檢測的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及環(huán)境污染物檢測領(lǐng)域，具體涉及基于Exo III (核酸外切酶III)輔助 的目標(biāo)物循環(huán)和DNAzyme (脫氧核酶）切割循環(huán)構(gòu)建的雙重放大熒光反應(yīng)用于檢測Hg2+，尤 其涉及檢測水溶液中的Hg2+的檢測。
【背景技術(shù)】
[0002] Hg2+作為一種最常見和穩(wěn)定形式的汞，由于其即使在較低濃度下具有高毒性的性 質(zhì)，是一種嚴(yán)重的環(huán)境污染物。因?yàn)槠渚哂猩锢鄯e性，Hg 2+的攝取危害人類健康。當(dāng)其在 人體內(nèi)過量存在時(shí)，會(huì)損害人類的神經(jīng)系統(tǒng)、腎臟和其他器官。因此，迫切需要發(fā)展一種可 靠且靈敏的方法用于Hg 2+的檢測。傳統(tǒng)的檢測方法，包括原子吸收光譜和電感耦合等離子 體質(zhì)譜已經(jīng)發(fā)展起來用于Hg2+的檢測。然而，這些方法需要復(fù)雜的儀器和樣品預(yù)處理，限制 了其在實(shí)際和日常檢測中的應(yīng)用。在熒光、電化學(xué)和比色技術(shù)的基礎(chǔ)上，一些簡便且經(jīng)濟(jì)的 方法被建立起來。其中，熒光法以其良好的準(zhǔn)確性和高靈敏度受到廣泛關(guān)注。
[0003] Ono及其合作者報(bào)導(dǎo)，T-T錯(cuò)配堿基能夠選擇性的結(jié)合Hg2+，形成T-Hg 2+-T金屬堿 基對(duì)，由于N-Hg2+-N鍵的形成，此金屬堿基對(duì)比天然的沃森-克里克堿基對(duì)更穩(wěn)定。這一發(fā) 現(xiàn)為Hg 2+檢測實(shí)驗(yàn)提供了高選擇性和有效的識(shí)別方式。Yang課題組展示了金屬離子誘導(dǎo) 的單、雙鏈DNA的構(gòu)型轉(zhuǎn)變，借助金納米顆粒實(shí)現(xiàn)對(duì)Hg 2+的檢測。Lou課題組構(gòu)建了基于芯 片的傳感器用于檢測Hg2+。然而，多數(shù)這些方法的檢測限大于1. 0X 10 sm〇l ? L \不能滿足 美國環(huán)境保護(hù)署的檢測要求（1. 0X 10 sm〇l ? L \ 2011)。
[0004] -些基于酶的靈敏的方法被建立起來，這些酶包括切刻酶，外切酶和聚合酶。雖然 靈敏度有所提尚，實(shí)驗(yàn)結(jié)果并不完全令人滿意，這是由其一步放大機(jī)制造成的。Zhang和他 的合作者將鏈置換擴(kuò)增和短的淬滅-熒光探針結(jié)合起來發(fā)展了一種Hg 2+檢測方法。Wi 1 lner 課題組提出了一種Hg2+誘導(dǎo)的聚合/切刻機(jī)器，產(chǎn)生DNAzyme用于循環(huán)切割底物。雖然實(shí) 現(xiàn)了兩步放大，此過程需要引物來產(chǎn)生大量的DNA重復(fù)序列和特殊的切刻酶識(shí)別位點(diǎn)來進(jìn) 行切刻反應(yīng)，這就增加了探針設(shè)計(jì)的復(fù)雜性。因此，仍然需要構(gòu)建一種新的機(jī)制來簡化探針 設(shè)計(jì)并且獲得良好的擴(kuò)增能力。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為解決上述現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，發(fā)明人提出了一種新型雙重放大反應(yīng)用于靈敏 和選擇性的檢測Hg 2+。所述的雙重放大方法是基于Exo III輔助的目標(biāo)物循環(huán)和DNAzyme 切割循環(huán)，通過T-rich部分T-Hg2+-T堿基對(duì)的形成，A-DNA靠近H-DNA，打開封閉在發(fā)卡結(jié) 構(gòu)中的DNAzyme，形成Hg-Complex。在Exo III的作用下，Hg2+和A-DNA被釋放出來，引發(fā) 與另一個(gè)H-DNA的雜交反應(yīng)，產(chǎn)生大量的DNAzyme。得到的DNAzyme能夠?qū)Ψ肿有艠?biāo)底物進(jìn) 行循環(huán)切割。因此，這種新型雙重放大方法被建立起來并且能夠靈敏和選擇性的檢測水溶 液中的Hg 2+甚至是污水樣品中的Hg 2+。此外，這一方法克服了設(shè)計(jì)上的要求并且較好的實(shí) 現(xiàn)了雙重放大效果。
[0006] 本發(fā)明涉及以下技術(shù)方案：
[0007] -種雙重放大反應(yīng)方法，其特征是：Hg2+存在時(shí)，其能夠與頸環(huán)結(jié)構(gòu)探針和單鏈 探針中T-T錯(cuò)配堿基相互作用，形成Hg 2+介導(dǎo)的金屬堿基對(duì)，加入Exo III后釋放出Hg2+、 DNAzyme和單鏈探針，自由的Hg2+和單鏈探針引發(fā)與頸環(huán)結(jié)構(gòu)探針之間的雜交反應(yīng)，產(chǎn)生 大量的DNAzyme序列，完成信號(hào)一級(jí)放大；DNAzyme催化分子信標(biāo)裂分釋放焚光信號(hào)，并重 新釋放DNAzyme，進(jìn)行信號(hào)的二級(jí)放大；當(dāng)Hg2+不存在時(shí)，頸環(huán)結(jié)構(gòu)的探針與單鏈探針的 T-rich部分存在T-T堿基錯(cuò)配，不產(chǎn)生自由的DNAzyme序列來產(chǎn)生信號(hào)。
[0008] -種雙重放大反應(yīng)方法，包括探針H-DNA (發(fā)卡DNA)和A-DNA (輔助DNA)，H-DNA 包含懸垂在3'末端的T-rich部分和封閉在發(fā)卡結(jié)構(gòu)中的DNAzyme部分，T-rich部分含有 用于選擇性識(shí)別Hg 2+的T堿基和輔助Hg-Complex形成的G/C堿基，DNAzyme被封閉在發(fā)卡 的頸環(huán)結(jié)構(gòu)中，用來進(jìn)行隨后的DNAzyme切割循環(huán)。A-DNA是一條單鏈結(jié)構(gòu)的DNA，自5'到 3'依次為保護(hù)部分、互補(bǔ)部分和T-rich部分，A-DNA中T-rich部分與H-DNA中的類似，兩 者共同作用完成對(duì)Hg 2+的特異性結(jié)合和H-DNA和A-DNA雙鏈的形成，互補(bǔ)部分和保護(hù)部分 引發(fā)鏈置換反應(yīng)、打開封閉有DNAzyme的發(fā)卡結(jié)構(gòu)并進(jìn)一步輔助Exo III介導(dǎo)的循環(huán)。
[0009] 當(dāng)Hg2+存在時(shí)，其能夠與H-DNA和A-DNA中T-T錯(cuò)配堿基相互作用，形成Hg 2+ 介導(dǎo)的金屬堿基對(duì)，T-Hg2+-T，目標(biāo)物的識(shí)別將H-DNA與A-DNA結(jié)合起來，引發(fā)它們之間 的鏈置換反應(yīng)，獲得Hg 2+介導(dǎo)的帶有懸垂的保護(hù)部分和DNAzyme部分的雙鏈結(jié)構(gòu)（稱為 Hg-Complex)，在Exo III的作用下，催化Hg-Complex雙鏈部分由3'平末端的核苷酸逐步水 解，最終，釋放出Hg2+和A-DNA，自由的Hg 2+和A-DNA能夠引發(fā)與另一個(gè)H-DNA之間的雜交反 應(yīng)，產(chǎn)生大量的DNAzyme序列，產(chǎn)生的DNAzyme序列能夠與加入的MB雜交，在輔助因子Zn 2+ 存在下，重復(fù)地催化MB的斷裂。因此，實(shí)現(xiàn)了基于Exo III輔助的目標(biāo)物循環(huán)和DNAzyme 切割循環(huán)的新型雙重放大策略，兩種探針，H-DNA和A-DNA被合理的設(shè)計(jì)用來獲得最佳的結(jié) 果。如圖1所示。
[0010] 所述探針H-DNA和A-DNA的T-rich部分的G/C堿基個(gè)數(shù)為3、4、5、6、7或8個(gè)，優(yōu) 選6個(gè)。
[0011] 優(yōu)選：H-DNA3(SEQ ID N0:1) :CAT CTC TTC TCC GAG CCG GTC GAA ATA GTG GGT AAT GAA GAG ATG GTT TCG 與 A-DNA3(SEQ ID N0:2) :CGT TTC CAT CTC TTC AAA AAG;
[0012] H-DNA4(SEQ ID NO:3) :CAT CTC TTC TCC GAG CCG GTC GAA ATA GTG GGT AAT GAA GAG ATG GTT TCG G 與 A-DNA4(SEQ ID N0:4) :CCG TTT CCA TCT CTT CAA AAA G;
[0013] H-DNA5(SEQ ID NO:5) :CAT CTC TTC TCC GAG CCG GTC GAA ATA GTG GGT AAT GAA GAG ATG GTT TCG GG與A-DNA5(SEQ ID N0:6) :CCC GTT TCC ATC TCT TCA AAA AG;
[0014]更優(yōu)選：H-DNA6(SEQ ID NO:7) :CAT CTC TTC TCC GAG CCG GTC GAA ATA GTG GGT AAT GAA GAG ATG GTT TCG GGG與A-DNA6(SEQ ID N0:8) :CCC CGT TTC CAT CTC TTC AAA AAG；
[0015] H-DNA7(SEQ ID NO:9) :CAT CTC TTC TCC GAG CCG GTC GAA ATA GTG GGT AAT GAA GAG ATG GTT TCG GGG G與A-DNA7(SEQ ID N0:10) :CCC CCG TTT CCA TCT CTT CAA AAA G；
[0016]或H-DNA8(SEQ ID N0:11) :CAT CTC TTC TCC GAG CCG GTC GAA ATA GTG GGT MT GAA GAG ATG GTT TCG GGG GG與A-DNA8(SEQ ID N0:12) :CCC CCC GTT TCC ATC TCT TCA AAA AG〇
[0017]優(yōu)選分子信標(biāo)為SEQ ID N0:13 :FAM-CCA CCA CAC TGA AAT TGA CCC ACT ATrA GGA AGA GAT GIT ACG AGG CGG TGG TGG-Dacyl，rA為核糖核酸。
[0018] DNAzyme序列：CATCTCTTCTCCGAGCCGGTCGAAATAGTGGGTAAo
[0019] H-DNA 的互補(bǔ)序列：T GAAGAGATG。
[0020] A-DNA 的互補(bǔ)序列：CATCTCTTC A。
[0021] H-DNA 的T-rich序列：GITTCG。
[0022] A-DNA 的T-rich序列：CGTITC。
[0023] A-DNA 的保護(hù)序列：AA AAG。
[0024] H-DNA的發(fā)卡結(jié)構(gòu)的頸部序列：CATCTCTTC ;GAAGAGA