制備將2，4-D、Biolaphos和MS培養(yǎng)基混合，得到誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)基；2，4-D在誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)基中的濃度為ang/L，Biolaphos在誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)基中的濃度為5mg/L。再生篩選培養(yǎng)基按照如下方法制備將KT、Bi0laph0S和MS培養(yǎng)基混合，得到再生篩選培養(yǎng)基；KT在所述再生篩選培養(yǎng)基中的濃度為ang/L，Biolaphos在所述再生篩選培養(yǎng)基中的濃度為5mg/L。后期篩選培養(yǎng)基將Biolaphos和MS培養(yǎng)基混合，得到后期篩選培養(yǎng)基，所述 Biolaphos在所述后期篩選培養(yǎng)基中的濃度為5mg/L。實驗例1、特異性啟動子的發(fā)現(xiàn)和序列分析一、啟動子序列的發(fā)現(xiàn)1、用DNA提取試劑盒(天根)從燕麥品種冀張燕1號在黑暗中萌發(fā)的幼苗中提取基因組DNA。2、根據(jù)現(xiàn)有啟動子(GENBANKACCESSION NO. AY795082，見序列表的序列2)的保守區(qū)設(shè)計一對引物如下Fl (上游弓丨物)5，-cgaagctttggaaagtcattttgcctc-3‘；
Rl (下游弓丨物)5，-gcccatgggagattgtagaaggtggattgg-3‘。3、以步驟1的基因組DNA為模板，用步驟2設(shè)計的引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物。PCR體系(20 μ 1)含50ng基因組DNAUOpmol上游引物、IOpmol下游引物、dNTPs 各 250μΜ、2μ1 10Xbuffer(50mM KClUOmM Tris-HCl U. 5mM MgCl2, pH 8. 3)和 2. OU pfu
聚合酶(大連寶生物)，其余為水。PCR 程序:94°C 3 分鐘；94°C 45 秒、60°C 45 秒、72°C 1 分鐘，36 個循環(huán)；72°C 10 分鐘。4、將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1. 2%瓊脂糖膠電泳，EB染色后進(jìn)行紫外觀察照相，電泳圖見圖2。5、從步驟4的電泳膠中回收約961bp的目的片段，與質(zhì)粒pGEM-Teasy連接后進(jìn)行測序，測序結(jié)果表明，目的片段如序列表的序列1所示，將在質(zhì)粒PGEM-Teasy中插入序列表的序列1所示DNA得到的重組質(zhì)粒命名為重組質(zhì)粒pTglo (也可人工合成序列1所示DNA 并與質(zhì)粒pGEM-Teasy連接)。二、啟動子的序列分析將序列1與序列2進(jìn)行比對，見圖1，相似性達(dá)到99%，存在8個SNP。將序列2作為基礎(chǔ)序列，序列1與基礎(chǔ)序列的差異如下自5’末端第85位核苷酸由A突變?yōu)镚，第364 位核苷酸由T變?yōu)锳，第369位核苷酸由A突變?yōu)門，第619位核苷酸和第620位核苷酸之間插入了 A，第639位核苷酸由T突變?yōu)镃，第700位核苷酸和第787位核苷酸由G突變?yōu)?A，第857位核苷酸由T突變?yōu)镃。實驗例2、重組質(zhì)粒的構(gòu)建一、重組質(zhì)粒甲的構(gòu)建(1)以重組質(zhì)粒pTglo為模板，用Fl和Rl組成的引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR
擴(kuò)增產(chǎn)物。(2)用限制性內(nèi)切酶HindIII和NcoI雙酶切步驟(1)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，回收酶切產(chǎn)物。(3)用限制性內(nèi)切酶HindIII和NcoI雙酶切質(zhì)粒pCAMBIA3301，回收載體骨架(約 11076bp)。(4)將步驟O)的酶切產(chǎn)物和步驟(3)的載體骨架連接，得到連接產(chǎn)物。(5)將步驟(4)的連接產(chǎn)物依次進(jìn)行PCR鑒定(采用Fl和Rl組成的引物對)、酶切鑒定(采用HindIII和NcoI雙酶切)和測序鑒定，得到重組質(zhì)粒甲。PCR鑒定電泳圖見圖3，具有約961bp的目的條帶的為陽性。酶切鑒定電泳圖見圖4，具有約961bp的目的條帶的為陽性。根據(jù)測序結(jié)果，對重組質(zhì)粒甲進(jìn)行結(jié)構(gòu)描述如下用序列表的序列1所示的DNA取代了質(zhì)粒PCAMBIA3301的HindIII和NcoI酶切位點之間的小片段(CaMV35S啟動子)，由序列1所示的DNA啟動Gus基因的表達(dá)。二、重組質(zhì)粒乙的構(gòu)建(1)合成序列表的序列2所示的DNA分子。(2)以步驟1合成的DNA分子為模板，用Fl和Rl組成的引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。(3)用限制性內(nèi)切酶HindIII和NcoI雙酶切步驟⑵的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，回收酶切產(chǎn)物。(4)用限制性內(nèi)切酶HindIII和NcoI雙酶切質(zhì)粒pCAMBIA3301，回收載體骨架(約 11076bp)。(5)將步驟(3)的酶切產(chǎn)物和步驟⑷的載體骨架連接，得到重組質(zhì)粒乙。根據(jù)測序結(jié)果，對重組質(zhì)粒乙進(jìn)行結(jié)構(gòu)描述如下用序列表的序列2所示的DNA取代了質(zhì)粒 PCAMBIA3301的HindIII和NcoI酶切位點之間的小片段(CaMV35S啟動子)，由序列2所示的DNA啟動Gus基因的表達(dá)。三、重組質(zhì)粒丙的構(gòu)建將質(zhì)粒pCAMBIA1381xb (—種植物表達(dá)載體，含有Gus基因，但沒有啟動Gus基因表達(dá)的啟動子)作為陰性對照(重組質(zhì)粒丙)。實施例3、轉(zhuǎn)基因植物的獲得分別用重組質(zhì)粒甲、重組質(zhì)粒乙和重組質(zhì)粒丙制備轉(zhuǎn)基因植株(每種質(zhì)粒轉(zhuǎn)化 2000個盾片)一、小麥盾片的分離與預(yù)處理采集授粉14天的未成熟小麥K35種子(盾片大小Imm)，用75% (體積比)乙醇水溶液處理30秒，0. 1% (g/100mL)升汞(HgCl2)水溶液處理10分鐘，在無菌操作臺中用解剖針取下幼胚，胚軸朝下接種于脫分化培養(yǎng)基。次日，在顯微鏡下用15號刀片從種子的胚軸和盾片接觸處切除胚軸，得到盾片。將去除胚軸的盾片分別放回脫分化培養(yǎng)基上，保持相同的方向(切面接觸培養(yǎng)基)，26°C暗培養(yǎng)3天。然后將盾片集中于內(nèi)有滲透培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中心約2. 5cm的范圍內(nèi)(每皿約40個)J6°C、暗培養(yǎng)4小時。二、子彈的制備1、金粉母液的制備取1. O μ m的金粉10mg，用70 % (體積比)乙醇水溶液洗3次(每次IOOOOrpm離心1分鐘)，加Iml滅菌水振蕩2分鐘，得到金粉貯藏液。2、子彈的制備將金粉貯藏液充分渦旋，取100 μ 1放入硅化的1. 5ml離心管中，14000rpm離心30 秒，棄上清。加入50 μ 1水將金粉懸浮，在震蕩器上邊輕微震蕩邊往里加入10 μ 1 lug/μι 的質(zhì)粒(重組質(zhì)粒甲、重組質(zhì)粒乙或重組質(zhì)粒丙)，再加入新配制的20 μ 1 0. IM亞精胺水溶液，再加入50 μ 1 2. 5Μ CaCl2水溶液，高速蝸旋3分鐘，將離心管放在冰上約2分鐘讓金粉自動沉淀一會兒，IOOOOrpm離心10秒，棄上清。加750 μ 1無水乙醇，高速蝸旋，然后將離心管放在冰上約2分鐘讓金粉自動沉淀，IOOOOrpm離心10秒，棄上清，用100 μ 1無水乙醇懸浮，插到冰上或放入-20°C冰箱暫時保存，準(zhǔn)備打槍。3、采用基因槍法將步驟二制備的子彈轟擊步驟一處理后的盾片，參數(shù)如下金粉用量為IOOug/槍、質(zhì)粒用量為lug/μ 1、轟擊距離為9cm，基因槍壓力為28，金粉粒度為 1. 0 μ m。三、轉(zhuǎn)基因小麥的獲得將基因槍轉(zhuǎn)化后的盾片置于誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)基上，26°C暗培養(yǎng)10天。在顯微鏡下將
7愈傷組織切割成約Imm左右的小塊，來源于同一塊愈傷組織的小塊排在一起，放在誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)基上，26°C暗培養(yǎng)20天。選擇愈傷組織選擇油光發(fā)亮的愈傷，轉(zhuǎn)移到再生篩選培養(yǎng)基上，在^TC、光照強(qiáng)度lOOOLux的條件下培養(yǎng)7天。選擇5cm左右的苗轉(zhuǎn)移到后期篩選培養(yǎng)基上，在^TC、光照強(qiáng)度lOOOLux的條件下培養(yǎng)20天，得到再生苗(TO代)。將再生苗轉(zhuǎn)移到草炭(KLASMAN)中，在人工氣候室中培養(yǎng)(白天20°C、夜晚16°C ；光照16小時/黑暗 8小時)直至收獲。實驗例4、轉(zhuǎn)基因植株不同部位的Gus基因表達(dá)活性分析一、再生苗的PCR鑒定分別將實施例3得到的各個再生苗進(jìn)行如下鑒定剪取約3cm長的葉尖，提取基因組DNA，用F2和R2組成的引物對(靶序列為Gus基因)進(jìn)行PCR鑒定，目標(biāo)片段約為617bp。F2(上游引物)5，-GGTCACTCATTACGGCAAAGT-3，；R2 (下游引物)5，-GACGACCAAAGCCAGTAAAGT-3，。PCR體系(20 μ 1)含50ng基因組DNAUOpmol上游引物、IOpmol下游引物、dNTPs 各 250μΜ、2μ1 10Xbuffer(50mM KClUOmM Tris-HClU. 5mM MgCl2, pH 8.3)禾口 2. OU rTaq聚合酶(大連寶生物)，其余為水。PCR 程序94°C 3 分鐘；94 V 30 秒、58 V 30 秒、72 °C 45 秒，36 個循環(huán)；72 °C 8 分鐘。用重組質(zhì)粒甲制備的再生苗的部分結(jié)果見圖5，得到12株陽性植株(轉(zhuǎn)基因植株甲)。采用重組質(zhì)粒乙得到8株陽性植株(轉(zhuǎn)基因植株乙)。采用重組質(zhì)粒丙得到5株陽性植株(轉(zhuǎn)基因植株丙)。2、Gus 染色將PCR鑒定為陽性的植株分別進(jìn)行如下Gus染色⑶S染色液使用液由溶質(zhì)和溶劑組成；所述溶劑為pH 7. 0,0. 2M的磷酸鈉緩沖液； 所述溶質(zhì)及其⑶S染色液中的濃度如下0. 5M鐵氰化鉀、0.5M亞鐵氰化鉀、10 μ M EDTA, 0. 6mg/L Triton、0. 5mg/ml X-gluc。植株開花兩周后，取其部分籽粒、葉和根分別裝入5ml離心管中，用Gus染色液完全浸沒，37°C震蕩過夜，次日用70%乙醇水溶液沖洗3次，觀察Gus基因表達(dá)強(qiáng)度。三種轉(zhuǎn)基因植株的根和葉中均沒有藍(lán)色信號出現(xiàn)，部分植株根和葉的照片見圖6。所有轉(zhuǎn)基因植株甲的籽粒中都有藍(lán)色信號出現(xiàn)，所有轉(zhuǎn)基因植株乙的籽粒中都有藍(lán)色信號出現(xiàn)，且轉(zhuǎn)基因甲的籽粒的顏色比轉(zhuǎn)基因植株乙的籽粒的顏色深的多。所有轉(zhuǎn)基因植株丙的籽粒中均沒有藍(lán)色信號出現(xiàn)。部分植株籽粒的照片見圖7。結(jié)果表明，本發(fā)明提供的啟動子具有良好的籽粒組織特異性，且啟動活性優(yōu)于現(xiàn)有的啟動子。
權(quán)利要求
1.序列表中序列1所示的DNA分子。
2.含有權(quán)利要求1所述DNA分子的重組表達(dá)載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌。
3.如權(quán)利要求2所述的重組表達(dá)載體，其特征在于所述重組表達(dá)載體是將所述DNA 分子插入質(zhì)粒PCAMBIA3301的多克隆位點得到的重組質(zhì)粒。
4.一種在植物籽粒中特異表達(dá)外源基因的方法，是將DNA片段甲導(dǎo)入植物中，從而在植物籽粒中特異表達(dá)所述外源基因；所述DNA片段甲中由權(quán)利要求1所述DNA分子啟動所述外源基因的表達(dá)。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述DNA片段甲通過重組表達(dá)載體導(dǎo)入所述植物；所述重組表達(dá)載體為將所述DNA分子和所述外源基因插入質(zhì)粒pCAMBIA3301的多克隆位點得到的重組質(zhì)粒。
6.一種在植物籽粒中特異表達(dá)基因的方法，是將含有權(quán)利要求1所述DNA分子的重組表達(dá)載體導(dǎo)入植物中，由所述DNA分子啟動其下游基因在植物籽粒中特異表達(dá)。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述重組表達(dá)載體是將所述DNA分子插入質(zhì)粒pCAMBIA3301的多克隆位點得到的重組質(zhì)粒。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于所述基因為Gus基因。
9.如權(quán)利要求4或8中任一所述的方法，其特征在于所述植物為單子葉植物或雙子葉植物。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于所述單子葉植物為小麥。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種籽粒特異性啟動子及其應(yīng)用。本發(fā)明提供的啟動子為序列表中序列1所示的DNA分子。本發(fā)明還提供了一種在植物籽粒中特異表達(dá)基因的方法，是將含有所述DNA分子的重組表達(dá)載體導(dǎo)入植物中，由所述DNA分子啟動其下游基因在植物籽粒中特異表達(dá)。本發(fā)明提供的啟動子具有高效的啟動活性和高度的組織特異性表達(dá)，為利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)改良小麥的籽粒性狀提供了良好的基礎(chǔ)材料。
文檔編號C12N1/15GK102533766SQ20121000724
公開日2012年7月4日 申請日期2012年1月11日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月11日
發(fā)明者何中虎, 夏先春, 宋華東, 宋國琦, 李根英, 李玉蓮, 高潔, 黃承彥 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所, 山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所