專利名稱：耐鹽堿絨毛白蠟scar標(biāo)記及其在輔助選擇育種中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種SCAR標(biāo)記及其應(yīng)用，尤其涉及一種耐鹽堿絨毛白蠟SCAR標(biāo)記及其在輔助選擇育種中的應(yīng)用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
白蠟屬全世界約70余種，大多數(shù)分布在北半球暖溫帶，中國已有34種，其中原產(chǎn) 26種，國外引進(jìn)8種。續(xù)毛白臘(Fraxinus VelutinaTorr.)為木庫科(Oleaceae)白臘屬 (Fraxinus Linn.)落葉喬木,原產(chǎn)為美國，生長快,樹干通直,木質(zhì)結(jié)構(gòu)均勻，紋理美觀,易繁殖、抗逆，是優(yōu)良鹽堿地造林、園林綠化和珍貴的用材樹種。早在1911年引種到濟(jì)南(孟昭和等，2001)，1953年被轉(zhuǎn)引到天津(楊瑞興等，1996)，80年代后在華北華東地區(qū)廣泛栽培。目前已成為我國華北、華東主要沿海城市及鹽堿地區(qū)造林和園林綠化優(yōu)良樹種(時明芝，1996 ;王勤等，2000 ;倪國祥等，1995 ;王友平等，2007)。國內(nèi)關(guān)于白蠟生態(tài)特性、生長習(xí)性方面的研究較多，主要側(cè)重于白蠟的耐鹽堿性、 苗木繁育、造林技術(shù)等方面。樊寶敏(1992)報道，絨毛白蠟對呈堿性反應(yīng)的濱海鹽土較為敏感；孟康敏(1999)對5個濱海鹽堿地引種的樹種幼苗進(jìn)行盆栽耐鹽性試驗，根據(jù)光合速率、葉綠素含量、細(xì)胞膜透性、丙二醛含量、游離脯氨酸含量等5個耐鹽性生理指標(biāo)進(jìn)行綜合評判，結(jié)果表明絨毛白蠟?zāi)望}力最強(qiáng)；劉德璽等(2008)以鹽潰生境下1-3年生紅涔為材料，對不同樹齡紅涔的各營養(yǎng)器官中鹽離子分布規(guī)律進(jìn)行了研究；王友平等(2009)研究了鹽潰生境下1-3年生絨毛白蠟不同營養(yǎng)器官中鹽離子分布規(guī)律。近年來國外報導(dǎo)多集中在歐洲白臘(F. excelsior)的核DNA微衛(wèi)星、葉綠體微衛(wèi)星標(biāo)記、EST-SST標(biāo)記篩選分離，以及微衛(wèi)星標(biāo)記在種群遺傳分析與系統(tǒng)發(fā)生生物地理學(xué)研究上。Heurtz等(2004)通過對全歐洲野生F. excelsior群體的葉綠體DNA與葉綠體微衛(wèi)星分析認(rèn)為,較低的單倍體多態(tài)是由于風(fēng)媒植物的基因流影響。Bacles等(2008)利用微衛(wèi)星標(biāo)記進(jìn)行了大尺度景觀下蘇格蘭 F. excelsior群體的花粉基因流的父本分析，花粉基因流的交換取決于群體大小，而不是地理位置。Goto等(2006)利用5個微衛(wèi)星位點對日本北部濱海森林的F. mandshurica var. japonica的親本與后代的基因型分析，結(jié)果表明小范圍內(nèi)親本的個體分析可以為風(fēng)媒植物提供定量的分析。對絨毛白臘(F. Velutina)的相關(guān)DNA標(biāo)記序列未能在GenBank上檢索到，遺傳學(xué)基礎(chǔ)研究十分薄弱，遺傳背景信息匱乏，這在很大程度上限制了選擇育種工作的順利開展。因此開展相應(yīng)的遺傳學(xué)基礎(chǔ)研究、定位重要經(jīng)濟(jì)性狀是我國白蠟選育工作中首先需要解決的問題。此外，傳統(tǒng)的白蠟分類主要依靠果實形狀和果翅數(shù)目的不同，該分類方法無法有效的在幼樹早期進(jìn)行應(yīng)用。因此利用分子生物學(xué)辦法、建立有效、快捷的種質(zhì)鑒別方法對解決我國白蠟樹良種選育具有重要的意義。分子標(biāo)記輔助選擇育種是一種新型的育種方式，應(yīng)用分子標(biāo)記輔助選擇育種，可有效的檢測基因型，進(jìn)行QTL定位，直接通過標(biāo)記基因輔助選擇含有目標(biāo)基因型的個體。與傳統(tǒng)的育種方法相比，分子標(biāo)記輔助選擇育種方法，直接以DNA形式出現(xiàn)，在植物體的各個組織、各發(fā)育時期均可檢測到，不受季節(jié)、環(huán)境的限制，不存在表達(dá)與否的問題；數(shù)量多，遍及整個基因組；多態(tài)性高，利用大量引物、探針可完成覆蓋基因組的分析；中性標(biāo)記，即不影響目標(biāo)性狀的表達(dá)，與不良性狀無必然的連鎖共顯性標(biāo)記，能夠鑒別出純合的基因型與雜合的基因型，提供完整的遺傳信息。RFLP標(biāo)記、AFLP標(biāo)記操作較為繁瑣，而RAPD標(biāo)記準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性較差，均不適合于大規(guī)模的田間材料的鑒定工作；SCAR標(biāo)記操作簡便、準(zhǔn)確性高、穩(wěn)定性高克服了上述標(biāo)記的缺點，為首選的分子標(biāo)記方法。由于林木育種周期長，要改變在絨毛白蠟育種領(lǐng)域上的落后局面，關(guān)鍵在于盡快廣泛收集品種資源，走現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)與常規(guī)育種相結(jié)合的道路，縮短育種年限，加快分子標(biāo)記輔助選擇利用的研究。因此，獲得耐鹽堿絨毛白蠟SCAR標(biāo)記，對于絨毛白蠟良種選育具有重要的意義，為我國耐鹽堿林木種質(zhì)的選育研究提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)體系；豐富耐鹽堿綠化樹種的遺傳多樣性，扼制土地鹽潰化，提高土地生產(chǎn)力；增加生態(tài)、社會和經(jīng)濟(jì)效益都具有現(xiàn)實而深遠(yuǎn)的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種耐鹽堿絨毛白蠟SCAR標(biāo)記及其在用于輔助選擇育種中的應(yīng)用。本發(fā)明所述的耐鹽堿絨毛白蠟SCAR標(biāo)記，其特征在于，該SCAR標(biāo)記是全長592bp 的特異片段S20-592，其核酸序列如SEQ ID NO. I所示。為實現(xiàn)上述任務(wù)，本發(fā)明采取如下步驟的技術(shù)方案(I)、以2株高耐鹽型絨毛白蠟分別為R36、R39和5株普通絨毛白蠟為材料；(2)、采用CTAB法提取絨毛白蠟葉片總DNA ；
(3)、建立并優(yōu)化絨毛白蠟RAPD反應(yīng)體系，獲得穩(wěn)定高效的RAPD擴(kuò)增結(jié)果；(4)、應(yīng)用RAPD 分析篩選出一個與耐鹽堿相關(guān)聯(lián)的分子標(biāo)記S20-592 ； (5)、將耐鹽堿基因的RAPD分子標(biāo)記 S20-592克隆、測序并轉(zhuǎn)化為SCAR標(biāo)記。其中步驟(I)所述的高耐鹽型絨毛白蠟R36、R39是山東省林業(yè)科學(xué)研究院劉德璽通過 20年的選育獲得。步驟⑵所述的采用CTAB法提取絨毛白蠟葉片總DNA的具體方法是1)取0. I
0.2g絨毛白蠟葉片，于液氮中研磨。加入800 ill DNA提取緩沖液含有2% (w/v)CTAB, 20mmol/LEDTA(pH = 8. 0) UOOmmoI/L Tris-HCl (pH = 8. 0),1. 4mol/LNaCl 和 2% @ -巰基乙酉享，輕輕顛倒混勻；2)于65°C水浴中溫育30min,每IOmin顛倒輕輕混勻，12000rpm,離心 IOmin ;3)取上清700 ii L,加入等體積氯仿/異戍醇(24 I, v v),輕輕顛倒混勻,4°C, 12000rpm,離心IOmin ;4)取上清600ii I,加入等體積氯仿/異戍醇(24 : I, v : v),輕輕顛倒混勻，4°C，12000rpm,離心IOmin ；5)取上清500 U 1，加入2倍體積的冰冷的無水乙醇， 顛倒混勻，-20°C靜置30min ;6) 4°C，12000rpm，離心IOmin ；7)去上清，用預(yù)冷的75%乙醇洗漆沉淀2次，4°C, IOOOOrpm,離心5min ；8)在超凈工作臺干燥沉淀30min,加30 y I的滅菌蒸水(ddH20)溶解沉淀，待濃度和純度檢測后，置_20°C或_70°C冰箱保存?zhèn)溆?。步驟(3)所述的RAPD擴(kuò)增的具體方法是PCR反應(yīng)總體積25 yl，IOX反應(yīng)緩沖液 2. l，25mM/L MgCl2 I. 8u 1,10mM/L dNTPs I. 5 y 1，30ng/y I 引物 P 2 yl，模板 DNA 2u l，2u/ul TaqDNA 聚合酶 0. 25 ii 1，ddH20 14. 95 u I ;PCR 反應(yīng)條件95 °C 預(yù)變性 5min， 94°C變性 30s, 36°C退火 lmin,72°C延伸 2min,循環(huán) 44 次,72°C延伸 IOmin0 電泳 Marker 和試劑為TAKARA公司生產(chǎn)，擴(kuò)增后用I. 0%的瓊脂糖凝膠電泳，GeneGenius全自動凝膠成像分析系統(tǒng)觀察結(jié)果并照相。
步驟(4)所述的具體方法是隨機(jī)抽取5株普通絨毛白蠟和2株高耐鹽堿植株 R36、R39，分別建立5株普通絨毛白蠟混合基因池和R36、R39高耐鹽堿植株3個基因池，利用上海生物工程公司合成的S系列引物150個，對高耐鹽堿和普通絨毛白蠟混合基因池進(jìn)行了 RAPD分析，發(fā)現(xiàn)只有S20引物的擴(kuò)增產(chǎn)物在高耐鹽植株和普通植株中表現(xiàn)多態(tài)性。圖 I是引物S20的RAPD擴(kuò)增結(jié)果，在耐鹽堿植株中能觀察到一條分子量約為600bp的特異條帶的分子標(biāo)記S20-592，重復(fù)試驗3次，此帶仍能穩(wěn)定出現(xiàn)。步驟(5)所述分子標(biāo)記S20-592克隆、測序并轉(zhuǎn)化為SCAR標(biāo)記的具體方法是將 PCR擴(kuò)增出的特異片斷S20-592DNA經(jīng)I. 0%瓊脂糖凝膠電泳后，用博大泰克生產(chǎn)的玻璃奶試劑盒回收，操作按照試劑盒說明書進(jìn)行?；厥蘸蟮腄NA片斷與PMD-18T Vector連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a，重組質(zhì)粒經(jīng)T7、Sp6PCR電泳檢測，獲得陽性克隆子，送上海生物工程公司測序，其核酸序列全長592bp，具體為ggacccttaccaaatgacaatcaatttctatgtgcttggtttgttcgtggaaaactggat60
tacttgctatgcctatagcaaatgactattacagaacaacaaagcaggtctggtgtgatc120
aatttgcaagttattcaatatagtttttggccatgtaaactcacggacggctgcagccat180
tgatctgtattcagcttcagctgaagatcttgatacagtgtgttgcttcttggacttcca240
tgacacaagggaattgcccaaaaagatacaatatcctgtaatcgactgtcttgtatccga300
acatgctgcccgatcagcatCBCBBCBBCCtttgagcagaagatcagatttgctagaaat360
gaataaccctgtcttgatgagttctacagataccttaggcgtgataagctgcctccagat420
gagactgtcttggggactgaaggaattgactcagaacttgtacaggattaaataaatctg480
gcctggtaatagttaggtacaaaatcctcccaacaagccttttgtaggcattaagatcat540
ctacaggctcttcttcatcctttctcaactttaggttgcacggtaagggtCC592
將測序結(jié)果用生物信息學(xué)SMS進(jìn)行分析，并通過Internet與GenBank國際基因數(shù)
據(jù)庫進(jìn)行同源性分析，沒有查詢到相關(guān)的基因序列與該片斷同源，說明該片斷是與耐鹽堿續(xù)毛白臘相關(guān)聯(lián)的新的分子標(biāo)記。根據(jù)克隆片斷的DNA序列，合成了 SCAR標(biāo)記特異引物(上海生物工程公司合成)， 其序列為正向引物FS20-592:5，TGCTTGGTTTGTTCGTGG 3，反向引物RS20-592:5’ CGTGCAACCTAAAGTTGAG 3’用上述引物在高耐鹽堿R36、R39和普通絨毛白蠟的5個單株中分別進(jìn)行擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系總體積為25iU，2XTaq PCR MasterMix 12. 5 (天根生化科技有限公司),FS20-592 (10 u mol/L) lul, Rs20-592 (10 u mol/L) I u I,模板 DNA (20ng) 2 y I， ddH208. 5 ill ;擴(kuò)增反應(yīng)條件為94 °C預(yù)變性4min，94 V變性30s，55 °C退火45s， 72°C I. 5min，循環(huán) 30 次，72°C延伸 lOmin。電泳 Marker 為 TAKARA 公司生產(chǎn)的 DL2000，擴(kuò)增后用1%的瓊脂糖凝膠電泳，EB染色后在紫外燈下觀察拍照。擴(kuò)增結(jié)果表明，在高耐鹽堿絨毛白蠟中擴(kuò)增出592bp特異條帶，而在普通絨毛白蠟單株中未擴(kuò)增出特異條帶，如圖2所
/Jn o為了驗證SCAR標(biāo)記的可靠性，對R36高耐鹽植株Fl代分離群體抗鹽性進(jìn)行了分析。結(jié)果表明在抗鹽植株個體中檢測到了 SCAR標(biāo)記，而在感性植株中未檢測到SCAR標(biāo)記。本發(fā)明所述耐鹽堿絨毛白蠟的SCAR標(biāo)記在用于輔助選擇育種中的應(yīng)用。
本發(fā)明采用RAPD技術(shù)，尋找與耐鹽堿性狀相關(guān)聯(lián)的RAPD分子標(biāo)記，進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定性、重復(fù)性強(qiáng)的SCAR標(biāo)記，為開展耐鹽堿絨毛白蠟分子標(biāo)記輔助育種奠定了基礎(chǔ)，為縮短育種周期提供了技術(shù)保障。本發(fā)明獲得了續(xù)毛白臘耐鹽喊相關(guān)基因的一個穩(wěn)定SCAR標(biāo)記，提不該續(xù)毛白臘耐鹽堿SCAR標(biāo)記在輔助選育絨毛白臘耐鹽堿新品系中具有廣泛應(yīng)用。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明是利用分子標(biāo)記方法得到一個新的與絨毛白蠟抗鹽堿基因相關(guān)聯(lián)的RAPD分子標(biāo)記，并通過克隆、測序、引物設(shè)計，又將RAPD標(biāo)記轉(zhuǎn)換成穩(wěn)定的 SCAR標(biāo)記，為絨毛白蠟分子標(biāo)記輔助選擇育種體系奠定了基礎(chǔ)，與目前技術(shù)相比，其優(yōu)點是1)本標(biāo)記為穩(wěn)定的SCAR標(biāo)記，可廣泛用于耐鹽堿絨毛白蠟分子標(biāo)記的輔助選擇育種， 同時為克隆絨毛白蠟?zāi)望}堿基因、基因序列分析奠定了良好的基礎(chǔ)，為進(jìn)一步了解絨毛白蠟抗鹽堿的分子遺傳學(xué)機(jī)理有積極意義。2)分子標(biāo)記輔助選擇操作簡便，節(jié)約成本；絨毛白蠟為多年生木本植株，常規(guī)選育方法，周期長，成本高，費時費力。通過本發(fā)明只需進(jìn)行簡單的PCR擴(kuò)增，即可有效的鑒定材料的耐鹽性，避免了常規(guī)選育方法所需時間周期長及繁瑣的篩選過程等缺點。3)本發(fā)明通過SCAR標(biāo)記可對個體進(jìn)行苗期鑒定，大大提高了育種效率，縮短了育種進(jìn)程。


圖I :高耐鹽堿絨毛白蠟R36、R39和5株普通絨毛白蠟混合基因池DNA的RAPD分子標(biāo)記S20-592篩選電泳譜帶圖。M-DL2000Mark ；0 :1_5株普通絨毛白蠟混合基因池DNA 的RAPD結(jié)果；R36、R39-分別為高耐鹽堿絨毛白蠟的RAPD結(jié)果。圖2 :SCAR標(biāo)記在高耐鹽堿絨毛白蠟和普通絨毛白蠟單株中的PCR電泳譜帶圖。 M-DL2000Mark ;R36、R39-分別為高耐鹽堿絨毛白蠟；1_5 :普通絨毛白蠟單株。圖3 :本發(fā)明應(yīng)用SCAR標(biāo)記對已經(jīng)鑒定的抗感植株基因組DNA的電泳圖譜。M DL2000Mark ;1_10 :R36的Fl代抗性植株10株；11-20 :R36的Fl代感性植株10株。
具體實施例方式實施例I :與耐鹽堿基因相關(guān)聯(lián)的RAPD多態(tài)性標(biāo)記的獲得一、材料高耐鹽堿絨毛白蠟R36、R39和普通絨毛白蠟由山東省林業(yè)科學(xué)研究院東營分院劉德璽提供。二、小量法DNA提取I)取0.2g絨毛白蠟葉片，于液氮中研磨。加入800iil DNA提取緩沖液含有2% (w/v)CTAB,20mmoI/LEDTA(pH = 8. 0)UOOmmoI/L Tris-HCl (pH = 8. 0),1. 4mol/LNaCl 和 2% ￠-巰基乙醇，輕輕顛倒混勻；2)于65°C水浴中溫育30min,每IOmin顛倒輕輕混勻，12000rpm,離心IOmin ；3)取上清700 ii I,加入等體積氯仿/異戍醇(24 I, V V),輕輕顛倒混勻，4°C, 12000rpm,離心 IOmin ；4)取上清600 ill，加入等體積氯仿/異戊醇(24 : I，V : V)，輕輕顛倒混勻，4°C， 12000rpm,離心 IOmin ；
6
5)取上清500 Ul，加入2倍體積的冰冷的無水乙醇，顛倒混勻，_20°C靜置30min ； 6) 4°C，12000rpm,離心 IOmin ；7)去上清，用預(yù)冷的75%乙醇洗滌沉淀2次，4°C，IOOOOrpm,離心5min ；8)在超凈工作臺干燥沉淀30min，加30 的滅菌ddH20溶解沉淀，待濃度和純度檢測后，置_20°C或_70°C冰箱保存?zhèn)溆?。三、RAPD擴(kuò)增多態(tài)性標(biāo)記分析RAPD引物為S系列S1-S150，共150個，購自上海生物工程公司。優(yōu)化的RAPD擴(kuò)增體系為(I) PCR反應(yīng)體系為IOX 反應(yīng)緩沖液 2. l，25mM/L MgCl2 I. 8u 1,10mM/L dNTPs I. 5u l,30ng/u I 引物 P 1，模板 DNA(20ng)2ii l，2u/ul Taq DNA 聚合酶 0. 25 y 1，ddH20 14. 95 y I 總體積 25u I ；(2) PCR反應(yīng)程序為95°C預(yù)變性 5min，94°C變性 30s，36。。退火 lmin，72°C延伸 2min，循環(huán) 44 次，72°C 延伸IOmin0取8li L擴(kuò)增產(chǎn)物用I. 0%的瓊脂糖凝膠電泳,GeneGenius全自動凝膠成像分析系統(tǒng)觀察結(jié)果并照相，電泳Marker和試劑為TAKARA公司生產(chǎn)。用150個隨機(jī)引物，分別對高耐鹽堿和普通低絨毛白蠟基因池進(jìn)行RAH)擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)只有S20引物的擴(kuò)增產(chǎn)物在高耐鹽堿基因池和普通低耐鹽堿基因池中表現(xiàn)多態(tài)性，經(jīng)3 次重復(fù)擴(kuò)增，在兩基因池間表現(xiàn)穩(wěn)定、一致的差異，S20在高耐鹽堿基因池擴(kuò)增出特異條帶 S20-592，而在普通基因池缺失這條帶，獲得了與耐鹽堿性狀相關(guān)聯(lián)的的特異片斷S20-592， 分子量大小為592bp。實施例2 :與耐鹽堿基因相關(guān)聯(lián)的SCAR標(biāo)記的獲得及鑒定一、特異片斷S20-592的回收將PCR擴(kuò)增出的特異片斷S20-592DNA經(jīng)I. 0%瓊脂糖凝膠電泳后，用博大泰克生產(chǎn)的玻璃奶試劑盒回收，操作按照試劑盒說明書進(jìn)行。二、連接反應(yīng)連接反應(yīng)體積為IOii 1，其中含回收的DNA 5 ii I (30 50ng)，PMD-18T Vector Iu I, T4連接酶I i! I，連接緩沖液I U 1，滅菌CldH2Ol u I。反應(yīng)混合物充分混勻后，在16°C 連接12小時。三、轉(zhuǎn)化I、從_70°C冰箱中取200 U I大腸桿菌DH5 a (本實驗室制備保存)感受態(tài)細(xì)胞室溫下使其解凍，解凍后立即至于冰上。2、加入10 U I連接混合物，搖勻后冰上放置30min。3、42°C熱擊混合物90s，熱擊后快速轉(zhuǎn)移到冰上冷卻2 3min。4、向離心管中加入800 ill液體LB培養(yǎng)基，37°C 180rpm振蕩Ih后，濃縮菌液，去掉上清800 iil，取200 ill轉(zhuǎn)化混合物涂布于固體LB培養(yǎng)基的平板上。將涂布好的平板在室溫下正面向上放置30min后，倒置平板，放入37°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16-24h。待顯現(xiàn)白色菌落后，挑取白色菌落，置于IOml的LB液體培養(yǎng)基中，37 °C 180rpm培養(yǎng)過夜至對數(shù)中期，用PCR方法鑒定，將陽性克隆的菌液送至上海生物工程公司測序。四、SCAR標(biāo)記的獲得及檢測I、得到了長度592bp的特異片斷SCAR標(biāo)記，其核酸序列為ggacccttaccaaatgacaatcaatttctatgtgcttggtttgttcgtggaaaactggat60
tacttgctatgcctatagcaaatgactattacagaacaacaaagcaggtctggtgtgatc120
aatttgcaagttattcaatatagtttttggccatgtaaactcacggacggctgcagccat180
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tgacacaagggaattgcccaaaaagatacaatatcctgtaatcgactgtcttgtatccga300
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gaataaccctgtcttgatgagttctacagataccttaggcgtgataagctgcctccagat420
gagactgtcttggggactgaaggaattgactcagaacttgtacaggattaaataaatctg480
gcctggtaatagttaggtacaaaatcctcccaacaagccttttgtaggcattaagatcat540
ctacaggctc ttcttcatcc tttctcaact 2、SCAR標(biāo)記獲得的PCR引物序列ttaggttgcacggtaagggtCC592根據(jù)SCAR標(biāo)記序列,通過Primer軟件設(shè)計了特異引物序列為正向引物FS20-592:5’ TGCTTGGTTTGTTCGTGG 3’反向引物RS20-592 :5’ CGTGCAACCTAAAGTTGAG 3’，由上海生物工程公司合成。3、SCAR標(biāo)記檢測用SCAR-PCR引物在高耐鹽堿R36、R39和普通絨毛白蠟的5個單株中分別進(jìn)行擴(kuò) +
>曰oPCR 反應(yīng)體系為總體積為 25 ill，2 X Taq PCR MasterMix 12. 5 (天根生化科技有限公司)，F(xiàn)S20-592 (IOii mol/L) Iii 1，RS20-592 (10 u mol/L) I U 1，模板 DNA (20ng) 2u I, ddH208. 5 y I。PCR 反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性 4min，94°C變性 30s，55。。退火 45s，72。。I. 5min,循環(huán) 30 次，72°C延伸 IOmin0電泳結(jié)果擴(kuò)增產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳，EB染色后在紫外燈下觀察拍照。擴(kuò)增結(jié)果表明，在高耐鹽堿絨毛白蠟中擴(kuò)增出592bp特異條帶，而在普通絨毛白蠟單株中未擴(kuò)增出特異條帶(圖2)。PCR擴(kuò)增試劑和Marker購自TAKARA公司。實施例3 :耐鹽堿絨毛白蠟的SCAR標(biāo)記在用于輔助選擇育種中的應(yīng)用取已鑒定的穩(wěn)定的抗鹽植株R36的Fl代抗性植株10株及感性植株10株，分別用 CTAB法提取各個植株的DNA，然后以提取的DNA為模板進(jìn)行SCAR分析。具體的，分別以上述基因組DNA為模板，利用SCAR標(biāo)記的兩條引物(引物I : 5’TGCTTGGITTGITCGTGG 3’；引物 2 :5’ CGTGCAACCTAAAGTTGAG 3，)進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，反應(yīng)總體積為25微升，2XTaq PCR MasterMix 12. 5 iU (天根生化科技有限公司)，引物I (10 ii mol/ L) I u 1，引物 2(10 ii mol/L) Iii l，20ng 基因組 DNA2ii 1，ddH20 8. 5 u I0在55°C的退火溫度下，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)參數(shù)為94°C預(yù)變性4min，94°C變性 30s, 55°C退火45s, 72°C I. 5min,循環(huán)30次，72°C延伸IOmin0 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在I. 0%瓊脂糖凝膠電泳上分離，GeneGenius全自動凝膠成像分析系統(tǒng)觀察結(jié)果并照相。
電泳Marker DL2000 和試劑為 TAKARA 公司。分析結(jié)果如圖3。從圖3中可見，對抗性植株1-10分別以SCAR特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果分別擴(kuò)增出了特異性譜帶。而在感性植株11-20的擴(kuò)增產(chǎn)物中都沒有擴(kuò)增出任何產(chǎn)物。這再一次證實了 SCAR標(biāo)記檢測的可靠性及其應(yīng)用苗期與抗鹽性狀相關(guān)聯(lián)的分子標(biāo)記作為抗鹽育種輔助選擇的可行性。
權(quán)利要求
1.一種耐鹽堿絨毛白蠟SCAR標(biāo)記，其特征在于，所述SCAR標(biāo)記是全長592bp的特異片段S20-592，其核酸序列如SEQ ID NO. I所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的耐鹽堿絨毛白蠟SCAR標(biāo)記，其特征在于所述SCAR標(biāo)記引物是正向引物FS20-592 :5，TGCTTGGTTTGTTCGTGG 3’反向引物RS20-592 :5’ CGTGCAACCTAAAGTTGAG 3’。
3.權(quán)利要求I所述耐鹽堿絨毛白蠟的SCAR標(biāo)記在用于輔助選擇育種中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種絨毛白蠟?zāi)望}堿SCAR標(biāo)記，該SCAR標(biāo)記是全長592bp的特異片段S20-592，其核酸序列如SEQ ID NO.1所示。本發(fā)明的SCAR標(biāo)記可廣泛用于耐鹽堿絨毛白蠟分子標(biāo)記的輔助選擇育種，同時為克隆絨毛白蠟?zāi)望}堿基因、基因序列分析奠定了良好的基礎(chǔ)。本發(fā)明可實現(xiàn)對個體進(jìn)行苗期鑒定，大大提高了育種效率，縮短了育種進(jìn)程。
文檔編號C12N15/11GK102533745SQ20121000644
公開日2012年7月4日 申請日期2012年1月10日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月10日
發(fā)明者劉翠蘭, 夏陽, 李麗, 李雙云, 燕麗萍 申請人:山東省林業(yè)科學(xué)研究院