檢測黃連分子標記多態(tài)性的物質在鑒定或輔助鑒定黃連屬植物中的應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術領域中檢測黃連分子標記多態(tài)性的物質在鑒定或輔助鑒定 黃連屬植物中的應用。
【背景技術】
[0002] 黃連是我國傳統(tǒng)醫(yī)學廣泛使用的一種中藥材，全世界黃連屬（Coptis)植物有16 種，其中我國有6種類，分別為黃連、三角葉黃連、云南黃連、峨嵋黃連、五裂黃連和五葉黃 連。作為多基源的中藥材，藥典上規(guī)定來源黃連、三角葉黃連和云南黃連的干燥根莖為正 品，上述3種黃連的商品名分別為"味連"、"雅連"和"云連"。由于生長周期較長，價格較高， 市場上常見以單葉升麻的根莖和酸模的根偽充黃連使用；此外，黃連偽品還有定木香、滇豆 根、山黃連、巖黃連、箭葉淫羊藿、鐵破鑼、馬尾黃連和峨嵋黃連等等。黃連真品與偽品的化 學成分、功效、主治等有很大差異，因此開發(fā)一種系統(tǒng)全面的黃連真品和偽品的鑒定方法具 有重要意義。
[0003]目前，黃連真?zhèn)纹返蔫b定大多利用形態(tài)和化學手段進行，具有通量低、成本高和重 復性差的缺點。主要方法有組織學鑒定方法、紅外鑒定方法、核磁共振氫譜法和高效液相色 譜法等。組織學鑒定方法需要做大量的切片和顯微觀察，通量低、耗費大量的人力和物力， 同時具有不準確性；紅外鑒定方法、核磁共振氫譜法和高效液相色譜法都需要提取樣品的 藥效成分，同樣具有通量低和耗費大的缺點；此外，由于黃連有效成分受環(huán)境因素的影響， 不同產(chǎn)地黃連的有效成分含量和比例可能存在極大的差異，因此這種以測定有效成分為基 礎的鑒定方法同樣具有不可靠性和不準確性。針對于飲片或粉碎后的黃連藥材，上述鑒定 方法非常困難，甚至無法鑒定。
[0004] DNA分子標記（DNA molecular markers)是以個體間遺傳物質內核苷酸序列變異 為基礎的遺傳標記，是DNA水平遺傳多態(tài)性的直接反映。
[0005]目前還沒有一個系統(tǒng)詳盡的鑒定黃連屬植物的分子標記方法。利用真核生物rDNA 的內部轉錄間隔區(qū)2(internal transcribed spacer 2, ITS2)序列，孫濤等研究了不同黃 連屬植物間的進化關系，同時利用黃連屬植物間ITS2序列位點的差異作為一個鑒定黃連 真品和偽品的分子標記（孫濤等，2013)。但由于ITS2序列在同一個黃連屬植物間的保守 性，導致該序列不能有來區(qū)分不同的黃連亞種。

【發(fā)明內容】

[0006] 本發(fā)明所要解決的技術問題是如何鑒定不同的黃連屬植物。
[0007] 為解決上述技術問題，本發(fā)明首先提供了下述1)或2)或3)的應用：
[0008] 1)黃連分子標記或所述黃連分子標記的多態(tài)性在鑒定或輔助鑒定黃連屬植物中 的應用；
[0009] 2)檢測所述黃連分子標記的多態(tài)性的物質在鑒定或輔助鑒定黃連屬植物中的應 用；
[0010] 3)檢測所述黃連分子標記的多態(tài)性的物質在制備鑒定或輔助鑒定黃連屬植物的 產(chǎn)品中的應用；
[0011] 所述黃連分子標記，為下述A1-A4 :
[0012] A1、以黃連屬植物的基因組DNA為模板，采用引物對037A4進行擴增得到的DNA分 子；
[0013] 所述引物對037A4由與SEQ ID No. 1的第430位上游特異結合的單鏈DNA和與 SEQ ID No. 1的第440位下游特異結合的單鏈DNA組成；
[0014] A2、以黃連屬植物的基因組DNA為模板，采用引物對034H11進行擴增得到的DNA 分子；
[0015] 所述引物對034H11由與SEQ ID No. 2的第154位上游特異結合的單鏈DNA和與 SEQ ID No. 2的第368位下游特異結合的單鏈DNA組成；
[0016] A3、以黃連屬植物的基因組DNA為模板，采用引物對006G4進行擴增得到的DNA分 子；
[0017] 所述引物對006G4由與SEQ ID No. 3的第31位上游特異結合的單鏈DNA和與SEQ ID No. 3的第350位下游特異結合的單鏈DNA組成；
[0018] A4、以黃連屬植物的基因組DNA為模板，采用引物對008H3進行擴增得到的DNA分 子；
[0019] 所述引物對008H3由與SEQ ID No. 4的第120位上游特異結合的單鏈DNA和與 SEQ ID No. 4的第240位下游特異結合的單鏈DNA組成。
[0020] 上述應用中，所述SEQ ID No. 1的第430位上游可為與SEQ ID No. 1第430位對 應的黃連屬植物基因組DNA中那位核苷酸的上游；
[0021] 所述SEQIDNo.1的第440位下游可為與SEQIDNo.1第440位對應的黃連屬植 物基因組DNA中那位核苷酸的下游；
[0022] 所述SEQ ID No. 2的第154位上游可為與SEQ ID No. 2第154位對應的黃連屬植 物基因組DNA中那位核苷酸的上游；
[0023] 所述SEQIDNo. 2的第368位下游可為與SEQIDNo. 2第368位對應的黃連屬植 物基因組DNA中那位核苷酸的下游；
[0024] 所述SEQIDNo. 3的第31位上游可為與SEQIDNo. 3第31位對應的黃連屬植物 基因組DNA中那位核苷酸的上游；
[0025] 所述SEQ ID No. 3的第350位下游可為與SEQ ID No. 3第350位對應的黃連屬植 物基因組DNA中那位核苷酸的下游；
[0026] 所述SEQ ID No. 4的第120位上游可為與SEQ ID No. 4第120位對應的黃連屬植 物基因組DNA中那位核苷酸的上游；
[0027] 所述SEQIDNo. 4的第240位下游可為與SEQIDNo. 4第240位對應的黃連屬植 物基因組DNA中那位核苷酸的下游。
[0028] 上述應用中，所述擴增可為PCR擴增。
[0029] 上述應用中，所述A1的多態(tài)性可為下述A11-A13:
[0030] All為對應于SEQ ID No. 1第433-435位所述A1的核苷酸為GTA或TCC，將該分 子標記命名為037A4-1;
[0031] A12為對應于SEQ ID No. 1的第438-440位所述A1的核苷酸為TCC或GTA，將該 分子標記命名為037A4-2;
[0032] A13為對應于SEQ ID No. 1的第430-440位間所述A1的同源染色體相比較有或無 核苷酸的替換，將該分子標記命名為037A4-3;
[0033] 所述A2的多態(tài)性可為下述A21-A24:
[0034] A21為對應于SEQ ID No. 2的第154位所述A2的核苷酸為G或A，將該分子標記 命名為034H11-1;
[0035] A22為對應于SEQ ID No. 2的第285位和第286位間所述A2有或無核苷酸的插 入，將該分子標記命名為034H11-2;
[0036] A23為對應于SEQ ID No. 2的第359-360位所述A2的核苷酸為CC或TT，將該分 子標記命名為034H11-3;
[0037] A24為對應于SEQ ID No. 2的第320-330位間所述A2有或無核苷酸插入和/或刪 除，造成同源染色體對應核苷酸區(qū)段長度不同或相同，將該分子標記命名為034H11-4;
[0038] 所述A3的多態(tài)性可為下述A31-A35:
[0039] A31為對應于SEQ ID No. 3的第254位所述A3的核苷酸為G或A，將該分子標記 命名為006G4-1;
[0040] A32為對應于SEQ ID No. 3的第286位所述A3的核苷酸為C或T，將該分子標記 命名為006G4-2;
[0041] A33為對應于SEQ ID No. 3的第225-245位間所述A3有或無核苷酸插入和/或刪 除，造成同源染色體對應核苷酸區(qū)段長度不同或相同，將該分子標記命名為006G4-3;
[0042] A34為對應于SEQ ID No. 3的第325-345位間所述A3有或無核苷酸插入和/或刪 除，造成同源染色體對應核苷酸區(qū)段長度不同或相同，將該分子標記命名為006G4-4;
[0043] A35為對應于SEQ ID No. 3的第31-50位間所述A3有或無核苷酸插入和/或刪 除，造成同源染色體對應核苷酸區(qū)段長度不同或相同，將該分子標記命名為006G4-5;
[0044] 所述A4的多態(tài)性可為下述A41-A43:
[0045] A41為對應于SEQ ID No. 4的第126位所述A4的核苷酸為A或G，將該分子標記 命名為008H3-1;
[0046] A42為對應于SEQ ID No. 4的第130-150位間所述A4有或無核苷酸插入和/或刪 除，造成同源染色體對應核苷酸區(qū)段長度不同或相同，將該分子標記命名為008H3-2;
[0047] A43為對應于SEQ ID No. 4的第220-240位間所述A4有或無核苷酸插入和/或刪 除，造成同源染色體對應核苷酸區(qū)段長度不同或相同，將該分子標記命名為008H3-3。
[0048] 上述應用中，所述引物對037A4可為由SEQIDNo. 1的第17-40位所示的單鏈DNA 和與SEQIDNo. 1的第519-538位反向互補的單鏈DNA組成的引物對；
[0049] 所述引物對034H11可為由SEQ ID No. 2的第15-36位所示的單鏈DNA和與SEQ ID No. 2的第557-576位反向互補的單鏈DNA組成的引物對；
[0050] 所述引物對006G4可為由SEQ ID No. 3的第9-30位所示的單鏈DNA和與SEQ ID No. 3的第776-795位反向互補的單鏈DNA組成的引物對；
[0051] 所述引物對008H3可為由SEQ ID No. 4的第10-32位所示的單鏈DNA和與SEQ ID No. 4的第573-595位反向互補的單鏈DNA組成的引物對。
[0052] 為解決上述技術問題，本發(fā)明還提供了所述黃連分子標記。
[0053] 為解決上述技術問題，本發(fā)明還提供了檢測所述黃連分子標記多態(tài)性的物質。
[0054] 本發(fā)明所提供的檢測所述黃連分子標記多態(tài)性的物質，為所述引物對037A4、所述 引物對034H11、所述引物對006G4和/或所述引物對008H3。
[0055] 為解決上述技術問題，本發(fā)明還提供了鑒定或輔助鑒定黃連屬植物的產(chǎn)品。