專利名稱：一種利用調(diào)節(jié)異黃酮生物合成提高大豆遺傳轉(zhuǎn)化效率的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物基因工程領(lǐng)域，涉及ー種利用調(diào)節(jié)異黃酮生物合成提高大豆遺傳轉(zhuǎn)化效率的方法，更具體的說是ー種通過抑制大豆異黃酮生物合成途徑的關(guān)鍵酶-苯丙氨酸解氨酶PAL的活性，克服大豆遺傳轉(zhuǎn)化障礙、提高其農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化效率的方法。
背景技術(shù)：
作物遺傳轉(zhuǎn)化常用的方法是基因槍法和農(nóng)桿菌法?；驑尫ㄓ捎诖┩噶?qiáng)，包被在微彈中的外源基因借助轟擊壓力直接穿過細(xì)胞壁和細(xì)胞膜而進(jìn)入植物基因組，從而實(shí)現(xiàn)外源基因轉(zhuǎn)化的目的，因此基因槍法具有轉(zhuǎn)化時(shí)間短、無宿主限制等優(yōu)點(diǎn)。但適宜基因槍法的受體大多需要經(jīng)過愈傷誘導(dǎo)、綠苗分化再生等繁瑣的組織培養(yǎng)過程，而大豆的愈傷誘導(dǎo)、 綠苗分化再生較難，因此目前很少用基因槍法轉(zhuǎn)化大豆。農(nóng)桿菌法是利用根癌農(nóng)桿菌對植物的侵染特性把外源基因?qū)胫参锘蚪M的方法，因其拷貝數(shù)少、整合完整、遺傳穩(wěn)定以及受目的基因分子量限制小而廣泛應(yīng)用于植物的遺傳轉(zhuǎn)化。雙子葉植物雖然是農(nóng)桿菌的天然宿主，但直到1983年才由Pederson等證明了大豆可作為農(nóng)桿菌的合適宿主。Hinchee等 (1988)首次報(bào)告了農(nóng)桿菌成功轉(zhuǎn)化大豆的事例。自Hinchee等(1988)首次報(bào)道利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化大豆子葉節(jié)成功以來，因其不必經(jīng)過愈傷組織的誘導(dǎo)過程，直接從子葉節(jié)部位的分生組織分化出芽，解決了大豆的離體再生難問題，使得農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化子葉節(jié)法成為最常用的大豆遺傳轉(zhuǎn)化方法。目前對農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化大豆的研究主要集中在選用強(qiáng)毒カ菌株、構(gòu)建高效表達(dá)載體、添加化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)WR基因的高效表達(dá)、以及防止組織壞死提高T-DNA轉(zhuǎn)移效率等方面，這些都是通過研究農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化大豆的外源物質(zhì)或農(nóng)桿菌本身等大豆外部因素來實(shí)現(xiàn)大豆遺傳轉(zhuǎn)化的，轉(zhuǎn)化率低，而對于通過調(diào)節(jié)大豆內(nèi)源物質(zhì)降低對農(nóng)桿菌侵染的抑制作用方面的研究未見報(bào)道。大豆富含異黃酮，大豆異黃酮可調(diào)節(jié)復(fù)雜的植物/微生物互作(馬君蘭等，2007)， 在動(dòng)物上具有提高機(jī)體免疫力的功效。異黃酮類物質(zhì)是由苯丙烷類代謝途徑的ー個(gè)分支所合成的，而苯丙氨酸解氨酶PAL是其生物合成途徑的第一個(gè)關(guān)鍵酶，能夠在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平對異黃酮的生物合成進(jìn)行調(diào)控。有研究表明，苯丙氨酸解氨酶PAL抑制劑處理甘薯后幾個(gè)小時(shí)內(nèi)就可以檢測到PAL酶活性的降低及下游代謝產(chǎn)物合成積累的受阻(王敬文等， 1981)，而農(nóng)桿菌一般在附著外植體16個(gè)小時(shí)后才開始T-DNA的轉(zhuǎn)移(王關(guān)林等，1998)，這就為農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化大豆過程中人為調(diào)控PAL酶活性提供可能性和時(shí)機(jī)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是為了克服上述技術(shù)缺陷提供ー種利用調(diào)節(jié)異黃酮生物合成提高大豆遺傳轉(zhuǎn)化效率的方法。本發(fā)明的原理是通過苯丙氨酸解氨酶PAL活性抑制劑，抑制大豆異黃酮合成的關(guān)鍵酶PAL，減少大豆異黃酮類次生代謝產(chǎn)物的合成和積累，從而降低大豆外植體的“免疫力”，提高農(nóng)桿菌的被侵染力，也就是說從改善植物/農(nóng)桿菌互作關(guān)系方面提供了 ー種提高大豆遺傳轉(zhuǎn)化效率的方法。本發(fā)明提供了ー種利用調(diào)節(jié)異黃酮生物合成提高大豆遺傳轉(zhuǎn)化效率的方法，其特征在于包括如下步驟①種子的消毒取健康飽滿大豆種子，放入含有IOOml 30%次氯酸鈉和細(xì)1濃鹽酸的密閉容器內(nèi)，利用反應(yīng)生成的氯氣消毒M 36小時(shí)；②種子的萌發(fā)培養(yǎng)將步驟①中的種子接種到も萌苗培養(yǎng)基中進(jìn)行為期5 6天的25°C、16/ !光暗周期的培養(yǎng)；③外植體制備將步驟②中的種子在無菌條件下去掉種皮、切掉幼葉和上胚軸，保留0. 5 2. Ocm的下胚軸，用手木刀片對子葉節(jié)部位進(jìn)行創(chuàng)傷處理；④固體共培養(yǎng)基的制備向經(jīng)過121°C高壓滅菌15min后的含有も大量元素、B5 微量元素、6-BA、IBA、MES、蔗糖、瓊脂，PH 5. 4的培養(yǎng)基中，再加入抽濾滅菌的硫代硫酸鈉， DTT,半胱氨酸，B5有機(jī)成分、乙酰丁香酮AS及苯丙氨酸解氨酶PAL活性抑制劑，混勻后按 30ml/皿分裝到Φ 90mm的滅菌培養(yǎng)皿中；⑤農(nóng)桿菌侵染液的制備將含有外源基因的重組農(nóng)桿菌懸于含有大量元素、微量元素、IX^有機(jī)成分6-BA1. Omgじ1、IBA 0. 2mg じ1、MES 3. 9g じ1、蔗糖30g じ1，乙酰丁香酮AS200yM，PH 5. 4的培養(yǎng)基中，調(diào)節(jié)菌液濃度到OD6tltl ^ 0. 5，室溫靜置半小時(shí)備用；⑥農(nóng)桿菌侵染和共培養(yǎng)將步驟③中的外植體放入IOOml三角瓶中，加入步驟⑤ 制備的農(nóng)桿菌侵染液中，搖床上SOrpm低速轉(zhuǎn)動(dòng)30分鐘后，取出外植體，用滅菌濾紙吸掉多余菌液，擺放到步驟④中固體共培養(yǎng)培養(yǎng)基上，暗培養(yǎng)3 5天；⑦芽誘導(dǎo)和抗性植株的獲得將步驟⑥中的外植體轉(zhuǎn)移到恢復(fù)培養(yǎng)基上培養(yǎng)7天后，轉(zhuǎn)移到帶有篩選壓的芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)14 21天，然后將誘導(dǎo)出抗性芽的外植體轉(zhuǎn)移到芽伸長培養(yǎng)基上進(jìn)行芽伸長，芽長4 5cm時(shí)轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基中，獲得轉(zhuǎn)化再生植株移栽到花盆中獲得轉(zhuǎn)化的抗性植株。所述ー種利用調(diào)節(jié)異黃酮生物合成提高大豆遺傳轉(zhuǎn)化效率的方法，其特征在于步驟④固體共培養(yǎng)基的制備中所述的苯丙氨酸解氨酶PAL活性抑制劑為α -氨氧基乙酸Α0Α、 放線菌素D、激酶抑制劑1(25 其中的ー種。所述ー種利用調(diào)節(jié)異黃酮生物合成提高大豆遺傳轉(zhuǎn)化效率的方法，其特征在于驟 ④中所述固體共培養(yǎng)基的制備為向經(jīng)過121°C高壓滅菌15min后的含有大量元素、微量元素、6-BA1. Omg じ1、IBA 0. 2mg じ1、MES 3. 9g じ1、蔗糖 30g じ1、瓊脂 5g じ1，PH 5.4的培養(yǎng)基中，再加入抽濾滅菌的硫代硫酸鈉158mgじ1，DTT 154mgじ1，半胱氨酸 Igじ1，IXB5有機(jī)成分，AS 200 μ M及20 50 μ moIL"1 α -氨氧基乙酸AOA苯丙氨酸解氨酶 PAL活性抑制劑，混勻后按30ml/皿分裝到Φ90mm的滅菌培養(yǎng)皿中。所述ー種利用調(diào)節(jié)異黃酮生物合成提高大豆遺傳轉(zhuǎn)化效率的方法，其特征在于驟 ④中所述固體共培養(yǎng)基的制備為向經(jīng)過121°C高壓滅菌15min后的含有大量元素、微量元素、6-BA1. Omg じ1、IBA 0. 2mg じ1、MES 3. 9g じ1、蔗糖 30g じ1、瓊脂 5g じ1，PH 5.4的培養(yǎng)基中，再加入抽濾滅菌的硫代硫酸鈉158mgじ1，DTT 154mgじ1，半胱氨酸 Igじ1，IXB5有機(jī)成分，AS 200 μ M及2. 39 μ mo 1じ1放線菌素D苯丙氨酸解氨酶PAL活性抑制劑，混勻后按30ml/皿分裝到Φ90mm的滅菌培養(yǎng)皿中。
所述ー種利用調(diào)節(jié)異黃酮生物合成提高大豆遺傳轉(zhuǎn)化效率的方法，其特征在于驟④中所述固體共培養(yǎng)基的制備為向經(jīng)過121°C高壓滅菌15min后的含有大量元素、微量元素、6-BA1. Omg じ1、IBA 0. 2mg じ1、MES 3. 9g じ1、蔗糖 30g じ1、瓊脂 Sgr15PH 5.4的培養(yǎng)基中，再加入抽濾滅菌的硫代硫酸鈉158mgじ1，DTT 154mgじ1，半胱氨酸IglA IX^有機(jī)成分，AS 200μΜ及0. 01 0. 2ymolじ1激酶抑制劑1(25 苯丙氨酸解氨酶PAL活性抑制劑，混勻后按30ml/皿分裝到Φ90mm的滅菌培養(yǎng)皿中。所述ー種利用調(diào)節(jié)異黃酮生物合成提高大豆遺傳轉(zhuǎn)化效率的方法，其特征在于步驟④固體共培養(yǎng)基的制備中所述的苯丙氨酸解氨酶PAL活性抑制劑α -氨氧基乙酸AOA使用濃度為30 μ mo 1じ1。所述ー種利用調(diào)節(jié)異黃酮生物合成提高大豆遺傳轉(zhuǎn)化效率的方法，其特征在于步驟⑤農(nóng)桿菌侵染液的制備中所述的含有外源基因的重組農(nóng)桿菌是利用熱擊法將含有PPT 抗性基因的質(zhì)粒PCAMBIA3301導(dǎo)入到根癌農(nóng)桿菌EHA105所得到的重組農(nóng)桿菌。本發(fā)明在農(nóng)桿菌介導(dǎo)大豆子葉節(jié)外植體的侵染過程中，在外植體與農(nóng)桿菌的共培養(yǎng)期的固體培養(yǎng)基中添加苯丙氨酸解氨酶PAL活性的抑制劑，其目的是降低大豆異黃酮等次生代謝產(chǎn)物對農(nóng)桿菌侵染的抑制作用，提高了農(nóng)桿菌侵染頻率，侵染后的外植體經(jīng)不定芽誘導(dǎo)、伸長、生根，明顯增加了獲得大豆抗性植株的數(shù)量，如在外植體與農(nóng)桿菌的共培養(yǎng)期的固體培養(yǎng)基中添加30 μ molじ1苯丙氨酸解氨酶PAL活性的抑制劑α-氨氧基乙酸AOA 后，大豆抗性植株獲得率為10.四％，而空白對照組獲得抗性植株率僅為1.68% ；同樣在外植體與農(nóng)桿菌的固體共培養(yǎng)期的培養(yǎng)基中添加2. 39 μ molじ1苯丙氨酸解氨酶PAL活性的抑制劑放線菌素D后，大豆抗性植株獲得率為14.0%，而空白對照組獲得抗性植株率僅為 0. 78%，獲得大豆抗性植株的數(shù)量増加了 13. 22%，明顯的提高了大豆農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化效率。


圖1是在固體共培養(yǎng)基中添加不同濃度的苯丙氨酸解氨酶PAL活性抑制劑α -氨氧基乙酸AOA對大豆遺傳轉(zhuǎn)化效率影響效果中抗性植株獲得率=生根良好的移栽植株數(shù)/處理的外植體總數(shù)*100% ；CK表示在固體共性培養(yǎng)基中不添加苯丙氨酸解氨酶PAL活性抑制劑α-氨氧基乙酸AOA。圖2是在固體共培養(yǎng)集中添加2. 39 μ mo 1じ1苯丙氨酸解氨酶PAL活性抑制劑放線菌素D對大豆遺傳轉(zhuǎn)化效率影響效果中抗性植株獲得率=生根良好的移栽植株數(shù)/處理的外植體總數(shù)*100% ；CK表示在固體培養(yǎng)基中不添加苯丙氨酸解氨酶PAL活性抑制劑放線菌素D。圖3是在固體共培養(yǎng)基中添加不同濃度的苯丙氨酸解氨酶PAL活性抑制劑K252a 對大豆遺傳轉(zhuǎn)化效率影響效果中抗性植株獲得率=生根良好的移栽植株數(shù)/處理的外植體總數(shù)*100% ；
CK表示在固體培養(yǎng)基中不添加苯丙氨酸解氨酶PAL活性抑制劑K252a。下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)ー步闡述，但不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例中所使用的培養(yǎng)基配方如無特殊說明，均為常規(guī)培養(yǎng)基，所用試劑如無特殊說明均購自上海生エ生物工程技術(shù)有限公司，所用農(nóng)桿菌菌株EHA105購買自北京天思澤基因科技有限公司，質(zhì)粒PCAMBIA3301購買自澳大利亞CAMBIA公司。實(shí)施例1 在固體共培養(yǎng)基中添加20 μ molじ1苯丙氨酸解氨酶PAL活性抑制劑 α -氨氧基乙酸AOA對大豆遺傳轉(zhuǎn)化效率的影響1.種子消毒取健康飽滿的冀黃13大豆種子，放入含有IOOml 30%次氯酸鈉和 4ml濃鹽酸的密閉容器內(nèi)，利用反應(yīng)生成的氯氣消毒36小時(shí)；2.種子的萌發(fā)培養(yǎng)將步驟1中的種子接種到も培養(yǎng)基中進(jìn)行6天25で、16/他光暗周期的培養(yǎng)；3.外植體制備將步驟2中萌發(fā)好的種子，無菌條件下去掉種皮，切掉幼葉和上胚軸，保留0. 5cm長的下胚軸，用手木刀片對子葉節(jié)部位進(jìn)行創(chuàng)傷處理；4.農(nóng)桿菌侵染液的制備利用熱擊法將含有PPT抗性基因的質(zhì)粒PCAMBIA3301 導(dǎo)入到根癌農(nóng)桿菌EHA105得到的重組農(nóng)桿菌。將該重組農(nóng)桿菌接種在含有50mgじ1利福平、50mgじ1卡那霉素的YEP液體培養(yǎng)基中，28°C、200rpm振蕩培養(yǎng)至對數(shù)增長期，OD6tltl在 0. 8-1.0左右。將菌液移至50ml無菌離心管中，4°C、5000rpm離心lOmin，棄上清，收集管底菌體部分。將含有大量元素、微量元素、IX^有機(jī)成分6-BA1.0mgじ1、 IBA 0. 2mgじ1、MES 3. 9gじ1、蔗糖30gじ1，乙酰丁香酮AS 200 μ M, PH 5. 4的培養(yǎng)基導(dǎo)入離心管中，顛倒搖晃使菌體懸浮均勻，調(diào)節(jié)菌液濃度到0D_ ^ 0. 5，室溫靜置半小時(shí)備用；5.固體共培養(yǎng)基制備向經(jīng)過121°C高壓滅菌15min后的含有大量元素、 微量元素、6-BA1. Omg じ1、IBA 0. 2mg じ1、MES 3. 9g じ1、蔗糖 30g じ1、瓊脂 5g じ1，
PH 5. 4的培養(yǎng)基中，加入抽濾滅菌的硫代硫酸鈉158mgじ1，DTT 154mgじ1，半胱氨酸Igじ1， 1 χB5有機(jī)成分，AS 200 μ Μ,然后再分別加入20 μ molじ1的苯丙氨酸解氨酶PAL活性抑制劑 α -氨氧基乙酸Α0Α，以不加α -氨氧基乙酸AOA的處理為對照，混勻后按30ml/皿分裝到 Φ 90mm的滅菌培養(yǎng)皿中；6.農(nóng)桿菌侵染和共培養(yǎng)將步驟3中的外植體放入IOOml三角瓶中，加入按步驟 4制備好的農(nóng)桿菌侵染液，搖床上低速轉(zhuǎn)動(dòng)(80 100rpm)30分鐘。將外植體取出，用滅菌濾紙吸掉多余菌液，擺放到步驟5制備的固體共培養(yǎng)基上，暗處共培養(yǎng)3天；7.芽誘導(dǎo)及抗性植株獲得將步驟6中的外植體轉(zhuǎn)移到恢復(fù)培養(yǎng)基(MS大量元素+MS 微量元素 +鐵鹽+B5 有機(jī)+6-BA 1.5-3. Omg じ1+IBAO. 2mg じ+Cef 250mg じ1+Ticar 200mgじ1+蔗糖30gじ1+瓊脂5. 5β ΛΡΗ 5.8)上培養(yǎng)7天，然后轉(zhuǎn)移到含有5mg/L PPT的芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基(成分同恢復(fù)培養(yǎng)基)上篩選培養(yǎng)18天，然后將誘導(dǎo)出抗性芽的外植體轉(zhuǎn)移到芽伸長培養(yǎng)基(MS大量元素+MS微量元素+鐵鹽+ 有機(jī)+Cefotaxime 250mgじ1+Ticar 200mgじ1+PPT 3mgじ1+蔗糖30gじ1+瓊脂5. 5gじ1，PH 5.8)上進(jìn)行芽伸長。芽長4cm時(shí)轉(zhuǎn)移到添加有l(wèi)mg/L PPT的生根培養(yǎng)基(1/2MS大量元素+MS微量元素+鐵鹽+B5有機(jī)NAA0. 4mg じ1+Cef 250mg じ1+Ticar 200mg じ1+PPT Img じ1+蔗糖 20g じ1+瓊脂 5. Og じ1，PH 5.8)中，獲得可移栽的轉(zhuǎn)化再生植株。生根植株移栽到花盆中獲得轉(zhuǎn)化植株產(chǎn)生的種子。統(tǒng)計(jì)處理組和對照組的抗性植株獲得率(生根良好的移栽植株數(shù)/處理的外植體總數(shù)*100%)。結(jié)果見圖1:20μπιΟ1じ1 AOA處理的113個(gè)外植體，獲得8個(gè)生根良好可移栽的PPT抗性植株，抗性植株獲得率為7. 1 % ；對照組處理的119個(gè)外植體，獲得2個(gè)生根良好可移栽的PPT抗性植株株，抗性植株率為1. 68%。因此在步驟5固體共培養(yǎng)基中添加20 μ molじ1苯丙氨酸解氨酶PAL活性抑制劑α -氨氧基乙酸AOA比對照明顯提高了大豆抗性植株的獲得率。實(shí)施例2 在固體共培養(yǎng)基中添加30 μ molじ1苯丙氨酸解氨酶PAL活性抑制劑 α -氨氧基乙酸AOA對大豆遺傳轉(zhuǎn)化效率的影響在實(shí)施例1步驟5固體共培養(yǎng)基制備中添加30 μ molじ1苯丙氨酸解氨酶PAL活性抑制劑α -氨氧基乙酸AOA代替20 μ molじ苯丙氨酸解氨酶PAL活性抑制劑α -氨氧基乙酸Α0Α，以不加AOA為對照；其余步驟與實(shí)施例1相同。統(tǒng)計(jì)處理組和對照組的抗性植株獲得率(生根良好的移栽植株數(shù)/處理的外植體總數(shù)*100% )。結(jié)果見圖1 :30μπιΟ1じ1AOA處理的175個(gè)外植體，獲得18個(gè)生根良好可移栽的PPT抗性植株，抗性植株獲得率為10. 29% ；對照組處理的119個(gè)外植體，獲得2個(gè)生根良好可移栽的PPT抗性植株株，抗性植株率為1.68%。因此在實(shí)施例1步驟5固體共培養(yǎng)基中添加30 μ molじ1苯丙氨酸解氨酶PAL活性抑制劑α -氨氧基乙酸AOA比對照明顯提高了大豆抗性植株的獲得率。實(shí)施例3 在固體共培養(yǎng)基中添加50 μ molじ1苯丙氨酸解氨酶PAL活性抑制劑 α -氨氧基乙酸AOA對大豆遺傳轉(zhuǎn)化效率的影響在實(shí)施例1步驟5固體共培養(yǎng)基制備中添加50 μ molじ1苯丙氨酸解氨酶PAL活性抑制劑α -氨氧基乙酸AOA代替20 μ molじ1苯丙氨酸解氨酶PAL活性抑制劑α -氨氧基乙酸Α0Α，以不加AOA為對照；其余步驟與實(shí)施例1相同。統(tǒng)計(jì)處理組和對照組的抗性植株獲得率(生根良好的移栽植株數(shù)/處理的外植體總數(shù)*100%)。結(jié)果見圖1:50μπιΟ1じ1AOA處理的152個(gè)外植體，獲得3個(gè)生根良好可移栽的PPT抗性植株，抗性植株獲得率為1. 97% ；對照組處理的119個(gè)外植體，獲得2個(gè)生根良好可移栽的PPT抗性植株株，抗性植株率為1. 68%。因此在實(shí)施例1步驟5固體共培養(yǎng)基中添加50 μ mo 1じ1苯丙氨酸解氨酶PAL活性抑制劑α -氨氧基乙酸AOA比對照明顯提高了大豆抗性植株的獲得率。實(shí)施例4 在固體共培養(yǎng)集中添加2. 39 μ molじ1苯丙氨酸解氨酶PAL活性抑制劑放線菌素D對大豆遺傳轉(zhuǎn)化效率影響在實(shí)施例1步驟5固體共培養(yǎng)基制備中添加2. 39 μ mo 1じ1放線菌素D代替 20 μ molじ1苯丙氨酸解氨酶PAL活性抑制劑α -氨氧基乙酸Α0Α，以不加放線菌素D為對照；其余步驟與實(shí)施例1相同。統(tǒng)計(jì)處理組和對照組的抗性植株獲得率。結(jié)果見圖2 放線菌素D處理組處理的 100個(gè)外植體，獲得14株生根良好可移栽的植株，抗性植株獲得率為14.0%;對照組處理的 129個(gè)外植體，獲得1株生根良好可以移栽的抗性植株，獲得率為0. 78%。因此在實(shí)施例1 步驟5固體共培養(yǎng)基中添加2. 39 μ molじ1放線菌素D苯丙氨酸解氨酶PAL活性抑制劑比對照明顯提高了大豆抗性植株的獲得率。實(shí)施例5 在固體共培養(yǎng)基中添加0. 01 μ molじ1苯丙氨酸解氨酶PAL活性抑制劑 K252a對大豆遺傳轉(zhuǎn)化效率影響將實(shí)施例1中步驟5固體共培養(yǎng)基中添加0. 01 μ mol L_1K252a代替20 μ molじ1 苯丙氨酸解氨酶PAL活性抑制劑α -氨氧基乙酸Α0Α，以不加K252a的處理為對照；其余步驟與實(shí)施例1相同。統(tǒng)計(jì)處理組和對照組的抗性植株獲得率。結(jié)果見圖3 0. 01 μ moir1K252a處理外植體94個(gè)，獲得生根良好可移栽的PPT抗性植株株8個(gè)，抗性植株獲得率為8. 51 % ；對照組處理外植體1 個(gè)，獲得生根良好可移栽的PPT抗性植株2個(gè)，抗性植株獲得率為1. 59%。 因此在實(shí)施例1步驟5固體共培養(yǎng)基中添加0. 01 μ molじ11(25 苯丙氨酸解氨酶PAL活性抑制劑比對照明顯提高了大豆抗性植株的獲得率。實(shí)施例6 在固體共培養(yǎng)基中添加0. 05 μ molじ1苯丙氨酸解氨酶PAL活性抑制劑 K252a對大豆遺傳轉(zhuǎn)化效率影響將實(shí)施例1中步驟5固體共培養(yǎng)基中添加0. 05 μ molじ11(25 苯丙氨酸解氨酶 PAL活性抑制劑α -氨氧基乙酸AOA ；其余步驟與實(shí)施例1相同。統(tǒng)計(jì)處理組和對照組的抗性植株獲得率。結(jié)果見圖3 0. 05 μ moir1K252a處理外植體138個(gè)，獲得生根良好可移栽的PPT抗性植株12個(gè)，抗性植株獲得率為8. 7% ；對照組處理外植體1 個(gè)，獲得生根良好可移栽的PPT抗性植株2個(gè)，抗性植株獲得率為1. 59%。 因此在實(shí)施例1步驟5固體共培養(yǎng)基中添加0. 05 μ molじ11(25 苯丙氨酸解氨酶PAL活性抑制劑比對照明顯提高了大豆抗性植株的獲得率。實(shí)施例7:在固體共培養(yǎng)基中添加0.1 μ molじ1苯丙氨酸解氨酶PAL活性抑制劑 K252a對大豆遺傳轉(zhuǎn)化效率影響將實(shí)施例1中步驟5固體共培養(yǎng)基中添加0. 1 μ molじ11(25 苯丙氨酸解氨酶PAL 活性抑制劑α -氨氧基乙酸AOA ；其余步驟與實(shí)施例1相同。統(tǒng)計(jì)處理組和對照組的抗性植株獲得率。結(jié)果見圖3 :0. 1 μ molじ11(25 處理外植體112個(gè)，獲得生根良好可移栽的PPT抗性植株4個(gè)，抗性植株獲得率為3. 57% ；對照組處理外植體1 個(gè)，獲得生根良好可移栽的PPT抗性植株2個(gè)，抗性植株獲得率為1. 59%。 在實(shí)施例1步驟5固體共培養(yǎng)基中添加0. 1 μ molじ11(25 苯丙氨酸解氨酶PAL活性抑制劑比對照明顯提高了大豆抗性植株的獲得率。實(shí)施例8 在固體共培養(yǎng)基中添加0. 2 μ molじ1苯丙氨酸解氨酶PAL活性抑制劑 K252a對大豆遺傳轉(zhuǎn)化效率影響將實(shí)施例1中步驟5固體共培養(yǎng)基中添加0. 2 μ molじ11(25 苯丙氨酸解氨酶PAL 活性抑制劑α -氨氧基乙酸AOA ；其余步驟與實(shí)施例1相同。統(tǒng)計(jì)處理組和對照組的抗性植株獲得率。結(jié)果見圖3 :0. 2 μ molじ11(25 處理外植體110個(gè)，獲得生根良好可移栽的PPT抗性植株2個(gè)，抗性植株獲得率為1. 82% ；對照組處理外植體1 個(gè)，獲得生根良好可移栽的PPT抗性植株2個(gè)，抗性植株獲得率為1. 59%。 因此在實(shí)施例1步驟5固體共培養(yǎng)基中添加0. 2 μ molじ11(25 苯丙氨酸解氨酶PAL活性抑制劑比對照明顯提高了大豆抗性植株的獲得率。本發(fā)明列舉的實(shí)施例旨在更進(jìn)ー步地闡明苯丙氨酸解氨酶PAL活性的抑制劑對降低大豆異黃酮等次生代謝產(chǎn)物對農(nóng)桿菌侵染的抑制作用，提高大豆農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化效率具有的顯著效果，而不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。
權(quán)利要求
1.ー種利用調(diào)節(jié)異黃酮生物合成提高大豆遺傳轉(zhuǎn)化效率的方法，其特征在于包括如下步驟①種子的消毒取健康飽滿大豆種子，放入含有IOOml30%次氯酸鈉和細(xì)1濃鹽酸的密閉容器內(nèi)，利用反應(yīng)生成的氯氣消毒M 36小時(shí)；②種子的萌發(fā)培養(yǎng)將步驟①中的種子接種到民萌苗培養(yǎng)基中進(jìn)行為期5 6天的 25°C、16/ !光暗周期的培養(yǎng)；③外植體制備將步驟②中的種子在無菌條件下去掉種皮、切掉幼葉和上胚軸，保留 0. 5 2. Ocm的下胚軸，用手木刀片對子葉節(jié)部位進(jìn)行創(chuàng)傷處理；④固體共培養(yǎng)基的制備向經(jīng)過121°C高壓滅菌15min后的含有民大量元素、B5微量元素、6-BA、IBA、MES、蔗糖、瓊脂，PH 5. 4的培養(yǎng)基中，再加入抽濾滅菌的硫代硫酸鈉，DTT, 半胱氨酸，B5有機(jī)成分、乙酰丁香酮AS及苯丙氨酸解氨酶PAL活性抑制劑，混勻后按30ml/ 皿分裝到Φ90mm的滅菌培養(yǎng)皿中；⑤農(nóng)桿菌侵染液的制備將含有外源基因的重組農(nóng)桿菌懸于含有1/10X&大量元素、 微量元素、IX^ 有機(jī)成分 6-BA1. Omgじ1、IBA 0. 2mg じ1、MES 3. 9g じ1、蔗糖 30gじ1，乙酰丁香酮AS 200 μ M, PH 5. 4的培養(yǎng)基中，調(diào)節(jié)菌液濃度到OD6tltl ^ 0. 5，室溫靜置半小時(shí)備用；⑥農(nóng)桿菌侵染和共培養(yǎng)將步驟③中的外植體放入IOOml三角瓶中，加入步驟⑤制備的農(nóng)桿菌侵染液中，搖床上SOrpm低速轉(zhuǎn)動(dòng)30分鐘后，取出外植體，用滅菌濾紙吸掉多余菌液，擺放到步驟④中固體共培養(yǎng)培養(yǎng)基上，暗培養(yǎng)3 5天；⑦芽誘導(dǎo)和抗性植株的獲得將步驟⑥中的外植體轉(zhuǎn)移到恢復(fù)培養(yǎng)基上培養(yǎng)7天后， 轉(zhuǎn)移到帶有篩選壓的芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)14 21天，然后將誘導(dǎo)出抗性芽的外植體轉(zhuǎn)移到芽伸長培養(yǎng)基上進(jìn)行芽伸長，芽長4 5cm時(shí)轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基中，獲得轉(zhuǎn)化再生植株移栽到花盆中獲得轉(zhuǎn)化的抗性植株。
2.根據(jù)權(quán)利要求1ー種利用調(diào)節(jié)異黃酮生物合成提高大豆遺傳轉(zhuǎn)化效率的方法，其特征在于步驟④固體共培養(yǎng)基的制備中所述的苯丙氨酸解氨酶PAL活性抑制劑為α -氨氧基乙酸Α0Α、放線菌素D、激酶抑制劑1(25 其中的ー種。
3.根據(jù)權(quán)利要求2—種利用調(diào)節(jié)異黃酮生物合成提高大豆遺傳轉(zhuǎn)化效率的方法，其特征在于驟④中所述固體共培養(yǎng)基的制備為向經(jīng)過121°C高壓滅菌15min后的含有大量元素、微量元素、6-BA1. Omg じ1、IBA 0. 2mg じ1、MES 3. 9g じ1、蔗糖 30g じ1、 瓊脂5g ΙΛΡΗ 5.4的培養(yǎng)基中，再加入抽濾滅菌的硫代硫酸鈉158mgじ1，DTT 154mgじ1， 半胱氨酸Igじ1，IX^有機(jī)成分，AS 200μΜ及20 50μπιο1じ1 α -氨氧基乙酸AOA苯丙氨酸解氨酶PAL活性抑制劑，混勻后按30ml/皿分裝到Φ90mm的滅菌培養(yǎng)皿中。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述ー種利用調(diào)節(jié)異黃酮生物合成提高大豆遺傳轉(zhuǎn)化效率的方法，其特征在于驟④中所述固體共培養(yǎng)基的制備為向經(jīng)過121°C高壓滅菌15min后的含有大量元素、微量元素、6-BA1. Omg じ1、IBA 0. 2mg じ1、MES 3. 9g じ1、蔗糖30gじ1、瓊脂5gじ1，PH 5. 4的培養(yǎng)基中，再加入抽濾滅菌的硫代硫酸鈉158mgじ1，DTT 154mgじ1，半胱氨酸Igじ1，IX^有機(jī)成分，AS 200 μ M及2. 39 μ mo 1じ1放線菌素D苯丙氨酸解氨酶PAL活性抑制劑，混勻后按30ml/皿分裝到Φ90mm的滅菌培養(yǎng)皿中。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述ー種利用調(diào)節(jié)異黃酮生物合成提高大豆遺傳轉(zhuǎn)化效率的方法，其特征在于驟④中所述固體共培養(yǎng)基的制備為向經(jīng)過121°C高壓滅菌15min后的含有大量元素、微量元素、6-BA1. Omg じ1、IBA 0. 2mg じ1、MES 3. 9g じ1、蔗糖30gじ1、瓊脂5gじ1，PH 5. 4的培養(yǎng)基中，再加入抽濾滅菌的硫代硫酸鈉158mgじ1，DTT 154mgじ1，半胱氨酸Igじ1，IX^有機(jī)成分，AS 200 μ M及0. 01 0. 2 μ mo 1じ1激酶抑制劑1(25 苯丙氨酸解氨酶PAL活性抑制劑，混勻后按30ml/皿分裝到Φ 90mm的滅菌培養(yǎng)皿中。
6.根據(jù)權(quán)利要求3—種利用調(diào)節(jié)異黃酮生物合成提高大豆遺傳轉(zhuǎn)化效率的方法，其特征在于步驟④固體共培養(yǎng)基的制備中所述的苯丙氨酸解氨酶PAL活性抑制劑α -氨氧基乙酸AOA使用濃度為30 μ mo 1じ1。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述ー種利用調(diào)節(jié)異黃酮生物合成提高大豆遺傳轉(zhuǎn)化效率的方法， 其特征在于步驟⑤農(nóng)桿菌侵染液的制備中所述的含有外源基因的重組農(nóng)桿菌是利用熱擊法將含有PPT抗性基因的質(zhì)粒PCAMBIA3301導(dǎo)入到根癌農(nóng)桿菌EHA105所得到的重組農(nóng)桿菌。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種利用調(diào)節(jié)異黃酮生物合成提高大豆遺傳轉(zhuǎn)化效率的方法，其特征在于包括以下步驟①種子的消毒、②種子的萌發(fā)培養(yǎng)、③外植體制備、④固體共培養(yǎng)基的制備、⑤農(nóng)桿菌侵染液的制備、⑥農(nóng)桿菌侵染和共培養(yǎng)、⑦芽誘導(dǎo)和抗性植株的獲得。本發(fā)明在農(nóng)桿菌介導(dǎo)大豆子葉節(jié)外植體的侵染過程中，在外植體與農(nóng)桿菌的共培養(yǎng)期的固體培養(yǎng)基中添加苯丙氨酸解氨酶PAL活性的抑制劑，抑制大豆異黃酮合成的關(guān)鍵酶PAL，減少大豆異黃酮類次生代謝產(chǎn)物的合成和積累，從而降低大豆外植體的“免疫力”，提高農(nóng)桿菌的被侵染力，通過改善這種植物/農(nóng)桿菌互作關(guān)系大大提高了大豆抗性植株的數(shù)量和遺傳轉(zhuǎn)化效率。
文檔編號(hào)C12N15/84GK102559747SQ20121000698
公開日2012年7月11日 申請日期2012年1月11日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月11日
發(fā)明者劉子會(huì), 張孟臣, 張紅梅, 張艷敏, 蔣春志, 郭秀林 申請人:河北省農(nóng)林科學(xué)院糧油作物研究所, 河北省農(nóng)林科學(xué)院遺傳生理研究所