專利名稱：：全種子特異性啟動子的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及提供用于基因表達的手段和方法。具體來說，本發(fā)明涉及一種多核苷酸，該多核苷酸包含表達控制序列，該控制序列允許與其可操作地連接的目的核酸在植物中進行種子特異性表達。此外，本發(fā)明還提供基于所述多核苷酸的載體、宿主細胞、轉(zhuǎn)基因植物和用于表達目的核酸的方法。
背景技術(shù)：
：轉(zhuǎn)基因植物的生產(chǎn)是植物生物技術(shù)的一項根本技術(shù)，并因此是用于植物基礎(chǔ)研究、以及用于產(chǎn)生具有農(nóng)業(yè)改良新性能的植物、用于提高人類食品質(zhì)量、或產(chǎn)生特定化學物質(zhì)或醫(yī)藥品所必不可少的前提條件。在植物中通過轉(zhuǎn)基因表達特定基因的一個基本前提是提供植物特異性啟動子。有多種植物啟動子是已知的。目前在植物中主要應(yīng)用的組成型啟動子幾乎全部是病毒啟動子或從農(nóng)桿菌分離出來的啟動子，例如，花椰菜花葉病毒啟動子CaMV35S(0dell等(1985)Nature313:810-812)。由于產(chǎn)物的概念和轉(zhuǎn)基因作用模式變得更加復(fù)雜，組成型表達不再是表達的最佳期望模式。例如，盡管對脅迫誘導(dǎo)的基因的操作可在提高植物對脅迫的耐受性中起到重要作用，但已經(jīng)證實，當脅迫不存在時，脅迫誘導(dǎo)型基因的組成型表達對植物生長和發(fā)育具有嚴重的負面影響(Kasuga等(1999)NatureBiotechnology17(3):287-291)。因此，期望的是啟動子驅(qū)動在空間上和/或在時間上進行區(qū)分的表達。在農(nóng)藝學重要的糧食作物中，種子的形成是植物發(fā)育的最終目標。種子收獲后被用于食物、飼料和工業(yè)產(chǎn)品。這些種子的利用和其價值取決于其中的蛋白質(zhì)、油分和淀粉的含量和質(zhì)量。單子葉植物種子可以被認為由兩個主要區(qū)室組成一是胚芽或胚胎，它包含將自種子發(fā)育形成的植物的祖先細胞；二是胚乳，它充當在種子萌發(fā)和早期小植物發(fā)育過程中所消耗的營養(yǎng)組分(特別是儲存的淀粉、蛋白質(zhì)和油)的貯庫。雙子葉植物種子大部分由胚芽部分組成，因為在發(fā)育的雙子葉植物中營養(yǎng)功能是由種子外的營養(yǎng)儲存物質(zhì)提供的。已經(jīng)有許多能夠以各種組合的空間和時間表達模式驅(qū)動轉(zhuǎn)基因表達的啟動子被鑒定和表征。本領(lǐng)域也已知一些在植物種子中控制表達的啟動子。這些已知的啟動子控制在植物種子的部分或整個種子中的表達。例如，已經(jīng)顯示，種子儲存蛋白的啟動子驅(qū)動主要在種子中的表達。這些啟動子包括菜豆蛋白的啟動子(US5,504,200,BustosΜ.Μ.等，PlantCell.1989,2(9):839-53)、2S白蛋白啟動子(JoseffsonL.G.等，J.Biol.Chem.1987,262:12196-12201)、豆球蛋白啟動子(ShirsatA等，MolGenGenet.1989，215(2):326-331)、USP啟動子(未知種子蛋白質(zhì)；BaumleinH，等，Molecular&GeneralGenetics1991,225(3):459-67)、napin啟動子(StalbergK.，等，L.Planta1996,199515-519)、蔗糖結(jié)合蛋白啟動子(TO00/26388)或LeB4啟動子(BaumleillH.等，MolGenGenet1991,225:121-128)。通過利用“T-DNAtagging”的方法，一種對蒴果特異的隱藏性啟動子在煙草中被鑒定出來(FobertP.R.等，PlantJournal1994,6(4):567-77；US5，824，863；WO99/53067)。指導(dǎo)在整個種子中并由此在胚乳和胚兩者中表達的種子特異性啟動子只就雙子葉植物而未就單子葉植物進行過描述。唯一可得的用于在單子葉植物中全種子表達的啟動子是組成型啟動子，它們確實在種子的兩個主要區(qū)室中均表達，但是也驅(qū)動轉(zhuǎn)基因在大多數(shù)或所有其它組織中表達。然而，目前還沒有可靠地控制目的核酸在單子葉植物的整個種子中表達的手段和方法，這些手段和方法是迫切需要的。因此，本發(fā)明的技術(shù)問題可以被視為提供能夠滿足上述需求的手段和方法。該技術(shù)問題通過在權(quán)利要求書和下文中描述的實施方案而得到解決。
發(fā)明內(nèi)容據(jù)此，本發(fā)明公開了一種多核苷酸，該多核苷酸包含表達控制序列，該表達控制序列使得可以在植物中種子特異地表達與其可操作地連接的目的核酸，所述表達控制序列選自(a)具有SEQIDNOs:1至3之任一所示的核酸序列的表達控制序列；(b)具有與SEQIDNOs:1至3之任一所示的核酸序列至少80%相同的核酸序列的表達控制序列；(c)具有在嚴緊條件下與SEQIDNOs:1至3之任一所示的核酸序列雜交的核酸序列的表達控制序列；(d)具有與位于SEQIDNOs:4，6或8之任一所示的開放閱讀框序列上游的核酸序列雜交的核酸序列的表達控制序列；(e)具有與位于編碼SEQIDNOs:5，7或9之任一所示的氨基酸序列的開放閱讀框序列上游的核酸序列雜交的核酸序列的表達控制序列；(f)具有與開放閱讀框序列的上游核酸序列雜交的核酸序列的表達控制序列，其中所述開放閱讀框序列與SEQIDNOs:4，6或8之任一所示的開放閱讀框序列至少80%相同，且其中該開放閱讀框編碼種子蛋白；(g)具有與開放閱讀框的上游核酸序列雜交的核酸序列的表達控制序列，其中所述開放閱讀框編碼與SEQIDNOs:5，7或9之任一所示的氨基酸序列至少80%相同的氨基酸序列，其中該開放閱讀框編碼種子蛋白；(h)表達控制序列，其可以自SEQIDNOs:4，6或8之任一所示的開放閱讀框序列的第一個外顯子出發(fā)，在基因組DNA上，通過5'基因組步行或熱不對稱交錯聚合酶鏈式反應(yīng)(TAIL-PCR)獲得；以及(i)表達控制序列，其可以自開放閱讀框序列的第一個外顯子出發(fā)，在基因組DNA上，通過5'基因組步行或TAIL-PCR獲得，其中該開放閱讀框序列與SEQIDN0s:4，6或8之任一所示的開放閱讀框序列至少80%相同，且其中該開放閱讀框編碼種子蛋白；以及(j)表達控制序列，其可以自開放閱讀框序列的第一個外顯子出發(fā)，在基因組DNA上，通過5'基因組步行或TAIL-PCR獲得，其中該開放閱讀框序列編碼與SEQIDNOs5,7或9之任一所示的開放閱讀框編碼的氨基酸序列至少80%相同的氨基酸序列，且該開放閱讀框編碼種子蛋白。本發(fā)明所使用的術(shù)語“多核苷酸”是指線性或環(huán)形核酸分子。優(yōu)選地，該分子包括DNA分子。本發(fā)明的多核苷酸的特征在于，它應(yīng)包含于本說明書中的其它地方定義的表達控制序列。除了表達控制序列以外，本發(fā)明的多核苷酸優(yōu)選地還包含至少一個可操作地連接該表達控制序列和/或至少一個轉(zhuǎn)錄終止序列的目的核酸。因而，本發(fā)明的多核苷酸優(yōu)選地包含用于表達至少一個目的核酸的表達盒。代替目的核酸或除了目的核酸以外額外地，至少一個表達盒還可以包含多克隆位點和/或轉(zhuǎn)錄終止序列。在此情況下，多克隆位點優(yōu)選地按可以使要導(dǎo)入到多克隆位點中的核酸可操作地與表達控制序列連接的方式來安排。除了上述組分以外，本發(fā)明的多核苷酸優(yōu)選地可以包含同源重組所需的組分，即，來自目標座位的側(cè)翼基因組序列。然而，也考慮基本上由所述表達控制序列組成的多核苷酸。本發(fā)明所使用的術(shù)語“表達控制序列”是指能夠控制與其可操作地連接的其它核酸(例如，在本說明書其它地方詳細提及的目的核酸)的表達的核酸。依照本發(fā)明所提及的表達控制序列優(yōu)選地包含被多肽(即轉(zhuǎn)錄因子)識別和結(jié)合的序列基序。所述的轉(zhuǎn)錄因子應(yīng)在結(jié)合后募集RNA聚合酶，優(yōu)選地RNA聚合酶I、II或III，更優(yōu)選地RNA聚合酶II或III，最優(yōu)選地RNA聚合酶II?？刹僮鞯嘏c表達控制序列相連接的核酸的表達將因此被啟動。應(yīng)理解，根據(jù)待表達的核酸(即目的核酸)的類型，本文中的表達可以包括自該核酸序列的RNA多核苷酸的轉(zhuǎn)錄(適用于例如反義方法或RNAi方法)，或者可以包括RNA多核苷酸的轉(zhuǎn)錄以及其后所述RNA多核苷酸翻譯成多肽(適用于例如基因表達和重組多肽生產(chǎn)方法)。為了控制核酸的表達，表達控制序列可以被置于緊鄰需表達核酸的位置，即物理地連接到所述核酸的5'末端?？蛇x擇的是，表達控制序列可以被置于物理的附近位置。然而，在后一種情況中，表達控制序列必須被置于可與需表達的核酸發(fā)生功能性相互作用的位置。本發(fā)明所述的表達控制序列優(yōu)選地包含200至5000個核苷酸長度，更優(yōu)選地，包含500至2500個核苷酸，再優(yōu)選地1000至1500個核苷酸。如上所述，表達控制序列優(yōu)選地包含多個序列基序，這些序列基序是轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合或賦予包含表達控制序列的多核苷酸某種結(jié)構(gòu)所需的。序列基序有時也稱作順式調(diào)控元件，在本文中意欲包括啟動子元件及增強子元件。本發(fā)明的表達控制序列允許種子特異性表達，因而其包含順式調(diào)控元件，該順式調(diào)控元件能夠在所述的組織中招募RNA聚合酶，以使可操作地連接到所述表達控制序列的核酸進行組織特異性轉(zhuǎn)錄?？梢园诒景l(fā)明的多核苷酸中的優(yōu)選表達控制序列具有SEQIDNOs:1至3之任一所示的核酸序列。再優(yōu)選地，本發(fā)明的多核苷酸包含的表達控制序列具有與SEQIDNOs:4，6或8之任一所示的開放閱讀框序列的上游核酸序列雜交的核酸序列，即，是變體表達控制序列。應(yīng)理解，表達控制序列可以由于等位基因變異而在其序列上稍有不同。因此，本發(fā)明也涉及可以從SEQIDNOs:1至3之任一所示的表達控制序列衍生出的表達控制序列。所述表達控制序列能夠，優(yōu)選在嚴緊條件下，與SEQIDNOs.5，6或8之任一所示的開放閱讀框的上游序列雜交，即與SEQIDNOs:1至3之任一所示的表達控制序列雜交。本文中，嚴緊雜交條件優(yōu)選地是指，尾隨一個或多個在0.2xSSC,0.1%SDS中在53至65°C，優(yōu)選在55°C、56°C、57V、58°C、59°C、60°C、61V、62V、63°C、64V或65°C，的洗滌步驟的、在6x氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)中在約45°C的雜交條件。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道這些雜交條件依據(jù)核酸種類以及例如是否存在有機溶劑，就溫度和緩沖液的濃度而言，可以是不同的。例如，在“標準雜交條件”下，在濃度為0.1至切55((!17.2)的水性緩沖液中，溫度依據(jù)核酸種類的不同而在42°C至58°C之間變動。如果所述緩沖液中存在有機溶劑，例如50%的甲酰胺，標準雜交條件下的溫度為約42°C。對于DNA=DNA雜交體，雜交條件優(yōu)選地為例如0.1χSSC以及20°C至450C(優(yōu)選為30°C至45°C)。對于DNA=RNA雜交體，雜交條件優(yōu)選地為例如0.1χSSC以及30°C至55°C(優(yōu)選為45°C至55°C)。上述的雜交溫度是例如針對長度約IOObp(堿基對)且G+C含量為50%的核酸、在沒有甲酰胺存在的條件下確定的。更優(yōu)選地，此雜交表達控制序列與SEQIDNOs:1至3之任一所示的表達控制序列具有至少70%、至少80%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%的同一性。同一性百分數(shù)值優(yōu)選地在整個核酸序列區(qū)域上計算。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以利用一系列基于各種算法的程序來比較不同的序列。在此，采用Needleman和^msch的算法、或Smith和Waterman的算法可以得出尤其可靠的結(jié)果?？梢圆捎肞ileUp程序(J.Mol.Evolution.，25，351-360，1987，Higgins1989，CABI0S，5:151-153)或GCG軟件包(GeneticsComputerGroup,575ScienceDrive,Madison,Wisconsin,USA5371lversion1991)中的Gap與BestFit程序(Needleman1970J.Mol.Biol.48;443_453andSmith1981,Adv.Appl.Math.2；482-489)進行序列比對。上述以百分比(%)表示的序列同一性數(shù)值優(yōu)選地用GAP程序在整個序列區(qū)段上利用以下參數(shù)設(shè)置來確定空位權(quán)重為50、長度權(quán)重為3、平均匹配數(shù)為10.000、平均錯配數(shù)為0.000，除非另有說明，這些設(shè)置應(yīng)總是被用作進行序列比對的標準設(shè)置。此外，允許種子特異性表達的表達控制序列不僅僅能夠在具有SEQIDN0s.4，6或8之任一所示的核酸序列的上述開放閱讀框的上游發(fā)現(xiàn)。而是，允許種子特異性表達的表達控制序列也能夠在直系同源基因、旁系同源基因或同源基因(即，開放閱讀框)的上游發(fā)現(xiàn)。因此，也優(yōu)選，由本發(fā)明的多核苷酸包含的表達控制序列變體具有與開放閱讀框序列的上游核酸序列雜交的核酸序列，其中所述開放閱讀框序列與SEQIDNOs:4，6和8之任一所示的序列至少70%、更優(yōu)選地至少80%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%相同。所述的變體開放閱讀框編碼的多肽具有SEQIDNOs:4，6和8之任一所示的開放閱讀框所編碼的相應(yīng)多肽的生物活性。在本文中應(yīng)該被提到的是SEQIDNO:4所示的開放閱讀框編碼具有SEQIDNO5所示的氨基酸序列的多肽，優(yōu)選地編碼種子蛋白。SEQIDNO:6所示的開放閱讀框編碼具有SEQIDNO:7所示的氨基酸序列的多肽，優(yōu)選地編碼種子蛋白，更尤其是液泡膜內(nèi)在蛋白3-1。SEQIDNO:8所示的開放閱讀框編碼具有SEQIDNO:9所示的氨基酸序列的多肽，優(yōu)選地編碼種子蛋白。同樣優(yōu)選地，由本發(fā)明的多核苷酸包含的變體表達控制序列是(i)自SEQIDNOs4，6或8之任一所示的開放閱讀框序列、由5'基因組步行或TAIL-PCR可獲得的，或(ii)自與SEQIDNOs:4，6或8之任一所示的開放閱讀框至少80%相同的開放閱讀框序列、由5'基因組步行或TAIL-PCR可獲得的。表達控制序列變體可以很容易由基因組步行技術(shù)或熱不對稱交錯聚合酶鏈式反應(yīng)(TAIL-PCR)獲得，這些技術(shù)或TAIL-PCR可以按本文實施例中所描述的方式、利用例如可商業(yè)獲得的試劑盒來進行。本說明書中就SEQIDNO:1所示的表達控制序列提及的變體表達控制序列優(yōu)選地包含表4中所列的至少10個、至少20個、至少30個或所有的序列基序。本說明書中就SEQIDNO:2所示的表達控制序列提及的變體表達控制序列優(yōu)選地包含表9中所列的至少10個、至少20個、至少30個、至少40個、至少50個或所有的序列基序。本說明書中就SEQIDNO3所示的表達控制序列提及的變體表達控制序列優(yōu)選地包含表10中所列的至少10個、至少20個、至少30個、至少40個、至少50個或所有的序列基序。優(yōu)選的變體表達控制序列的例子如SEQIDNOs:120、121和122所示(SEQIDNO3的變體)、如SEQIDNOs:123和124所示(SEQIDNO2的變體)以及如SEQIDNOs125、126和127所示(SEQIDNO=I的變體)。與相應(yīng)的表達控制序列相比，上述變體(如SEQIDNOs120至127所示)不包含起始密碼子(ATG)。起始密碼子被BVH取代或被BVH加上位于任何兩個起始密碼子之間的終止密碼子取代(根據(jù)IUPAC命名法B代表C或G或T，V代表A或C或G，H代表A或C或T)。因此，變體表達控制序列可以通過如上所描述的對推定的起始密碼子進行突變而獲得。表達控制序列變體的另外例子如SEQIDNOs129,130和131所示(SEQIDNO1的變體)。上述的表達控制序列不包含與毒性或變應(yīng)原肽或多肽顯示同源性的短開放閱讀框(見實施例3)。應(yīng)理解，本發(fā)明的表達控制序列中的非必需序列可以被刪除而不顯著破壞所提到的特性。也可以利用例如PLACE程序("PlantCis-actingRegulatoryDNAElements")(HigoK等(1999)NucleicAcidsRes27:1，297-300)的計算機程序或BIOBASE數(shù)據(jù)庫"Transfac"(BiologischeDatenbankenGmbH,Braunschweig)，將表達控制序列界定到特定的必需調(diào)控區(qū)域。利用這樣的方法，上述的表達控制序列變體可以人為地產(chǎn)生。此外，突變核酸序列的程序為技術(shù)人員所知，它包括例如使用與需要被突變的區(qū)域相比包含一個或多個突變(例如，在位點特異性誘變的框架內(nèi))的寡核苷酸。典型地是利用具有約15至75或更多個核苷酸的引物，其中優(yōu)選約10至約25或更多個核苷酸殘基位于待修飾序列的兩側(cè)。所述的誘變方法的具體細節(jié)和操作程序為技術(shù)人員所熟知(Kimkel等(1987)MethodsEnzymol154:367-382；Tomic等(1990)NuclAcidsResl21656；Upender等(1995)Biotechniques18(1)29-30；U.S.Pat.No.4,237,224)誘變也可以通過用例如羥胺等誘變劑處理例如包含本發(fā)明表達控制序列的載體而實現(xiàn)。誘變也導(dǎo)致上述的本發(fā)明多核苷酸變體的產(chǎn)生。本發(fā)明的多核苷酸包含的表達控制序列允許種子特異性表達。特別地，所述表達控制序列允許發(fā)生在種子的胚和胚乳中并因而在整個種子中的特異性表達。因此，本發(fā)明中的“種子”優(yōu)選地是指胚乳和胚性組織。優(yōu)選地，依據(jù)本發(fā)明的表達控制序列允許在種子發(fā)育的所有階段(例如，在授粉后35至40天的玉米種子中，見實施例)的種子特異性表達。此外，表達控制序列也可以允許在花粉中的表達(見實施例)。本發(fā)明中“特異性”意指，當存在于植物中時，可操作地連接本發(fā)明所述表達控制序列的目的核酸將優(yōu)勢地(即優(yōu)選地)在所述及的組織或細胞中表達?？梢岳斫獾氖?，通過組織特異性啟動子通常并不能實現(xiàn)在組織中的專一表達。更確切地，組織特異性啟動子似乎優(yōu)選地在某些組織中開啟，但在其他組織中仍然具有一些背景活性。這種現(xiàn)象被稱為滲漏表達。然而，本發(fā)明中特異性表達是指在所提及的植物組織中占優(yōu)勢的表達。這里所說的優(yōu)勢表達的特征是相對于其它植物組織來說，在所述的組織或細胞中具有統(tǒng)計上顯著更高量的可檢測轉(zhuǎn)錄。統(tǒng)計上顯著更高水平的表達優(yōu)選地是指，該表達量至少2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、100倍、500倍或1000倍于在具有可檢測轉(zhuǎn)錄的至少一種其它組織中的表達量?；蛘撸涫侵冈谒龅慕M織或細胞中的表達，其中在其它組織或細胞中的表達水平低于總體(整株植物)表達水平的1%、2^^3^^4%j^UOW或最優(yōu)選地15%。表達水平與存在于細胞或組織中的轉(zhuǎn)錄本(即RNA)的量、或轉(zhuǎn)錄本編碼的多肽的量直接相關(guān)?；赗NA或多肽測定轉(zhuǎn)錄的合適技術(shù)為技術(shù)人員所熟知。作為上述的替代或者優(yōu)選地補充，組織或細胞特異性意指表達限于或幾乎限于所述的組織或細胞，即在其它組織中基本上檢測不到轉(zhuǎn)錄。這里所說的“幾乎限于”是指非特異性表達在少于10種、少于5種、少于4種、少于3種、少于2種或1種其它組織中能夠檢測到。種子特異性表達能夠被確定，例如通過在以下組織和發(fā)育階段中，比較可操作地連接到表達控制序列上的目的核酸(例如，β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)報告基因)的表達1)5葉期的根和葉，2)V-7期的莖，3)開花期的葉、谷殼(husk)和穗絲(silk),4)授粉時的小穗(spikelets)/雄花穗(tassel),5)授粉后5、10、15、20和25天的谷穗(ear)或籽粒(kernel)(參見實施例)。優(yōu)選地，目的核酸的表達可以在授粉后5、10、15、20和25天的穗或籽粒中在附圖所示的分析試驗中測定。目的核酸的表達可以通過各種熟知的技術(shù)被測定，例如通過WO02/102970中所描述的Northern印跡或原位雜交技術(shù)測定，優(yōu)選地按附于本發(fā)明的實施例所述的方法測定。用于分析種子特異性表達的轉(zhuǎn)基因植物也能夠通過技術(shù)人員所熟知、并在本說明書其它地方討論的技術(shù)產(chǎn)生。術(shù)語“目的核酸”是指應(yīng)在本發(fā)明所述表達控制序列的控制下被表達的核酸。優(yōu)選地，目的核酸編碼多肽，其中該多肽在本發(fā)明所述的細胞或植物這，特別是植物種子中的存在是期望的。此多肽可以是在種子中積累、和/或其表達后對植物或種子產(chǎn)生有利影響的任何功能活性或惰性蛋白質(zhì)。應(yīng)理解的是，如果目的核酸編碼多肽，可能需要該核酸轉(zhuǎn)錄成RNA以及轉(zhuǎn)錄后的RNA翻譯成多肽。同樣優(yōu)選地，目的核酸包括生物學活性RNA分子，更優(yōu)選地，反義RNA、核酶、microRNA或siRNA。所述的生物活性RNA分子能夠用于改變存在于細胞或植物中的靶標多肽的量。例如，種子中不期望的酶活性能夠由于種子特異性表達反義RNA、核酶、microRNA或siRNA而減少。上述生物活性RNA分子所基于的生物學作用原理為技術(shù)人員所熟知。此外，技術(shù)人員熟知怎樣去獲得編碼這種生物活性RNA分子的核酸。可以理解的是，生物活性RNA分子可以通過目的核酸的轉(zhuǎn)錄而直接獲得，即不需要翻譯成多肽。優(yōu)選地，至少一個在本發(fā)明的表達控制序列的控制下待表達的目的核酸和所述的表達控制序列是異源的，即該核酸非天然地受所述的表達控制序列控制，所述的控制是以非天然地方式(例如通過遺傳工程的方法)而產(chǎn)生的。本發(fā)明所使用的術(shù)語“可操作地連接”意思是本發(fā)明的表達控制序列和目的核酸被連接起來，以使表達能夠被所述的表達控制序列所控制，即表達控制序列應(yīng)被功能性連接到所述的需表達的核酸序列上。因此，表達控制序列和需表達的核酸序列可以被物理上相互連接，例如通過將表達控制序列插入到需表達核酸序列的5'末端。或者，表達控制序列和需表達的核酸序列可以只是物理上相鄰，以使表達控制序列能夠控制至少一個目的核酸序列的表達。優(yōu)選地，表達控制序列和需表達的核酸間隔不超過700bp、500bp、300bp、IOObp、80bp、60bp、40bp、20bp、IObp或5bp。有利的是，在構(gòu)成本發(fā)明基礎(chǔ)的研究中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，(全)種子特異性表達目的核酸可以通過在來自玉米的表達控制序列或上述的變體表達控制序列(見例如表4A、11和12)的控制下表達所述目的核酸而可靠地實現(xiàn)。由于有了本發(fā)明，就可以(i)特異地操作種子組織中的生化過程，例如通過表達上述異源酶或生物活性RNA，或(ii)在上述種子組織中產(chǎn)生異源蛋白。原則上，本發(fā)明還涉及多核苷酸、載體、宿主細胞或植物用于表達目的核酸的的用途。在現(xiàn)有技術(shù)中所描述的種子特異性啟動子僅能賦予在單子葉植物種子的胚或胚乳而不是整個種子中的表達。本發(fā)明也涉及包含本發(fā)明多核苷酸的載體。術(shù)語“載體”，優(yōu)選地包括質(zhì)粒、表達載體、T-DNA載體以及人工染色體(例如細菌或酵母人工染色體)。此外，該術(shù)語也涉及打靶構(gòu)建體，該構(gòu)建體允許打靶構(gòu)建體隨機或定點整合到基因組DNA中。優(yōu)選地，該打靶構(gòu)建體包含長度足夠用于進行如下所詳細描述的同源或異源重組的DNA。包含本發(fā)明多核苷酸的載體優(yōu)選地進一步包含用于在宿主中進行擴增和/或選擇的選擇標記。載體可以用技術(shù)人員熟知的各種技術(shù)導(dǎo)入到宿主細胞中。如果被導(dǎo)入到宿主細胞中，載體可以存在于細胞質(zhì)中或可以整合到基因組中。在后一情況中，可以理解的是，載體可以進一步包含允許進行同源重組或異源插入的核酸序列。載體可以利用常規(guī)的轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染技術(shù)被導(dǎo)入到真核或原核細胞中。本文中所使用的術(shù)語“轉(zhuǎn)化”與“轉(zhuǎn)染”以及接合與轉(zhuǎn)導(dǎo)，旨在包括將外源核酸(例如DNA)導(dǎo)入到宿主細胞中的多種現(xiàn)有技術(shù)，包括磷酸鈣或氯化銣或氯化鈣共沉淀、DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、脂轉(zhuǎn)染、天然感受態(tài)、碳基簇、化學介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移、電穿孔或微粒轟擊(例如“基因槍”)。宿主細胞(包括植物細胞)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的合適方法能夠在Sambrook等(MolecularCloning:ALaboratoryManual,2nded.,ColdSpringHarborLaboratory,Co1dSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY,1989)和其它實驗手冊(例如MethodsinMolecularBiology,1995,Vol.44,Agrobacteriumprotocols,Ed.GartlandandDavey,HumanaPress,Totowa,NewJersey)中找到。優(yōu)選地，本發(fā)明所述載體適合作為克隆載體，即在微生物系統(tǒng)中可以復(fù)制。這樣的載體可以確保在細菌、優(yōu)選地在酵母或真菌中的有效克隆，和使得植物穩(wěn)定轉(zhuǎn)化成為可能。“克隆載體”典型地包含限制性核酸內(nèi)切酶識別位點(外源DNA序列可以以可確定的方式插入到該識別位點而不使載體失去其基本生物學功能)，以及適用于鑒定和篩選轉(zhuǎn)化了克隆載體的細胞的標記基因。標記基因典型地包括可以提供例如卡那霉素抗性、鏈霉素抗性、壯觀霉素抗性、四環(huán)素抗性、潮霉素抗性或氨芐青霉素抗性的基因。必須提到的載體系統(tǒng)尤其是各種適合于進行T-DNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化的雙元和共整合載體系統(tǒng)。這樣的載體系統(tǒng)通常具有這樣的特征它們至少包含農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化所需要的vir基因、以及界定T-DNA的序列(T-DNA邊界序列)。優(yōu)選地，這些載體系統(tǒng)也進一步包含順式調(diào)控區(qū)域(例如啟動子、終止子)和/或用于鑒別合適的已轉(zhuǎn)化的宿主細胞或生物體的選擇標記。共整合載體系統(tǒng)具有位于相同載體中的vir基因和T-DNA序列，而雙元系統(tǒng)基于至少兩個載體，其中一個載體包含vir基因但沒有T-DNA，而另一載體包含T-DNA但沒有vir基因。其結(jié)果是，后面述及的載體相對較小、易于操作并能在大腸桿菌和農(nóng)桿菌兩者中復(fù)制。這些雙元載體包括來自pBIB-HYG、pPZP、pBecks、pGreen系列的載體。依照本發(fā)明優(yōu)選使用的是pBinl9、pBI101、pBinAR、pGPTV、pSUN、pPZP和pCAMBIA。關(guān)于雙元載體及其使用的綜述見Hellens等，TrendsinPlantScience(2000)5,446-451此外，通過使用合適的克隆載體，本發(fā)明的多核苷酸能夠被導(dǎo)入到宿主細胞和/或植物中從而被用于轉(zhuǎn)化植物，例如在以下文獻中公布和引用的那些=PlantMolecularBiologyandBiotechnology(CRCPress,BocaRaton,Florida),chapter6/7,pp.71-119(1993)；F.F.White,VectorsforGeneTransferinHigherPlants;in-TransgenicPlants,vol.!,EngineeringandUtilization,Ed.:KungandR.Wu,AcademicPress,1993,15—38;B.Jenes等，TechniquesforGeneTransfer,in:TransgenicPlants,vol.!,EngineeringandUtilization,Ed.:KungandR.Wu,AcademicPress(1993),128-143；Potrykus,Annu.Rev.PlantPhysiol.PlantMolec.Biol.42(1991),205225。植物表達載體的例子包括如下文獻中詳細描述的那些載體=Becker,D.，Kemper,Ε.,Schell,J.,禾口Masterson,R.(1992)"Newplantbinaryvectorswithselectablemarkerslocatedproximaltotheleftborder，，，PlantMol.Biol.20:1195-1197；禾口Bevan，Μ·ff·(1984)"BinaryAgrobacteriumvectorsforplanttransformation",Nucl.AcidsRes.12:8711-8721；VectorsforGeneTransferinHigherPlants；inTransgenicPlants,Vol.!,EngineeringandUtilization,Ed.:KungandR.Wu,AcademicPress,1993,p.15-38。植物表達盒優(yōu)選地包含調(diào)控序列，該調(diào)控序列能夠控制基因在植物細胞中的表達，并以每個序列均能行使其功能(例如轉(zhuǎn)錄終止，例如多聚腺苷酸化信號)的方式功能性連接。優(yōu)選的多聚腺苷酸化信號是源自根癌農(nóng)桿菌T-DNA，例如Ti質(zhì)粒pTiACH5基因3(該基因被稱作章魚堿合酶(Gielen等，EMBOJ.3(1984)835etseq.)的多聚腺苷酸化信號或其功能等價物，然而所有其它在植物中具有功能活性的終止子也是合適的。由于植物基因表達通常不限于轉(zhuǎn)錄水平，植物表達盒優(yōu)選地包含其它功能性連接的序列，例如翻譯增強子，例如，包含增加蛋白質(zhì)/RNA比率的5’非翻譯煙草花葉病毒前導(dǎo)序列的超驅(qū)動序列(Gallie等，1987，Nucl.AcidsResearch15:8693-8711)。其它用于功能性連接在植物表達盒中的優(yōu)選序列有打靶序列，打靶序列為將目的核酸的基因產(chǎn)物定位到其相關(guān)細胞區(qū)室所需要的(其綜述見Kermode，Crit.Rev.PlantSci.15，4(1996)285-423及其引用的參考文獻)，例如定位到液泡、細胞核、所有類型的質(zhì)體(例如造粉體和色質(zhì)體)、胞外間隙、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、油體、過氧物酶體以及其它植物細胞區(qū)室?？梢岳斫獾氖牵p元載體或任何其它載體均可以通過常規(guī)DNA重組技術(shù)進行改造、在大腸桿菌中增殖、以及利用例如電穿孔或其它轉(zhuǎn)化技術(shù)導(dǎo)入到農(nóng)桿菌中(MozoandHooykaas,PlantMol.Biol.16:917-918(1991))。本發(fā)明也涉及包含本發(fā)明的多核苷酸或載體的宿主細胞。優(yōu)選地，宿主細胞為來源于植物的轉(zhuǎn)基因細胞或細胞系。更優(yōu)選地，所述的宿主細胞來源于單子葉植物。優(yōu)選的單子葉植物在本文其它地方進行了描述。來源于植物的宿主細胞涵蓋某些植物組織、器官和部分的所有表型形式(例如花藥、纖維、根毛、莖稈、胚、愈傷組織、子葉、葉柄、收獲材料、植物組織、繁殖組織、以及來源于實際轉(zhuǎn)基因植物和/或能被利用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物的細胞培養(yǎng)物)的細胞。可以理解，依據(jù)本發(fā)明的多核苷酸或載體也可以存在于原核或真核單細胞生物(也被稱為微生物)中，尤其是為了克隆目的(例如在大腸桿菌中)和為了植物轉(zhuǎn)化(例如在農(nóng)桿菌中)。因此，優(yōu)選地，術(shù)語“宿主細胞”也涵蓋原核或真核單細胞生物(也被稱為微生物)。在本發(fā)明的說明書中尤其被考慮的原核宿主細胞是根瘤菌科(Miizobiaceae)細胞，尤其是農(nóng)桿菌屬(Agrobacterium)細胞。優(yōu)選的農(nóng)桿菌細胞為根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)細胞禾口發(fā)根農(nóng)桿菌(Agrobacteriumrhizogenes)細胞。農(nóng)桿菌是土傳植物病原體，能夠?qū)⒁欢蜠NA(T-DNA)整合到植物基因組中(Chilton,等，1977Cell11:263-271；Hoekema,等，1985Nature303179-180;Bevan，1984NucleicAcidsRes.12:8711-8721；ShengandCitovsky,1996ThePlantCell,Vol.8.1699-1710)。優(yōu)選地，農(nóng)桿菌細胞/菌株已被卸甲，即缺乏介導(dǎo)冠癭病的特性或缺乏介導(dǎo)發(fā)根病的特性，但是提供感染植物的功能。優(yōu)選地，本發(fā)明中農(nóng)桿菌細胞選自LBA4404、GV2260、GV3600、EHA101、EHA105、AGL-l、LBA9402、GV3101、C0R341、C0R356、UIA143、pCH32、BIBAC2、C58Cl、pMP90和AGT121。在一個優(yōu)選的實施方案中農(nóng)桿菌細胞選自C58C1、EHA101、pMP90和LBA4404。怎樣培養(yǎng)上述農(nóng)桿菌物種為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。本發(fā)明也涉及包含本發(fā)明的多核苷酸或載體的轉(zhuǎn)基因植物或其種子。多核苷酸或載體可以存在于所述轉(zhuǎn)基因植物或其種子的細胞的細胞質(zhì)中。優(yōu)選地，多核苷酸或載體穩(wěn)定地整合到所述植物或植物種子所包含的細胞的基因組中。怎樣穩(wěn)定地將多核苷酸或載體(尤其是T-DNA載體)整合到植物細胞的基因組中，是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，并在本文其它地方進行了描述。在本發(fā)明中尤其考慮的是，多核苷酸或載體通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化，應(yīng)穩(wěn)定地整合到基因組中。依照本發(fā)明用于轉(zhuǎn)基因植物的優(yōu)選植物為單子葉植物。優(yōu)選地，在此使用的“單子葉植物”是指在種子中具有一片子葉的開花植物。特別優(yōu)選的單子葉植物(在本文中也稱作單子葉monocots)為玉米、小麥、稻、大麥、燕麥、黑麥、高粱、稷(millet)、tricalate、香蕉、黑麥草或薏苡(coix)。優(yōu)選地，術(shù)語“單子葉植物”包括以下亞科的屬的植物須芒草亞科(Andropogonoideae)(特別是，甘蔗屬(Saccharum)、高粱屬(Sorghum)、或玉蜀黍?qū)貿(mào)ea))、蘆竹亞科(Arundineae)(特別是，蘆葦屬(Phragmites))、稻亞科(Oryzoideae)(特別是，稻屬(Oryza))、稷亞科(Panicoideae)、以及更優(yōu)選地早熟禾亞科(Pooideae，F(xiàn)estuciadeae)(特別是早熟禾屬(Poa)、羊茅屬(Festuca)、黑麥草屬(Lolium)、三毛草屬(Trisetum)、剪股穎屬(Agrostis)、梯牧草屬(Wileum)、鴨茅屬(Dactylis)、看麥娘屬(Alopecurus)、燕麥屬(Avena)、小麥屬(Triticum)、黑麥屬(Secale)和大麥屬(Hordeum))。優(yōu)選的單子葉植i^J]%:Avenasativa()、Saccharumofficinarum()、Triticumdicoccum(二粒小麥，Emmerwheat)、Triticummonococcum(一粒小麥，Einkonwheat)、Triticumspelta()、Triticumdurum(立/]、胃，wheat)、Triticumturgidum(小麥)、Triticumaestivum(普通小麥，wheat)、Zeamays(玉米，maize/corn)、Panicummiliaceum(稷，commonmillet)、Pennisetumthiphoides(聲蘋粟，Bulrushmillet)、Hordeumvulgare或H.sativum(大麥，barley)>Oryzasativa(禾苗，rice)、Zizaniaaquatica(郝)(野生禾S，wildrice)、Secalecereale(黑麥，rye)、Sorghumbicolor(S.vulgare)(兩色蜀黍，高粱)。更優(yōu)選小麥(小麥屬物種)、稻(稻屬物種)、大麥(大麥屬物種)、燕麥(燕麥屬物種)、黑麥(黑麥屬物種)、玉米(玉蜀黍)、高粱和稷(狼尾草屬物禾中(Pennisettumspp·))。最優(yōu)選地，單子葉植物為玉蜀黍。本發(fā)明還涉及所述單子葉植物的某些組織、器官、和部分的所有表型形式，例如花藥、纖維、根毛、莖稈、胚、愈傷組織、子葉、葉柄、收獲材料、植物組織、繁殖組織、以及來源于12該實際轉(zhuǎn)基因植物和/或能被利用于產(chǎn)生該轉(zhuǎn)基因植物的細胞培養(yǎng)物。依據(jù)本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物或轉(zhuǎn)基因宿主細胞可以通過在以下出版物中發(fā)表和引用的轉(zhuǎn)化技術(shù)獲得PlantMolecularBiologyandBiotechnology(CRCPress,BocaRaton,Florida),6/7章，pp.71-119(1993)；F.F.White,VectorsforGeneTransferinHigherPlants；inTransgenicPlants,vol.!,EngineeringandUtilization,Ed.:KungandR.Wu,AcademicPress,1993,15-38;B.Jenes等，TechniquesforGeneTransfer,in-TransgenicPlants,vol.1,EngineeringandUtilization,Ed.:KungandR.Wu,AcademicPress(1993),128-143；Potrykus,Annu.Rev.PlantPhysiol.PlantMolec.Biol.42(1991),205-225；TransgenicPlants:MethodsandProtocolsEditor:LeandroPefia，InstitutoValencianodeInvestigacionesAgrarias,ValenciaSpainSeriesMethodsinMolecularBiology，286卷Q004)或W02006/133983。優(yōu)選地，轉(zhuǎn)基因植物可以通過T-DNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化獲得。通常，該載體系統(tǒng)的特征是它們至少包含農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化所需要的vir基因、以及界定T-DNA的序列(T-DNA邊界序列)。本說明書其它地方對合適的載體進行了詳細的描述。本發(fā)明也涉及在宿主細胞中表達目的核酸的方法，包括(a)將本發(fā)明的多核苷酸或載體導(dǎo)入到宿主細胞中；以及(b)在所述宿主細胞中表達至少一個目的核酸。本發(fā)明的多核苷酸或載體能夠通過利用本說明書其它地方詳細描述的合適轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化技術(shù)，而導(dǎo)入到宿主細胞中。目的核酸將于合適的條件下在宿主細胞中表達。為此，將宿主細胞培養(yǎng)在原則上允許核酸轉(zhuǎn)錄的條件下。此外，優(yōu)選地，宿主細胞包含利用表達控制序列表達目的核酸所需要的外源提供的或內(nèi)源存在的轉(zhuǎn)錄機器。優(yōu)選地，所述的宿主細胞為單子葉植物的細胞。此外，本發(fā)明包括在植物中表達目的核酸的方法，包括(a)將本發(fā)明的多核苷酸或載體導(dǎo)入到植物中；以及(b)在所述植物中表達至少一個目的核酸。本發(fā)明的多核苷酸或載體能夠通過利用本說明書其它地方詳細描述的合適技術(shù)，而導(dǎo)入到植物中。同樣，本發(fā)明也涉及在植物中種子特異性表達目的核酸的方法，包括(a)將本發(fā)明的多核苷酸或載體導(dǎo)入到植物中；以及(b)在所述植物中表達至少一個目的核酸。下文更詳細地描述了本發(fā)明的一些優(yōu)選實施方案。在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的多核苷酸還包含另外的遺傳控制序列。依據(jù)本發(fā)明提及的遺傳控制序列應(yīng)作廣義理解，是指所有可以對本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因表達盒的功能的實現(xiàn)產(chǎn)生影響的序列。遺傳控制序列可以改變例如真核生物中的表達和翻譯。優(yōu)選地，本發(fā)明的表達盒還包含一個本發(fā)明的啟動子(在待轉(zhuǎn)基因表達的該特定核酸序列的5’上游)和終止子序列(3’下游)、以及在合適的情況下其他常見調(diào)控元件，作為額外遺傳控制序列，其中這些遺傳控制序列每一個都與待轉(zhuǎn)基因表達的核酸序列功能性連接。遺傳控制序列也包括其它啟動子、啟動子元件或能夠改變表達控制特性的最小啟動子。由此，可以例如通過遺傳控制序列，使組織特異性表達額外地還依賴于特定脅迫因素而發(fā)生。相應(yīng)的元件已有描述，例如對于水脅迫、脫落酸(LamEandChuaNH，(1991)JBiolChem266(26):17131-17135)和熱脅迫(SchiifflF等(1989)MolGenGenetics217(2-3)=246-53)。再一可能方案是，將允許在其它植物組織或其它生物例如大腸桿菌中發(fā)生表達的其它啟動子與需表達的核酸序列功能性連接。合適的植物啟動子原則上為上述所有啟動子?？梢韵氲降氖牵?，可以使一個特定的核酸序列通過一個啟動子(例如本發(fā)明的啟動子之一)在一種植物組織中轉(zhuǎn)錄為有義RNA并翻譯成相應(yīng)的蛋白質(zhì)，而利用具有不同特異性的另一啟動子使同樣的核酸序列在不同的組織中轉(zhuǎn)錄成反義RNA并下調(diào)相應(yīng)的蛋白質(zhì)。這可以利用本發(fā)明的表達盒，通過將一個啟動子置于需轉(zhuǎn)基因表達的核酸序列的前面、而將另一個啟動子置于需表達的核酸序列的后面來實現(xiàn)。已經(jīng)證實，非翻譯區(qū)在基因表達調(diào)控中可以發(fā)揮顯著作用。已經(jīng)證實，5'非翻譯序列可以增強異源基因的瞬時表達。它們可以進一步促進組織特異性(RousterJ等(1998)PlantJ.15:435-440.)。相反地，opaque-2基因的5'非翻譯區(qū)抑制表達。該基因的此相應(yīng)區(qū)段的缺失會導(dǎo)致基因活性的增加(LohmerS等(1993)PlantCell5:65-73)。具有表達促進功能的其他5'非翻譯序列和內(nèi)含子為技術(shù)人員所知。McElroy及其同事(McElroy等(1991)MolGenGenet231(1):150-160)報道了用于單子葉植物轉(zhuǎn)化的基于稻肌動蛋白1(Actl)啟動子的構(gòu)建體。在轉(zhuǎn)基因稻細胞中組合使用Actl內(nèi)含子和35S啟動子，導(dǎo)致了表達速率相比于分離的35S啟動子增加10倍。通過優(yōu)化報告基因葡糖醛酸糖苷酶(GUQ基因的翻譯起始位點的序列環(huán)境，導(dǎo)致了在轉(zhuǎn)化的稻細胞中GUS表達的4倍增加。組合優(yōu)化的翻譯起始位點和Actl內(nèi)含子使轉(zhuǎn)化了的水稻細胞中由CaMV35S啟動子驅(qū)動的GUS表達增加了40倍；類似的結(jié)果也已經(jīng)在轉(zhuǎn)化的玉米細胞中得到?？偟貋碚f，從以上所描述的研究中已經(jīng)得出這樣的結(jié)論，基于Actl啟動子的表達載體適于控制外源DNA在轉(zhuǎn)化的單子葉植物細胞中的足夠強的組成型表達。此外，本發(fā)明的表達控制區(qū)域的表達譜可以通過利用表達增強性內(nèi)含子和/或轉(zhuǎn)錄終止序列而增強。因此，在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的多核苷酸包含至少一個額外的元件，該元件選自a)5'非翻譯區(qū)，b)內(nèi)含子編碼序列，以及c)轉(zhuǎn)錄終止序列。優(yōu)選地，“內(nèi)含子編碼序列”是指來自單子葉植物的編碼表達增強性內(nèi)含子的內(nèi)含子。更優(yōu)選地，內(nèi)含子編碼序列是來自泛素、肌動蛋白或醇脫氫酶基因的內(nèi)含子。最優(yōu)選地，內(nèi)含子編碼序列為編碼金屬硫蛋白1多肽(METl)、金屬硫蛋白樣多肽(MET-Iike)或其功能等同物或直系同源物的植物基因的第一內(nèi)含子。優(yōu)選的編碼金屬硫蛋白樣多肽(或其功能等同物或同源物)的植物基因的第一內(nèi)含子在W02006/094976和W02008/099013中公開，這些專利文獻在此作為參考文獻而被引用。優(yōu)選地，所述第一內(nèi)含子來自單子葉植物的MET樣基因。更優(yōu)選地，所述第一內(nèi)含子來自稻(見實施例)。再更優(yōu)選地，第一內(nèi)含子來自編碼SEQIDNO:118所示的多肽的MET樣基因。最優(yōu)選地，該編碼金屬硫蛋白1的植物基因的第一內(nèi)含子具有SEQIDN0:119所示的序列。也考慮，內(nèi)含子編碼區(qū)是編碼金屬硫蛋白樣蛋白的植物基因的第一內(nèi)含子的變體，特別是，具有如SEQIDNO:120所示序列的第一內(nèi)含子的變體。優(yōu)選j也，該變體和所述第一內(nèi)含子具有至少70%、至少80%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%的同一性。怎樣確定同一性的程度在本文其它地方進行了描述。優(yōu)選地，內(nèi)含子編碼序列被插入到表達構(gòu)建體中應(yīng)表達的目的核酸的5'非翻譯區(qū)(即，在表達控制序列和蛋白編碼序列(開放閱讀框)或目的核酸之間)。有利地，已經(jīng)證實，在本發(fā)明中，Metl-I內(nèi)含子增強本發(fā)明的表達控制序列在種子組織中的表達。表達盒可以還包含一個或多個功能性連接到啟動子上的所謂增強子序列，所述增強子序列可以增強核酸序列的轉(zhuǎn)基因表達。也可以在要轉(zhuǎn)基因表達的核酸序列的3'末端插入其它有利序列，例如其它調(diào)控元件或終止子?？刂菩蛄羞€指，允許同源重組或插入到宿主生物的基因組中的那些序列、或允許從基因組進行缺失的那些序列。例如可以通過同源重組，將特定基因的天然啟動子用本發(fā)明的一個啟動子取代。例如cre/lox技術(shù)等方法可以用來從宿主生物的基因組中組織特異性地(在一些情況下可誘導(dǎo)的)缺失表達盒(SauerB.(1998)Methods.14(4):381-92)。在這種情況中，特異的側(cè)翼序列(Iox序列)被附到靶基因上，隨后可以利用ere重組酶進行缺失?？梢酝ㄟ^將待引入的啟動子與DNA序列(例如，和靶基因閱讀框前的內(nèi)源序列同源的序列)連接，通過同源重組，將該待引入的啟動子放置在待轉(zhuǎn)基因表達的靶基因前面。該序列被視為遺傳控制序列。在細胞被轉(zhuǎn)化了適當?shù)腄NA構(gòu)建體后，兩個同源序列可以相互作用，從而將啟動子序列置于靶基因前面的期望位點上，結(jié)果，啟動子序列以功能性方式連接到靶基因上，構(gòu)成本發(fā)明的表達盒。同源序列的選擇可以決定啟動子的插入位點。在該情況下，表達盒可以利用單一或雙重交互重組，通過同源重組而構(gòu)建。在單一交互重組中，僅使用單一一個重組序列，插入該整個的導(dǎo)入DNA。在雙重交互重組中，待導(dǎo)入的DNA兩端有側(cè)翼同源序列，該側(cè)翼區(qū)被插入。后一程序適用于如上所述的以本發(fā)明的一個啟動子取代特定基因的天然啟動子從而改變基因表達的位置和時間。此功能性連接構(gòu)成本發(fā)明的表達盒。為了選擇成功進行了同源重組或轉(zhuǎn)化的細胞，通常需要另外導(dǎo)入選擇標記。以下將會提到各種選擇標記。選擇標記可以用來從未轉(zhuǎn)化細胞中選擇轉(zhuǎn)化細胞。同源重組在高等真核生物，特別是植物中是相對很少見的事件。占優(yōu)勢的是在宿主基因組中的隨機整合。刪除隨機整合的序列并由此富集包含正確同源重組的細胞克隆的一個可行方案是使用US6，110，736中所描述的序列特異性重組系統(tǒng)。適于作為遺傳控制序列的多聚腺苷酸化信號為植物多聚腺苷酸化信號，優(yōu)選地，來自根癌農(nóng)桿菌。在一個特別優(yōu)選的實施方案中，表達盒包含在植物中具有功能的終止子序列。在植物中具有功能的終止子序列是指，一般地，該序列能夠在植物中導(dǎo)致DNA序列的轉(zhuǎn)錄的終止。合適的終止子序列的例子是OCS(章魚堿合酶)終止子和NOS(胭脂堿合酶)終止子。然而，尤其優(yōu)選的是植物終止子序列。植物終止子序列是指，一般地，作為天然植物基因的組成部分的序列。在此方面，特別優(yōu)選的是馬鈴薯組織蛋白酶D抑制劑基因(GenBank登錄號X74980或蠶豆儲存蛋白基因VfLEIB3(GenBank登錄號Z26489)的終止子。這些終止子至少與本領(lǐng)域所描述的病毒或T-DNA終止子相當。本領(lǐng)域技術(shù)人員也知道大量的這樣的核酸和蛋白質(zhì)，所述核酸和蛋白質(zhì)在本發(fā)明表達盒的控制下或在本發(fā)明方法下的重組表達將是有利的。下面將會提到一些其表達將產(chǎn)生期望的有利效果的目的核酸的例子。本領(lǐng)域技術(shù)人員也知道大量的這樣的基因，通過表達合適的反義RNA阻抑或關(guān)閉該基因，同樣可以獲得有利效果。可以提到的有利效果的非限制性例子是促進轉(zhuǎn)基因生物的產(chǎn)生(例如通過表達選擇標記)，獲得對非生物脅迫因子(熱、冷、貧瘠、增加的濕度、干旱、環(huán)境毒素、紫外輻射)的抗性，獲得對生物脅迫因子(病原體、病毒、昆蟲和病害)的抗性，改善人或動物食物性質(zhì)，提高生長速率或產(chǎn)率。優(yōu)選地，生物脅迫因子為種傳病害(主要是真菌病害，例如，腥黑粉穗病(小麥腥黑粉菌(Tilletiatritici))；葉條紋病(麥類核腔菌(Pyrenophoragraminea))和主要在大麥中發(fā)生的散黑粉病(裸黑粉菌^stilagonuda))ο此外，籽粒、尤其是玉米粒，的最大用途是用作飼料或食物。導(dǎo)入會改變籽粒組成的基因可以極大地提高飼料或食物的價值。籽粒的主要組分是淀粉、蛋白質(zhì)和油。籽粒的這些主要組分每一都可以通過改變其水平或組成而被改善(即，可以改變各個組分的構(gòu)件的營養(yǎng)價值或者油和淀粉的相應(yīng)結(jié)構(gòu)，以提高其營養(yǎng)含量)。許多谷粒中的蛋白質(zhì)對作為飼料和食物目的、特別是作為豬、家禽和人類的食物時不是最合適的。該蛋白質(zhì)缺乏在這些物種的食譜中所必需的幾種氨基酸，從而需要向谷粒中添加補充物。限制性必需氨基酸可包括賴氨酸、甲硫氨酸、色氨酸、蘇氨酸、纈氨酸、精氨酸和組氨酸。種子和谷粒中這些必需氨基酸的含量可以通過如下機制而得到提高，所述機制包括導(dǎo)入基因以增加所述氨基酸的生物合成、減少所述氨基酸的降解、提高所述氨基酸在蛋白質(zhì)中的儲存、或增進所述氨基酸向種子或谷粒中的轉(zhuǎn)運。用來增加氨基酸生物合成的一個機制是導(dǎo)入可以對氨基酸生物合成路徑去調(diào)控的基因，以使植物不再能充分地控制生產(chǎn)水平。這可以通過去調(diào)控或繞過在氨基酸生物合成路徑中正常受該路徑的氨基酸終產(chǎn)物水平調(diào)控的步驟來實現(xiàn)。實例包括，導(dǎo)入編碼去調(diào)控型的天冬氨酸激酶或二氫吡啶二羧酸(DHDP)合成酶的基因來增加賴氨酸和蘇氨酸的產(chǎn)生，以及導(dǎo)入編碼去調(diào)控型的鄰氨基苯甲酸合成酶的基因來增加色氨酸產(chǎn)生。降低氨基酸的分解代謝可以通過導(dǎo)入如下DNA序列來實現(xiàn)，所述DNA序列能降低或消除催化分解代謝途徑中的步驟的酶(例如賴氨酸-酮戊二酸還原酶)的編碼基因的表達。谷粒的蛋白質(zhì)組成可以用各種方法來改變以改善氨基酸的平衡，這些方法包括提升天然蛋白質(zhì)的表達、降低那些具有不良組成的蛋白質(zhì)的表達、改變天然蛋白質(zhì)的組成、或?qū)刖幋a具有優(yōu)良組成的全新蛋白質(zhì)的基因?？梢詫?dǎo)入能降低儲存蛋白中的玉米醇溶蛋白家族成員的表達的DNA。該DNA可以編碼核酶或反義序列定向地降低玉米醇溶蛋白的表達或降低玉米醇溶蛋白表達的調(diào)控物(例如opaque-2基因產(chǎn)物)的表達。谷粒的蛋白質(zhì)組成可以通過共抑制現(xiàn)象來改變，即，通過表達經(jīng)轉(zhuǎn)化導(dǎo)入的、與內(nèi)源基因一樣的結(jié)構(gòu)基因或基因片段來抑制內(nèi)源基因的表達。此外，所導(dǎo)入的DNA可以編碼降解玉米醇溶蛋白的酶。玉米醇溶蛋白表達的降低可伴隨著具有更期望的氨基酸組成的蛋白質(zhì)的增加或其它主要種子組分例如淀粉的增加?；蛘?，可以導(dǎo)入嵌合基因，該嵌合基因包含編碼具有合適氨基酸組成的天然蛋白質(zhì)(例如一種球蛋白或玉米的IOkD玉米醇溶蛋白)的序列和啟動子或設(shè)計用于增加所述蛋白質(zhì)表達的其它調(diào)控序列。所述基因的編碼序列可以包括編碼必需氨基酸的額外密碼子或置換密碼子。此外，可以使用來源于其它物種的編碼序列、或部分或完全合成的序列，其中所述序列編碼設(shè)計用于增強種子的氨基酸組成的完全獨特的肽序列。導(dǎo)入改變谷粒的油含量的基因，可能是有價值的。油含量的增加可以導(dǎo)致用于飼料和食物的種子的可代謝能量的含量和密度的增加。所導(dǎo)入的基因可以編碼除去或降低脂肪酸或脂質(zhì)生物合成中的限速或調(diào)節(jié)步驟的酶。這樣的基因為例如，編碼乙酰輔酶A羧化酶、ACP-?；D(zhuǎn)移酶、β-酮脂酰-ACP合成酶以及其它熟知的脂肪酸生物合成活性的基因?？梢詫?dǎo)入基因以增加谷粒中淀粉組分的營養(yǎng)價值，例如通過增加淀粉的分支度，延緩淀粉的代謝從而改進淀粉在母牛中的利用。包含一些谷粒的飼料或食物具有不足量的維生素，因而必須加以補充以提供充分的營養(yǎng)價值?？梢钥紤]導(dǎo)入增加種子中維生素的生物合成(包括例如維生素α、Ε、Β12、膽堿等)的基因?？梢酝ㄟ^改變直鏈淀粉與支鏈淀粉的比率、淀粉分子的大小、或淀粉的分支模式，對淀粉的特性進行有利的改變。通過這些改變，許多特性可以被改良，這些特性包括例如糊化溫度、糊化熱、膜和糊的透明度。為了實現(xiàn)這些特性改變，可以單獨或以組合的方式導(dǎo)入編碼顆粒結(jié)合性或可溶性淀粉合酶活性或分支酶活性的基因。也可以用DNA例如反義構(gòu)建體來降低這些酶的內(nèi)源性活性水平。此外，一些用于飼料和食物應(yīng)用的谷粒具有不足量的維生素，因而必須加以補充以提供充分的營養(yǎng)價值?？梢钥紤]導(dǎo)入增加種子中維生素的生物合成(包括例如維生素Α、E、B12、膽堿等)的基因。再有，還可以考慮，使用植物生產(chǎn)或制備在該植物中原先根本不產(chǎn)生或不以相同水平產(chǎn)生的有用生物學化合物?？梢岳棉D(zhuǎn)化方法導(dǎo)入并表達基因來制備產(chǎn)生這些化合物的新型植物?；衔锟梢园?，例如，目前由任何生物生產(chǎn)的任何生物學化合物，例如蛋白質(zhì)、核酸、初級和中間代謝物、碳水化合物聚合物等。化合物可以由植物產(chǎn)生，在收獲和/或加工后進行提取，并用于任何目前公認的用途，例如作為藥品、香料、工業(yè)用酶等。優(yōu)選地，能與本發(fā)明的表達控制序列組合的有用目的核酸序列包括，編碼種子儲存蛋白、脂肪酸途徑酶、生育酚生物合成酶、氨基酸生物合成酶、以及淀粉分支酶的基因。依據(jù)本發(fā)明的表達控制序列可以用于表達在食品-飼料業(yè)中使用的代謝酶，例如植酸酶和纖維素酶。特別優(yōu)選編碼微生物植酸酶(GenBank登錄號Α19451)或其功能等同物的核酸，例如人工cDNA?？蓪?dǎo)致例如生育酚、生育三烯酚(tocotrienols)或類胡蘿卜素等精細化學品積累的基因表達。一個可以提及的例子是八氫番茄紅素去飽和酶。優(yōu)選編碼黃水仙(Narcissuspseudonarcissus)八氫番茄紅素去飽和酶(GenBank登錄號X78815)或其功能等同物的核酸。依據(jù)本發(fā)明的表達控制序列可以被用來表達改變油生產(chǎn)(US6，444，876)、高油生產(chǎn)(U.S.Pat.Nos.5，608，149和6，476，295)、或改變脂肪酸含量(US6，537，750)的目的核酸。優(yōu)選的脂肪酸途徑酶包括硫酯酶(U.S.Pat.Nos.5,512,482；5,530,186；5，945，585；5，639，790；5，807，893；5，955，650；5，955，329；5，759，829；5，147，792；5，304，481；5,298，421；5,344，771；和5，760，206)、甘油二酯?；D(zhuǎn)移酶(美國專利公布20030115632A1和20030028923A1)、和去飽和酶(U.S.Pat.Nos.5，689，050；5，663，068；5，614，393；5，856，157；6，117，677；6，043，411；6，194，167；5，705，391；5，663，068；5，552，306；6，075，183；6，051，754；5，689，050；5，789，220；5，057，419；5，654，402；5，659，645；6，100，091；5，760，206；6，172，106；5，952，544；5，866，789；5，443，974；和5，093，M9)，所有文獻均在此作為參考文獻被引用?？梢陨a(chǎn)營養(yǎng)藥(neutraceuticals)，例如通過表達脂肪酸延長酶和/或去飽和酶，產(chǎn)生例如花生四烯酸、EP(二十碳五烯酸)、或DHA(二十二碳六烯酸)等多不飽和脂肪酸，或生產(chǎn)具有改進營養(yǎng)價值的蛋白質(zhì)，例如具有高含量的必需氨基酸的蛋白質(zhì)(例如巴西堅果中富甲硫氨酸2S白蛋白的基因)。優(yōu)選的核酸為編碼以下的核酸巴西栗(Bertholletiaexcelsa)的富甲硫氨酸2S白蛋白(GenBank登錄號AB044391)、展葉劍葉蘚(Physcomitrellapatens)的δ-6-?；|(zhì)去飽和酶(GenBank登錄號AJ222980；Girke等(1998)PlantJ15:3948)、高山被孢霉(Mortierellaalpina)的δ-6-去飽和酶(Sakuradani等(1999)Gene238:445-453)、秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditiselegans)的δ-5-去飽和酶(Michaelson等1998，F(xiàn)EBSLetters439:215-218)、秀麗隱桿線蟲的δ-5-脂肪酸去飽和酶(des-幻(GenBank登錄號AF078796)、高山被孢霉的δ_5_去飽和酶(Michaelson等JBiolChem273:19055-19059)，秀麗隱桿線蟲的δ-6-延長酶(Beaudoin等(2000)ProcNatl.AcadSciUSA97:6421-6426)、展葉劍葉蘚的δ-6-延長酶(Zank等(2000)BiochemicalSocietyTransactions28:6M_657)，或它們的功能等同物?？梢岳缤ㄟ^表達乙酰輔酶A羧化酶，提高在正常情況下包含極少儲存蛋白或脂質(zhì)的細胞的儲存能力，以增加這些物質(zhì)的產(chǎn)量。優(yōu)選的核酸為編碼紫花苜蓿的乙酰輔酶A羧化酶(accase)(GenBankAcc.No.:L25042)或其功能等同物的核酸。關(guān)于有利基因的更多實例在例如DunwellJM(2000)JExpBot.51SpecNo:487-96中提到。作為選擇，儲存蛋白含量的增加可能有利于高蛋白產(chǎn)品的生產(chǎn)。優(yōu)選的種子儲存蛋白包括玉米醇溶蛋白。目的核酸也可以賦予對病毒、細菌、真菌、昆蟲(例如通過表達合適的Bt基因)和線蟲所引起的種子相關(guān)疾病的抗性。例如，目的核酸可以賦予對已知影響貯藏種子的真菌的抗性，這些真菌例如曲霉屬(Aspergillus)、青霉屬(Penicillium)、或鐮孢霉屬(Fusarium)(特別是，串珠鐮孢(Fusariummoniliformere))的真菌。優(yōu)選地，對鐮孢霉的抗性可以通過可操作地連接依據(jù)本發(fā)明的表達控制序列到編碼可以賦予鐮孢霉抗性的Cry-IA(b)或任何其它Cry變體的核酸序列上而獲得。此外，目的核酸可以賦予對小麥粒線蟲(Anguinatritici)的抗性，該線蟲能導(dǎo)致一粒小麥(Triticummonococcum)、黑麥(Secalecereale)、斯卑爾脫小麥和普通小麥(T.aestivum)顯著的農(nóng)作物損失。目的核酸還可以賦予對云卷蛾屬物種(Cn印hasia)的抗性，特別是對谷物卷蛾(cerealtortrix,Cnephasiapumicana)的抗性，以及對例如雜食云卷蛾(CMphasialongana)等卷葉蛾的抗性。還可以考慮，目的核酸可以賦予對例如網(wǎng)紋蛞蝓(Derocerasreticulatum)或野纓括蝓(Derocerasagreste)等麥括蝓(greyfieldslugs)的抗性。對病毒的抗性可以通過表達新型基因而獲得。例如，已經(jīng)證實在轉(zhuǎn)基因植物中表達病毒衣殼蛋白能夠賦予植物對該病毒所引起的感染的抗性、以及可能地對其他密切相關(guān)病毒所引起的感染的抗性?？梢韵氲剑ㄟ^表達靶向基本病毒功能的反義基因可以賦予對該病毒的抗性。例如，靶向負責病毒核酸復(fù)制的基因的反義基因可以抑制該復(fù)制并導(dǎo)致對該病毒的抗性。據(jù)信，通過使用反義基因干擾其它病毒功能也可以提高對病毒的抗性。18在本發(fā)明啟動子控制下的核酸表達可以發(fā)生在任何期望的細胞區(qū)室(例如內(nèi)膜系統(tǒng)、液泡和葉綠體)中。通過對分泌途徑的利用，可以獲得所需的糖基化反應(yīng)(特別是折疊等)。也可以將靶蛋白分泌到細胞表面或分泌到培養(yǎng)基中，例如在使用懸浮培養(yǎng)的細胞或原生質(zhì)體時。因而實現(xiàn)該目的所必需的靶序列可以被考慮在單獨的載體變量中，并且可以通過使用合適的克隆策略而與待被克隆的靶基因一起導(dǎo)入到載體中?？梢岳没騼?nèi)在序列(如果存在的話)或異源序列作為靶序列。其它優(yōu)選用于功能性連接的異源序列包括，但不限于可以確保亞細胞定位到質(zhì)外體、液泡、質(zhì)體、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)、細胞核、油質(zhì)體或其它細胞區(qū)室中的其它導(dǎo)向序列；以及翻譯增強子，例如來自煙草花葉病毒的5’前導(dǎo)序列(Gallie等(1987)NuclAcidsRes158693-8711)等。將本身不定位在質(zhì)體中的蛋白質(zhì)以靶向的方式轉(zhuǎn)運到質(zhì)體中的方法已經(jīng)有描述(KlosgenRB&WeilJH(1991)MolGenGenet225(2):297-304；VanBreusegemF等(1998)PlantMolBiol38(3):491-496)。優(yōu)選的序列為a)來源于豌豆、玉米和向日葵的核酮糖二磷酸羧化酶的小亞基(SSU)(RubiscoSSU)；b)衍生自植物脂肪酸生物合成中的基因的轉(zhuǎn)運肽，例如質(zhì)體?；d體蛋白(ACP)、硬脂酰-ACP去飽和酶、β-酮酰基-ACP合成酶或?；?ACP硫酯酶的轉(zhuǎn)運肽；c)GBSSI(淀粉顆粒結(jié)合性淀粉合酶1)的轉(zhuǎn)運肽；d)LHCPII基因。靶序列可以被連接到與這些轉(zhuǎn)運肽編碼序列不同的其它靶向序列上，以確保亞細胞定位到質(zhì)外體、液泡、質(zhì)體、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)、細胞核、油質(zhì)體或其它細胞區(qū)室中。還可以利用翻譯增強子，例如來自煙草花葉病毒的5'前導(dǎo)序列(Gallie等(1987)NuclAcidsRes15:8693-8711)等。本領(lǐng)域技術(shù)人員也將明了，其無需直接地使用編碼上述基因的核酸序列來表達上述基因，或例如通過反義的方法來阻抑上述基因。他也可以利用例如鋅指蛋白類的人工轉(zhuǎn)錄因子(BeerliRR等(2000)ProcNatlAcadSciUSA97(4):1495-500)。這些轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合在需表達或抑制的內(nèi)源基因的調(diào)控區(qū)域中，并取決于該因子的設(shè)計，導(dǎo)致內(nèi)源基因的表達或抑制。因此，也可以通過在本發(fā)明啟動子之一的控制下表達合適的鋅指轉(zhuǎn)錄因子，獲得這些期望效果。本發(fā)明的表達盒也可以通過基因沉默，用于種子特異性抑制或減少靶基因的復(fù)制或/和翻譯。本發(fā)明的表達盒還可以被用于種子特異性地表達核酸，其中所述核酸介導(dǎo)所謂的反義效應(yīng)并由此能夠例如降低靶蛋白的表達。關(guān)于其阻抑是有利表型的條件的優(yōu)選基因和蛋白質(zhì)，包括例如，但不限于a)例如在TadaY等(1996)FEBSLett391(3):341-345或NakamuraR(1996)BiosciBiotechnolBiochem60(8):1215-1221中描述的變應(yīng)原蛋白的表達的降低；b)通過抑制負責α-1，6-葡糖苷鍵的分支酶Q來改變淀粉中直鏈淀粉/支鏈淀粉含量。相應(yīng)的程序已得到了描述(例如GP等(2000)NatBiotechnol18(5)551-554中)。優(yōu)選用于該目的的核酸序列為例如馬鈴薯淀粉分支酶II(GenBankAcc.No.AR123356；U.S.Pat.No.6,169,226)或來源于其它屬和種的該分支酶的同源物的核酸序列?！胺戳x”核酸主要是指，完全或部分地與所述的靶蛋白質(zhì)的有義鏈的至少部分互補的核酸序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道可以利用cDNA或相應(yīng)的基因作為構(gòu)建相應(yīng)反義構(gòu)建體的起始模板。優(yōu)選地，反義核酸與靶蛋白的編碼區(qū)或其部分互補。然而，反義核酸也可以與非編碼區(qū)或其部分互補。從靶蛋白的序列信息開始，反義核酸可以采用技術(shù)人員所熟悉的方式、考慮Watson和Crick堿基配對原則來設(shè)計。反義核酸可以與靶蛋白的核酸序列的全部或部分互補。在一個優(yōu)選的實施方案中，反義核酸為長度例如15、20、25、30、35、40、45或50個核苷酸的寡核苷酸。在一個優(yōu)選的實施方案中，反義核酸包括α-異頭物核酸分子。α-異頭物核酸分子與互補RNA形成特別是雙鏈雜交體，其中兩條鏈走向互相平行，這和正常的β單位是不同的(Gaultier等(1987)NucleicAcidsResl5:6625-6641)。本發(fā)明也涵蓋以有義方向利用以上所描述的序列，并且該應(yīng)用可以，如本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟悉的，產(chǎn)生共抑制。內(nèi)源基因的有義RNA的表達可以降低或關(guān)閉該基因的表達，這和反義方法中所描述的相似(Goring等(1991)ProcNatlAcadSciUSA88:1770-1774;Smith等(1990)MolGenGenet224:447-481；Napoli等(1990)PlantCell2:279-289；VanderKrol等(1990)PlantCell2:291-299)。所引入的構(gòu)建體也可以完全或僅部分地是待減少的基因。但不需要其能夠翻譯。同樣也非常優(yōu)選的是使用例如通過雙鏈RNA進行基因調(diào)控(雙鏈RNA干涉)的方法。相應(yīng)的程序為技術(shù)人員所知并已得到了詳細的描述(例如MatzkeMA等Q000)PlantMolBiol43:401-415；FireA.etal(1998)Nature391:806-811；WO99/32619；WO99/53050；W000/68374；WO00/44914；WO00/44895；WO00/49035；WO00/63364)。明確參考上述文獻中描述的程序和方法。在此可以通過同時導(dǎo)入正義鏈及互補鏈，實現(xiàn)天然基因的高效抑制?？梢圆⑶矣欣氖牵瑢⒎戳x策略和核酶方法相結(jié)合。核酶是有催化活性的RNA序列，它和反義序列結(jié)合，催化切割靶序列(TannerNK.FEMSMicrobiolRev.1999；23(3)257-75)。這可以提高反義策略的效率。用于減少特定蛋白質(zhì)的核酶的表達為技術(shù)人員所知并在例如EP-Al0291533，EP-Al0321201禾口EP-A10360257中得到了描述。合適的靴序列和核酶可以按Meinecke(Ribozymes，MethodsinCellBiology50,Galbraith等eds.AcademicPress,Inc.(1995),449-460)所描述的方法、通過計算核酶RNA和靶RNA的二級結(jié)構(gòu)以及它們之間的相互作用(BayleyCC等，PlantMolBiol.1992；18(2)353-361；LloydAMandDavisRW等，MolGenGenet.1994March；242(6):653-657)，而確定。應(yīng)該被提到的例子是錘頭核酶(HaselhoffandGerlach(1988)Nature334585-591)。優(yōu)選的核酶基于四膜蟲L-19IVSRNA的衍生物(U.S.Pat.No.4,987,071；U.S.Pat.No.5，116，742)?？梢赃x擇對L119mRNA具有選擇性的其它核酶(BartelDandSzostakJW(1993)Science261:1411-1418)。在再一實施方案中，靶蛋白質(zhì)的表達可以通過利用和靶蛋白質(zhì)基因的調(diào)控元件互補的核酸序列來降低，其中該核酸和調(diào)控元件形成一個三螺旋結(jié)構(gòu)從而阻止了基因的轉(zhuǎn)錄(HeleneC(1991)AnticancerDrugDes.6(6):569-84；HeleneC等(1992)AnnNYAcadSci660:27-36；MaherLJ(1992)Bioassays14(12):807-815)。本發(fā)明的表達盒和由此衍生的載體可以包含其它功能元件。術(shù)語“功能元件”應(yīng)作廣義理解，意指對本發(fā)明的表達盒或由此衍生的載體或生物體的產(chǎn)生、擴增或功能具有影響的所有元件?？梢蕴岬降睦影ǖ幌抻赼)報告基因或蛋白，它們編碼可以容易地定量的蛋白質(zhì)，并可以通過固有的顏色或酶活性來保證對轉(zhuǎn)化效率或表達的部位或時間的評價(SchenbornE，GroskreutzD(1999)MolBiotechnol13(1):2944)?？梢蕴岬降睦影ňG色熒光蛋白(GFP)(ChuiWL等，CurrBiol1996,6:325-330；LeffelSM等，Biotechniques.23(5):912_8，1997;Sheen等(1995)PlantJournal8(5):777-784;Haseloff等(1997)ProcNatlAcadSciUSA94(6):2122-2127;Reichel等(1996)ProcNatlAcadSciUSA93(12):5888-5893;Tian等(1997)PlantCellRep16:267-271;W097/41228)；氯霉素轉(zhuǎn)移酶(Fromm等(1985)ProcNatlAcadSciUSA82:5824-5828)；螢光素酶(Millar等(1992)PlantMolBiolR印10:3M_414;0w等(1986)kience，2；34856-859)，其允許對生物發(fā)光進行檢測；β-半乳糖苷酶，其編碼的酶可以作用于多種可得的顯色底物；β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)(Jefferson等(1987)EMBOJ6:3901-3907)或UidA基因，其編碼可以作用于多種顯色底物的酶；R-基因座基因產(chǎn)物蛋白質(zhì)，其可以調(diào)控植物組織中花色素苷色素(紅色)的產(chǎn)生，從而可以直接分析啟動子的活性而不需要添力口額夕卜的輔助劑或顯色底物(Dellaporta等，InChromosomeStructureandFunctionImpactofNewConcepts,18thStadlerGeneticsSymposium11:263-282,1988)；β-內(nèi)酰胺酶(Sutcliffe(1978)ProcNatlAcadSciUSA75:3737-3741)，其是可以作用于多種顯色底物(例如PADAC，一種顯色的頭孢菌素)的酶；xylE基因產(chǎn)物(^ikowsky等(1983)ProcNatlAcadSciUSA80:1101-1105)；兒茶酚雙加氧酶，其能轉(zhuǎn)化顯色的兒茶酚；α-淀粉酶(Ikuta等(1990)BiolTechnol.8=241-242)；酪氨酸酶(Katz等(1983)JGenMicrobiol1:2703-2714)，其是將酪氨酸氧化成DOPA和多巴醌(隨后形成可以容易地檢測的黑色素)的酶；水母發(fā)光蛋白(Prasher等(1985)BiochemBiophysResCommun126(3)=1259-1268)，其能用于鈣-敏感的生物發(fā)光檢測。b)復(fù)制起點，其確保本發(fā)明的表達盒或載體在例如大腸桿菌中擴增?？梢蕴岬降睦訛镺RI(DNA復(fù)制起點)、pBR322ori或P15Aori(Sambrook等MolecularCloning.ALaboratoryManual,2nded.ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.，1989)。c)通過其可以實現(xiàn)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的向植物細胞的轉(zhuǎn)移以及在植物基因組中的整合的元件，例如“邊界序列”，例如T-DNA的右或左邊界或vir區(qū)等。d)允許和利于一個或多個核酸序列插入的多克隆位點區(qū)(MCS)。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道獲取本發(fā)明表達盒的各種方法。本發(fā)明表達盒可以通過例如以下方法產(chǎn)生將一個本發(fā)明的表達控制序列與待表達的目的核酸序列融合，如果合適的話和編碼轉(zhuǎn)運肽的序列融合(優(yōu)選地該轉(zhuǎn)運肽編碼序列位于啟動子和相應(yīng)核酸序列之間)、以及和終止子或多聚腺苷酸化信號融合。常規(guī)的重組和克隆技術(shù)可用于該目的(如以上所描述)。類似地，還可以將待轉(zhuǎn)基因表達的核酸序列，例如通過同源重組，置于內(nèi)源的天然啟動子后面，從而產(chǎn)生本發(fā)明的表達盒，該表達盒可以控制該待轉(zhuǎn)基因表達的核酸序列的表達。原則上，本發(fā)明也涉及源自上述轉(zhuǎn)基因生物的細胞、細胞培養(yǎng)物、部分——在轉(zhuǎn)基因植物生物的情況下例如，根、葉、種子等——以及轉(zhuǎn)基因繁殖材料，例如種子或果實。能被人類和動物食用的本發(fā)明遺傳修飾植物也可以例如直接地或在以本身已知的方式加工后用作人類食物或動物食物。本發(fā)明的再一方面因此涉及上述本發(fā)明轉(zhuǎn)基因生物以及源自其的細胞、細胞培養(yǎng)物、部分——在轉(zhuǎn)基因植物生物的情況下例如，根、葉、種子等——以及轉(zhuǎn)基因繁殖材料例如種子或果實的用途，用于生產(chǎn)人類或動物的食物、藥品或精細化學品。還優(yōu)選的是在宿主生物體中重組生產(chǎn)藥品或精細化學品的方法，在該方法中，用上述的一個表達盒或載體轉(zhuǎn)化宿主生物(該表達盒包含一個或多個結(jié)構(gòu)基因，所述結(jié)構(gòu)基因編碼所需的精細化學品或催化所需的精細化學品的生物合成)，對轉(zhuǎn)化的宿主生物進行培養(yǎng)，和從培養(yǎng)基中提取所需的精細化學品。該方法可以廣泛應(yīng)用于各種精細化學品，例如酶、維生素、氨基酸、糖、脂肪酸、天然和合成的調(diào)味劑、芳化劑和色素。尤其優(yōu)選的是生育酚、生育三烯酚和類胡蘿卜素的產(chǎn)生?？梢杂眉夹g(shù)人員已知的方法對轉(zhuǎn)化的宿主生物進行培養(yǎng)、以及從宿主生物或培養(yǎng)基中進行分離。關(guān)于抗體或疫苗等藥品的產(chǎn)生，參見HoodEE,JilkaJM(1999).CurrOpinBiotechnol10(4)382-6；MaJK,VineND(1999).CurrTopMicrobiolImmunol236:275_92。本說明書所引用的所有參考文獻，就其全部公開內(nèi)容以及在本說明書中特別提到的公開內(nèi)容，而特此并入本文作為參考。圖UKG_Fragment86的序列(SEQIDNO10)圖2,62260557.f_ol3_lMaize的序列(SEQIDNO11)圖3、q-RT-PCR結(jié)果，顯示62260557.f_ol3_lMaize的全種子特異性表達。[根_dv授粉后5、15、30天(DAP，授粉后的天數(shù))的根的混合物；葉_加:5、15、30DAP的葉的混合物；穗5和IODAP的穗的混合物；全種子15、20、30DAP的全種子的混合物；胚乳15、20、30DAP的胚乳的混合物；胚15、20、30DAP的胚的混合物:V2和V4階段的根的混合物；枝條/葉_V2+V4:V2枝條和V4葉的混合物；花_GS花和萌發(fā)種子的混合物]圖4、KG_Fragment86的相應(yīng)CDS序列(SEQIDNO4)圖5、KG_Fragment86的相應(yīng)基因的推定蛋白質(zhì)的氨基酸序列(SEQIDNO5)圖6、AZM5_7833的序列(SEQIDNO:128)，它包含預(yù)測的CDS序列和上游啟動子區(qū)域。5’UTR(127bp)通過將基因組序列與玉米EST序列相比較來確定并顯示為斜體，預(yù)測的開放閱讀框以加下劃線表示，用于分離啟動子區(qū)域的引物以加粗表示。圖7、啟動子KG86(p_KG86)的序列(SEQIDNO1)圖8、載體RKF126的示意9、RKF126的序列(SEQIDNO56)圖10、使用RKFU6在轉(zhuǎn)基因玉米中由p_KG86驅(qū)動的⑶S在不同組織中在不同發(fā)育階段的表達圖ll、A)ZMls61973481的序列(SEQIDNO:57)，B)ZMls61221800的序列(SEQIDNO58)，以及C)ZMls62042561的序列(SEQIDNO59)圖12、q-RT_PCR結(jié)果，顯示MAWS42的全種子特異性表達。[根_dv授粉后5、15、30天(DAP)的根的混合物；葉_加授粉后5、15、30天的葉的混合物；穗授粉后5和10天的穗的混合物；全種子授粉后15、20、30天的全種子的混合物；胚乳授粉后15、20、30天的胚乳的混合物；胚授粉后15、20、30天的胚的混合物^_V2+V4:V2和V4階段的根的混合物；枝條/葉_V2+V4:V2枝條和V4葉的混合物；花_GS花和萌發(fā)種子的混合物]圖13、q-RT_PCR結(jié)果，顯示MAWS45的全種子特異性表達。[根_dv授粉后5、15、30天(DAP)的根的混合物；葉_加授粉后5、15、30天的葉的混合物；穗授粉后5和10天的穗的混合物；全種子授粉后15、20、30天的全種子的混合物；胚乳授粉后15、20、30天的胚乳的混合物；胚授粉后15、20、30天的胚的混合物^_V2+V4:V2和V4階段的根的混合物；枝條/葉_V2+V4:V2枝條和V4葉的混合物；花_GS花和萌發(fā)種子的混合物]圖14.MAWS42的相應(yīng)CDS序列(SEQIDNO6)圖15、MAWS42的相應(yīng)基因的ZmTIP3_l的氨基酸序列(SEQIDNO7)圖16.MAWS45的相應(yīng)CDS序列(SEQIDNO8)圖17、MAWS45的相應(yīng)基因的氫基酸序列(SEQIDNO9)圖18、AZM5_17960的序列(SEQIDNO70)以及AZM5_6324的序列(SEQIDNO71)，它們包含預(yù)測的CDS序列(ATG以加粗和下劃線表示)、預(yù)測的5，UTR(斜體)、以及額外的推定啟動子序列。5’UTR序列通過將基因組序列與玉米EST相比較來確定。圖19、啟動子MAWS42(p-MAWS42)的序列SEQIDNO:2以及啟動子MAWS45(p-MAWS45)的序列SEQIDNO3圖20、RTP1052的示意21、RTP1052的序列(SEQIDNO:116)圖22、RTP1057的示意23、RTP1057的序列(SEQIDNO:117)圖M、使用RTP1052在轉(zhuǎn)基因玉米中由p_MAWS42驅(qū)動的⑶S在不同組織在不同發(fā)育階段的表達圖25、使用RTP1057在轉(zhuǎn)基因玉米中由p_MAWS45驅(qū)動的⑶S在不同組織在不同發(fā)育階段的表達實施例現(xiàn)用以下實施例對本發(fā)明進行舉例說明，這些實施例不旨在以任何方式對本發(fā)明的范圍構(gòu)成限制。實施例1玉米全種子啟動子KG86的鑒定與驗證鑒定KG86的轉(zhuǎn)錄本采用商業(yè)提供的AFLP比較表達技術(shù)(KeygeneN.V.，P.0.Box216，6700AEffageningen,TheNetherlands)，對BASF制備的來自23個玉米組織的一系列RNA樣品，進行了玉米基因表達譜分析(表1)。命名為“KG_Fragment86”的231bp片段在被鑒定為具有全種子特異性表達的AFLP條帶中。KG_Fragment86的序列如圖1所示。權(quán)利要求1.一種多核苷酸，該多核苷酸包含表達控制序列，該表達控制序列允許可操作地與其連接的目的核酸在植物中種子特異性地表達，所述表達控制序列選自(a)具有SEQIDNOs:1至3之任一所示的核酸序列的表達控制序列；(b)具有與SEQIDNOs:1至3之任一所示的核酸序列至少80%相同的核酸序列的表達控制序列；(c)具有在嚴緊條件下與SEQIDNOs:1至3之任一所示的核酸序列雜交的核酸序列的表達控制序列；(d)具有與位于SEQIDNOs:4，6或8之任一所示的開放閱讀框序列上游的核酸序列雜交的核酸序列的表達控制序列；(e)具有與位于開放閱讀框序列上游的核酸序列雜交的核酸序列的表達控制序列，其中所述開放閱讀框序列編碼SEQIDNOs:5，7或9之任一所示的氫基酸序列；(f)具有與位于開放閱讀框序列上游的核酸序列雜交的核酸序列的表達控制序列，其中所述開放閱讀框序列與SEQIDNOs:4，6或8之任一所示的開放閱讀框序列至少80%相同，且其中該開放閱讀框編碼種子蛋白；(g)具有與位于開放閱讀框上游的核酸序列雜交的核酸序列的表達控制序列，其中所述開放閱讀框編碼與SEQIDNOs:5，7或9之任一所示的氨基酸序列至少80%相同的氨基酸序列，其中該開放閱讀框編碼種子蛋白；(h)表達控制序列，其可以自SEQIDNOs:4，6或8之任一所示的開放閱讀框序列的第一外顯子出發(fā)，在基因組DNA上，通過5‘基因組步行或熱不對稱交錯聚合酶鏈式反應(yīng)(TAIL-PCR)獲得；以及(i)表達控制序列，其可以自開放閱讀框序列的第一外顯子出發(fā)，在基因組DNA上，通過5'基因組步行或TAIL-PCR獲得，其中該開放閱讀框序列與SEQIDN0s:4，6或8之任一所示的開放閱讀框序列至少80%相同，且其中該開放閱讀框編碼種子蛋白；以及(j)表達控制序列，其可以自開放閱讀框序列的第一外顯子出發(fā)，在基因組DNA上，通過5'基因組步行或TAIL-PCR獲得，其中該開放閱讀框序列編碼與SEQIDN0s:5，7或9之任一所示的開放閱讀框編碼的氨基酸序列至少80%相同的氨基酸序列，且該開放閱讀框編碼種子蛋白。2.權(quán)利要求1的多核苷酸，其中所述多核苷酸還包含可操作地連接到表達控制序列上的至少一個目的核酸。3.權(quán)利要求1或2的多核苷酸，其中所述目的核酸與表達控制序列異源。4.權(quán)利要求1至3的任何一項的多核苷酸，其中所述多核苷酸還包含編碼金屬硫蛋白1多肽的植物基因的第一內(nèi)含子。5.包含權(quán)利要求1至4的任何一項的多核苷酸的載體。6.權(quán)利要求5的載體，其中所述的載體為T-DNA載體。7.包含權(quán)利要求1至4的任何一項的多核苷酸或權(quán)利要求5或6的載體的宿主細胞。8.權(quán)利要求7的宿主細胞，其中所述的宿主細胞為植物細胞。9.包含權(quán)利要求1至4的任何一項的多核苷酸或權(quán)利要求5或6的載體的轉(zhuǎn)基因植物或植物種子。10.權(quán)利要求9的轉(zhuǎn)基因植物或植物種子，其中所述轉(zhuǎn)基因植物或植物種子為單子葉植物或單子葉植物的植物種子。11.在宿主細胞中表達目的核酸的方法，包括(a)將權(quán)利要求1至4的任何一項的多核苷酸或權(quán)利要求5或6的載體導(dǎo)入到宿主細胞中；以及(b)在所述的宿主細胞中表達至少一個目的核酸。12.權(quán)利要求11的方法，其中所述的宿主細胞是植物細胞。13.在植物或其種子中表達目的核酸的方法，包括(a)將權(quán)利要求1至4的任何一項的多核苷酸或權(quán)利要求5或6的載體導(dǎo)入到所述植物或其種子中；以及(b)在所述植物或其種子中表達至少一個目的核酸。14.權(quán)利要求13的方法，其中所述的植物為單子葉植物。15.權(quán)利要求1至4的任何一項的多核苷酸、權(quán)利要求5或6的載體、權(quán)利要求7或8的宿主細胞、或權(quán)利要求9或10的植物或其種子用于表達目的核酸的用途。全文摘要本發(fā)明涉及提供用于基因表達的手段和方法。具體來說，本發(fā)明涉及一種多核苷酸，該多核苷酸包含表達控制序列，該表達控制序列允許與其可操作地連接的目的核酸在植物中種子特異性表達。此外，本發(fā)明還提供基于所述多核苷酸的載體、宿主細胞、轉(zhuǎn)基因植物和表達目的核酸的方法。文檔編號C12N15/82GK102575257SQ201080017714公開日2012年7月11日申請日期2010年4月22日優(yōu)先權(quán)日2009年4月22日發(fā)明者H·付,H-S·宋,J·A·布朗,K·弗朗西斯申請人:巴斯夫植物科學有限公司