專利名稱：用于生物質發(fā)酵的組合物和方法
用于生物質發(fā)酵的組合物和方法相關申請的交叉引用本申請要求2009年4月20日提交的美國臨時專利申請序號61/171，077 ;2009年4月22日提交的61/171，831 ;和2009年6月29日提交的61/221，519的優(yōu)先權，其在此通過引用整體并入。
背景技術：
本發(fā)明涉及通過同時水解和發(fā)酵糖和寡聚物從生物質制備有用的發(fā)酵終產物。本發(fā)明還涉及發(fā)展用于有效預處理和以高轉化效率(產率)轉化木質纖維素生物質成終產物的方法。 各種形式的生物質由于其大量可用性和低成本而具有作為乙醇制備的可再生原料的潛力。然而，依然存在對利用可用于產生發(fā)酵終產物例如乙醇和其他化合物或生物燃料的原料的低成本的強大方法的未滿足的需求。生物質發(fā)酵產生生物燃料例如醇(例如甲醇、乙醇、丁醇或丙醇)可以提供對世界能源問題的急需解決方案。木質纖維素生物質具有纖維素和半纖維素兩種主要組分。這些組分的水解產生己糖(C6)和戊糖(C5)。生物質轉化效率高度依賴于可被用于生物質到燃料轉化過程的生物體利用的碳水化合物范圍。具體說，不能利用己糖(例如纖維素二糖、葡萄糖)和戊糖(例如阿拉伯糖、木糖)二者來轉化成乙醇可能極大限制可從給定量生物質產生的生物燃料或其他化學品的總量。因此，為了獲得木質纖維素生物質到乙醇的高轉化效率(產率)，重要的是能夠成功將己糖和戊糖二者發(fā)酵成乙醇。然而，戊糖(木糖和阿拉伯糖)的發(fā)酵依然是從生物質制備乙醇的技術瓶頸。該限制可以導致低效率、發(fā)酵反應中低最大可實現的生物燃料滴度和低生物燃料制備率的乙醇制備。而且，生物質中碳水化合物含量的大部分可能通過預處理過程中戊糖的溶解而損失。一般而言，較低的產率和低生產率導致較高的生產成本，這可以轉化為不可能被微生物的其他特征所抵消的競爭缺點。發(fā)明概述一方面，本發(fā)明提供了通過用第一微生物發(fā)酵包含己糖和戊糖的木質纖維素生物質來制備一種或多種發(fā)酵終產物的方法，其中所述第一微生物同時水解和發(fā)酵所述木質纖維素生物質以產生發(fā)酵終產物。在一個實施方案中，發(fā)酵終產物的至少一種是乙醇，并且其中乙醇以至少約45g/L的滴度被制備。在另一個實施方案中，所述第一微生物是梭狀芽胞桿菌屬菌株。在另一個實施方案中，所述梭狀芽胞桿菌屬菌株是植物發(fā)酵梭狀芽胞桿菌(Clostridium phytofermentans)。在另一個實施方案中，所述方法還包括使用第二微生物發(fā)酵己糖和戊糖。在另一個實施方案中，所述第二微生物是釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、熱梭狀芽胞桿菌(C. thermocellum)、丙麗丁醇梭狀芽胞桿菌(C. acetobutylicum)、曬纖維梭狀芽胞桿菌(C. cellovorans)或運動發(fā)酵單胞菌(Zymomonas mobilis)。在另一個實施方案中，所述己糖包括選自由纖維素、半纖維素、淀粉、甘露聚糖、果糖、葡萄糖、半乳糖、鼠李糖和甘露糖組成的組的碳水化合物。在另一個實施方案中，所述戊糖包括選自由木聚糖、半纖維素、木糖和阿拉伯糖組成的組的碳水化合物。在另一個實施方案中，所述植物發(fā)酵梭狀芽胞桿菌是非重組或重組微生物。在另一個實施方案中，所述植物發(fā)酵梭狀芽胞桿菌包括一種或多種異源多核苷酸。在另一個實施方案中，在所述第一微生物生長過程中向培養(yǎng)基添加一種或多種包括己糖或戊糖的培養(yǎng)基補充物。在另一個實施方案中，所述己糖或戊糖相對于被所述第一微生物轉化為其他化合物的糖量來添加。在另一個實施方案中，所述方法還包括預處理所述生物質。在另一個實施方案中，所述預處理包括蒸汽爆發(fā)或熱水浸提、暴露于酸或堿條件。在另一個實施方案中，所述方法包括添加發(fā)酵培養(yǎng)基補充物，其中所述發(fā)酵培養(yǎng)基補充物是脂肪酸、表面活性劑、螯合劑、微生物、礦物質、PH調節(jié)劑、酵母提取物和鹽。在另一個實施方案中，所述第一微生物同時發(fā)酵所述己糖和戊糖。在另一個實施方案中，所述方法包括添加一種或多種酶，其中所述一種或多種酶不是衍生自第一微生物。在另一個實施方案中，所述一種或多種酶是纖維素酶、半纖維素酶、半乳糖醛酸酶、果膠酸裂合酶、糖酶、木聚糖酶、葡聚糖酶、和內切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、葡糖苷酶、淀粉酶、肌醇六磷酸酶或漆酶。在另一個實施方案中，所述己糖和戊糖包括麥芽糖漿、玉米浸潰液體、蒸餾干燥顆?；蛴衩捉⒐腆w。在另一個實施方 案中，所述方法還包括批量添加生物質固體的生物質補料分批發(fā)酵。在另一個實施方案中，所述生物質固體使用濾網回收。在另一個實施方案中，所述濾網包括多個直徑約150-250微米的孔。另一方面，本發(fā)明公開了通過在包含木質纖維素生物質的培養(yǎng)基中培養(yǎng)植物發(fā)酵梭狀芽胞桿菌菌株而制備的生物燃料產物；其中所述植物發(fā)酵梭狀芽胞桿菌同時水解和發(fā)酵所述木質纖維素生物質。另一方面，本發(fā)明公開了制備乙醇的方法，所述方法包括以下步驟在包含木質纖維素生物質的培養(yǎng)基中培養(yǎng)植物發(fā)酵梭狀芽胞桿菌菌株；其中所述植物發(fā)酵梭狀芽胞桿菌同時水解和發(fā)酵所述木質纖維素生物質；以大于約45g/L的產率制備乙醇。在一個實施方案中，所述方法還包括在所述植物發(fā)酵梭狀芽胞桿菌的生長過程中向培養(yǎng)基添加一種或多種培養(yǎng)基補充物，其中所述培養(yǎng)基補充物的一種或多種包含一種或多種己糖和/或戊糖化合物，并且一種或多種糖化合物相對于被所述植物發(fā)酵梭狀芽胞桿菌轉化為其他化合物的糖量來添加。另一方面，本發(fā)明公開了用于制備發(fā)酵終產物的系統(tǒng)，包括發(fā)酵容器；木質纖維素生物質；和同時水解和發(fā)酵所述木質纖維素生物質的第一微生物；其中所述發(fā)酵容器適于提供適合同時水解和發(fā)酵所述木質纖維素生物質的條件。在一個實施方案中，還包括包含己糖和戊糖的培養(yǎng)基補充物。在另一個實施方案中，所述第一微生物是梭狀芽胞桿菌屬菌株。在另一個實施方案中，所述梭狀芽胞桿菌屬菌株是植物發(fā)酵梭狀芽胞桿菌。在另一個實施方案中，所述植物發(fā)酵梭狀芽胞桿菌包括一種或多種異源多核苷酸。在另一個實施方案中，所述生物質在與所述第一微生物接觸之前通過蒸汽爆發(fā)或熱水浸提、暴露于酸或堿條件來預處理。在另一個實施方案中，經預處理的生物質進一步用非衍生自所述第一微生物的一種或多種酶處理。在另一個實施方案中，所述己糖和戊糖包括玉米浸潰固體、玉米浸潰液體、麥芽糖漿、木聚糖、纖維素、半纖維素、果糖、葡萄糖、甘露糖、鼠李糖或木糖的一種或多種。在另一個實施方案中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基還包括非衍生自所述第一微生物的一種或多種酶。在另一個實施方案中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基還包括選自由脂肪酸、表面活性劑、螯合齊U、維生素、礦物質、PH調節(jié)劑、酵母提取物和鹽組成的組的發(fā)酵培養(yǎng)基補充物。在另一個實施方案中，所述系統(tǒng)還包括第二微生物。在另一個實施方案中，所述第二微生物是釀酒酵母、熱梭狀芽胞桿菌、丙酮丁醇梭狀芽胞桿菌、噬纖維梭狀芽胞桿菌或運動發(fā)酵單胞菌。附圖簡述本發(fā)明的新特征在所附權利要求書中精確提出。通過參考提出其中利用本發(fā)明原理的示例性實施方案的下文詳述和附圖將獲得對本發(fā)明特征和優(yōu)點的更好理解，附圖中圖I描繪了在約15天的時段內加入發(fā)酵反應的處理的生物質固體的累積總量。圖2是描繪通過根據本文描述的尺寸減少和堿處理的玉米秸桿生物質的碳水化合物組成的餅形圖。圖3A-3B描繪在指示時間點發(fā)酵反應的糖和乙醇濃度曲線。圖3A描繪了同時發(fā)酵纖維素二糖和木糖的糖和乙醇濃度曲線。圖3B描繪同時發(fā)酵葡萄糖和木糖的糖和乙醇濃度曲線。 圖4描繪了在指示時間點發(fā)酵反應中指示的己糖(葡萄糖，纖維素二糖)和戊糖(木糖)的標準化攝取和利用。圖5描繪了在指示的時間點木糖、纖維素二糖和淀粉同時發(fā)酵為乙醇的糖和乙醇濃度曲線。圖6描繪了在指示的時間點葡萄糖、木糖和阿拉伯糖同時發(fā)酵為乙醇的糖和乙醇濃度曲線。圖7描繪了同時發(fā)酵淀粉、纖維素、木聚糖和纖維素二糖的乙醇濃度曲線。圖8描繪了通過首先用酸在升高的溫度和壓力下在水解設備中處理生物質而從生物質產生發(fā)酵終產物的方法。圖9描繪了通過將生物質裝入發(fā)酵容器而從生物質產生發(fā)酵終產物的方法。

圖10公開了產生己糖或戊糖或寡聚體的預處理，其然后不經加工或進一步加工并單獨或一起發(fā)酵。圖11是用于轉化植物發(fā)酵梭狀芽胞桿菌的質粒pIMPT1029的圖譜。通過引用并入本說明書提及的所有出版物、專利和專利申請在此通過引用并入，如同每個單獨的出版物、專利或專利申請被明確且單獨地指明通過引用并入。發(fā)明詳述以下描述和實例詳細地示例說明本發(fā)明的實施方案。本領域技術人員將發(fā)現有許多涵蓋在其范圍內的本發(fā)明的變體和修飾。因此，優(yōu)選實施方案的描述不應被認為限制本發(fā)明的范圍。定義除非不同地表征，本文使用的技術和科學術語具有與本發(fā)明所屬領域普通技術人員通常理解的相同的含義。術語“約”相對于參考數值包括該值的加或減15%。例如，量“約10”包括8. 5至11.5的量。本文使用的術語"燃料”或“生物燃料”具有本領域技術人員已知的普通含義，并且可以包括一種或多種適合作為液體燃料、氣體燃料、反應物、化學原料的一種或多種化合物，包括但不限于烴、氫、甲烷、生物柴油、羥基化合物，例如醇(例如乙醇、丁醇、丙醇、甲醇、等等)和羰基化合物例如醛和酮(例如，丙酮、甲醛、I-丙醛、等等)。本文使用的術語“發(fā)酵終產物”或“終產物”具有其本領域技術人員已知的普通含義，并且可以包括一種或多種生物燃料、化學添加劑、加工輔劑、食物添加劑、有機酸(例如乙酸、乳酸、甲酸、檸檬酸等)、有機酸的衍生物例如酯(例如蠟酯、甘油酯、等等)和其他功能化合物，包括但不限于I，2-丙二醇、I，3-丙二醇、乳酸、甲酸、乙酸、琥珀酸、丙酮酸、酶例如纖維素酶、多糖酶、脂肪酶、蛋白酶、木質酶和半纖維素酶，并且可以作為純化合物、混合物、或不純或稀釋形式存在。發(fā)酵終產物的其他實例包括但不限于1，4_ 二酸(琥珀酸、富馬酸和蘋果酸)、2，5呋喃二羧酸、3羥基丙酸、天冬氨酸、葡糖二酸、谷氨酸、衣康酸、乙酰丙酸、3-羥基丁內酯、甘油、山梨糖醇、木糖醇/阿拉伯糖醇、丁二醇、丁醇、甲烷、甲醇、乙烷、乙烯、乙醇、η-丙烷、I-丙烯、I-丙醇、丙醛、丙酮、丙酸、η- 丁烷、I- 丁烯、I- 丁醇、丁醛、丁酸、異丁醛、異丁醇、2-甲基丁醛、2-甲基丁醇、3-甲基丁醛、3-甲基丁醇、2- 丁烯、2-丁醇、2- 丁酮、2，3- 丁二醇、3-羥基-2- 丁酮、2，3- 丁二酮、乙苯、乙烯苯、2-苯基乙醇、苯乙醒、I-苯基丁燒、4-苯基_1- 丁稀、4-苯基-2- 丁稀、I-苯基-2- 丁稀、I-苯基-2- 丁醇、 4-苯基-2- 丁醇、I-苯基-2- 丁酮、4-苯基-2- 丁酮、I-苯基-2，3- 丁二醇、I-苯基_3_羥基-2- 丁酮、4-苯基-3-羥基-2- 丁酮、I-苯基-2，3- 丁二酮、η-戊烷、乙基苯酚、乙烯基苯酹、2-(4-輕基苯基)乙醇、4-輕基苯基乙醒、1-(4-輕基苯基)丁燒、4-(4-輕基苯基)-I- 丁烯、4- (4-羥基苯基)-2- 丁烯、I- (4-羥基苯基)-I-丁烯、I- (4-羥基苯基)_2_ 丁醇、4-(4-羥基苯基)-2-丁醇、1-(4-羥基苯基)-2-丁酮、4-(4-羥基苯基)-2-丁酮、I-(4-羥基苯基)-2，3- 丁二醇、I- (4-羥基苯基)-3-羥基-2- 丁酮、4- (4-羥基苯基)-3-羥基-2- 丁酮、1-(4-羥基苯基)-2，3- 丁二酮、卩引哚基乙烷、卩引哚基乙烯、2-(吲哚-3-)乙醇、η-戊烷、I-戊烯、I-戊醇、戊醛、戊酸、2-戊烯、2-戊醇、3-戊醇、2-戊酮、3-戊酮、4-甲基戊醛、4-甲基戊醇、2，3-戊二醇、2-羥基-3-戊酮、3-羥基-2-戊酮、2，3-戊二酮、2-甲基戊烷、4-甲基-I-戊烯、4-甲基-2-戊烯、4-甲基-3-戊烯、4-甲基-2-戊醇、2-甲基-3-戊醇、4-甲基-2-戊酮、2-甲基-3-戊酮、4-甲基-2，3-戊二醇、4-甲基-2-羥基-3-戊酮、4-甲基-3-羥基-2-戊酮、4-甲基-2，3-戊二酮、I-苯基戊烷、I-苯基_1_戊烯、I-苯基-2-戊烯、I-苯基-3-戊烯、I-苯基-2-戊醇、I-苯基-3-戊醇、I-苯基-2-戊酮、I-苯基-3-戊酮、I-苯基_2，3-戊二醇、I-苯基-2-羥基-3-戊酮、I-苯基-3-羥基-2-戊酮、I-苯基-2，3-戊二酮、4-甲基-I-苯基戊烷、4-甲基-I-苯基-I-戊烯、4-甲基-I-苯基-2-戊烯、4-甲基-I-苯基-3-戊烯、4-甲基-I-苯基-3-戊醇、4-甲基-I-苯基-2-戊醇、4-甲基-I-苯基-3-戊酮、4-甲基-I-苯基-2-戊酮、4-甲基-I-苯基-2，3-戊二醇、4-甲基-I-苯基-2，3-戊二酮、4-甲基-I-苯基-3-羥基-2-戊酮、4-甲基-I-苯基-2-羥基-3-戊酮、I- (4-羥基苯基)戊烷、I-(4-羥基苯基)-I-戊烯、I- (4-羥基苯基)-2-戊烯、I-(4-羥基苯基)-3-戊烯、I- (4-羥基苯基)-2-戊醇、I- (4-羥基苯基)-3-戊醇、I- (4-羥基苯基)-2-戊酮、1-(4-羥基苯基)-3-戊酮、1-(4-羥基苯基)-2，3-戊二醇、1_(4_羥基苯基)-2-羥基-3-戊酮、1-(4-羥基苯基)-3-羥基-2-戊酮、1-(4-羥基苯基)-2，
3-戊二酮、4-甲基-1-(4-羥基苯基)戊烷、4-甲基-1-(4-羥基苯基)-2-戊烯、4-甲基-1-(4-羥基苯基)-3-戊烯、4-甲基-1-(4-羥基苯基)-I-戊烯、4-甲基-1-(4-羥基苯基)-3_戊醇、4-甲基-I-(4-羥基苯基)-2-戊醇、4-甲基-I-(4-羥基苯基)-3-戊酮、4-甲基-I- (4-羥基苯基)-2-戊酮、4-甲基-I- (4-羥基苯基)-2，3-戊二醇、4-甲基-I- (4-羥基苯基)-2，3-戊二酮、4-甲基-I-(4-羥基苯基)-3-羥基-2-戊酮、4-甲基_1_(4_羥基苯基)-2-羥基-3-戊酮、I-吲哚-3-戊烷、I-(吲哚-3)-I-戊烯、I-(吲哚-3)-2-戊烯、I-(吲哚-3) -3-戊烯、I-(吲哚-3) -2-戊醇、I-(吲哚-3) -3-戊醇、I-(吲哚_3) -2-戊酮、1-(吲哚-3)-3-戊酮、1_(吲哚-3)-2，3-戊二醇、I-(吲哚-3)-2-羥基_3_戊酮、1_(吲哚-3)-3-羥基-2-戊酮、1-(吲哚-3)-2，3-戊二酮、4-甲基_1_(吲哚_3_)戊烷、4-甲基-1-(吲哚-3)-2-戊烯、4-甲基-1-(吲哚-3)-3-戊烯、4-甲基_1_ (吲哚_3)-I-戊烯、4-甲基-2-(吲哚-3) -3-戊醇、4-甲基-I-(吲哚-3) -2-戊醇、4-甲基-I-(吲哚-3) -3-戊酮、4-甲基-1-(吲哚-3)-2-戊酮、4-甲基-1-(吲哚-3)-2，3-戊二醇、4-甲基_1_(吲哚-3) -2，3-戊二酮、4-甲基-I-(吲哚-3) -3-羥基-2-戊酮、4-甲基-I-(吲哚-3) -2-羥基-3-戊酮、η-己烷、I-己烯、I-己醇、己醛、己酸、2-己烯、3-己烯、2-己醇、3-己醇、2- 己酮、3-己酮、2，3-己二醇、2，3-己二酮、3，4-己二醇、3，4_己二酮、2-羥基-3-己酮、3-羥基-2-己酮、3-羥基-4-己酮、4-羥基-3-己酮、2-甲基己燒、3-甲基己燒、2-甲基-2-己稀、2-甲基-3-己稀、5-甲基-I-己稀、5-甲基_2_己稀、4-甲基-I-己稀、4-甲基_2_己稀、3-甲基-3-己稀、3-甲基_2_己稀、3-甲基-I-己稀、2-甲基-3-己醇、5-甲基_2_己醇、5-甲基-3-己醇、2-甲基-3-己酮、5-甲基-2-己酮、5-甲基-3-己酮、2-甲基_3，4_己二醇、2-甲基-3，4-己二酮、5-甲基-2，3-己二醇、5-甲基-2，3-己二酮、4-甲基_2，3-己二醇、4-甲基-2，3-己二酮、2-甲基-3-輕基-4-己酮、2-甲基-4-輕基-3-己酮、5-甲基-2-羥基-3-己酮、5-甲基-3-羥基-2-己酮、4-甲基-2-羥基-3-己酮、4-甲基-3-羥基-2-己麗、2，5_ 二甲基己焼、2，5_ 二甲基-2-己稀、2，5_ 二甲基-3-己稀、2，5- 二甲基-3-己醇、2，5- 二甲基-3-己酮、2，5- 二甲基-3，4-己二醇、2，5- 二甲基-3，4-己二酮、2，5-二甲基-3-羥基-4-己酮、5-甲基-I-苯基己烷、4-甲基-I-苯基己烷、5-甲基_1_苯基-I-己烯、5-甲基-I-苯基-2-己烯、5-甲基-I-苯基-3-己烯、4-甲基-I-苯基-I-己烯、4-甲基-I-苯基-2-己烯、4-甲基-I-苯基-3-己烯、5-甲基-I-苯基-2-己醇、5-甲基-I-苯基-3-己醇、4_甲基-I-苯基-2-己醇、4_甲基-I-苯基-3-己醇、5_甲基-I-苯基_2_己麗、5_甲基-I-苯基-3-己麗、4_甲基-I-苯基_2_己麗、4_甲基-I-苯基-3-己麗、5_甲基-I-苯基-2，3-己二醇、4_甲基-I-苯基-2，3-己二醇、5-甲基-I-苯基-3-輕基_2_己麗、5_甲基-I-苯基_2_輕基-3-己麗、4_甲基-I-苯基-3-輕基-2-己麗、4-甲基-I-苯基-2-輕基-3-己酮、5-甲基-I-苯基-2，3-己二酮、4-甲基-I-苯基-2，3-己二酮、4-甲基-1-(4-羥基苯基)己烷、5-甲基-1-(4-羥基苯基)-1-己烯、5-甲基-1-(4-羥基苯基)-2_己烯、5-甲基-1-(4- 基苯基)-3_己烯、4-甲基-1-(4- 基苯基)-1_己烯、4-甲基-I-(4-羥基苯基)-2-己烯、4-甲基-1-(4-羥基苯基)-3-己烯、5-甲基-1-(4-羥基苯基)-2-己醇、5-甲基-I-(4-羥基苯基)-3-己醇、4-甲基-I-(4-羥基苯基)_2_己醇、4-甲基-I-(4-羥基苯基)-3-己醇、5-甲基-1-(4-羥基苯基)-2-己酮、5-甲基-1-(4-羥基苯基)-3_己酮、4-甲基-1-(4-輕基苯基)-2_己酮、4-甲基-1-(4-輕基苯基)-3_己酮、5-甲基-I-(4-羥基苯基)-2，3-己二醇、4-甲基-I-(4-羥基苯基)-2，3-己二醇、5-甲基-1-(4-輕基苯基)-3_輕基-2-己酮、5-甲基-1-(4-輕基苯基)-2_輕基-3-己酮、4-甲基-1-(4-羥基苯基)-3-羥基-2-己酮、4-甲基-1-(4-羥基苯基)-2-羥基-3-己酮、5-甲基-I-(4-羥基苯基)-2，3-己二酮、4-甲基-1-(4-羥基苯基)-2，3_己二酮、4-甲基-I-(吲哚-3-)己烷、5-甲基-I-(吲哚-3)-I-己烯、5-甲基-I-(吲哚-3) -2-己烯、5-甲基-1-(吲哚-3)-3-己烯、4-甲基-1-(吲哚-3)-I-己烯、4-甲基-1-(吲哚-3)-2-己烯、
4-甲基-I-(吲哚-3) -3-己烯、5-甲基-I-(吲哚-3) -2-己醇、5-甲基-I-(吲哚-3) -3-己醇、4-甲基-1-(吲哚-3)-2-己醇、4-甲基-1-(吲哚-3)-3-己醇、5-甲基_1_(吲哚-3)-2-己酮、5-甲基-1-(吲哚-3)-3-己酮、4-甲基-1-(吲哚-3)-2-己酮、4-甲基-1-(吲哚-3)-3-己酮、5-甲基-1-(吲哚-3)-2，3-己二醇、4-甲基-I-(吲哚_3)-2，3-己二醇、5-甲基-1-(吲哚-3)-3-羥基-2-己酮、5-甲基-1-(吲哚-3)-2-羥基-3-己酮、4-甲基-I-(吲哚-3) -3-羥基-2-己酮、4-甲基-I-(吲哚-3) -2-羥基-3-己酮、5-甲基-I-(吲哚-3) -2，3-己二酮、4-甲基-I-(吲哚-3) -2，3-己二酮、η-庚烷、I-庚烯、I-庚醇、庚醛、庚酸、2-庚烯、3-庚烯、2-庚醇、3-庚醇、4-庚醇、2-庚酮、3-庚酮、4-庚酮、2，3- 庚二醇、2，3_庚二酮、3，4_庚二醇、3，4_庚二酮、2-羥基-3-庚酮、3-羥基-2-庚酮、3-羥基-4-庚酮、4-羥基-3-庚酮、2-甲基庚烷、3-甲基庚烷、6-甲基-2-庚烯、6-甲基-3-庚稀、2_甲基-3-庚稀、2_甲基-2-庚稀、5_甲基-2-庚稀、5_甲基-3-庚稀、3-甲基-3-庚烯、2-甲基-3-庚醇、2-甲基-4-庚醇、6-甲基-3-庚醇、5-甲基-3-庚醇、3-甲基-4-庚醇、2-甲基-3-庚酮、2-甲基-4-庚酮、6-甲基-3-庚酮、5-甲基-3-庚酮、3-甲基-4-庚酮、2-甲基-3，4-庚二醇、2-甲基-3，4-庚二酮、6-甲基_3，4-庚二醇、6-甲基_3，4_庚二酮、5-甲基_3，4-庚二醇、5-甲基_3，4-庚二酮、2-甲基-3-羥基_4_庚酮、2-甲基_4_羥基-3-庚酮、6-甲基-3-羥基-4-庚酮、6-甲基-4-羥基-3-庚酮、5-甲基-3-羥基-4-庚酮、5-甲基-4-羥基-3-庚酮、2，6_ 二甲基庚烷、2，5- 二甲基庚烷、2，6_ 二甲基-2-庚烯、2,6_ 二甲基_3_庚稀、2, 5_ 二甲基_2_庚稀、2, 5_ 二甲基-3-庚稀、3,6- 二甲基-3-庚稀、2，6-二甲基-3-庚醇、2，6-二甲基-4-庚醇、2，5-二甲基-3-庚醇、2，5-二甲基-4-庚醇、2，6-二甲基-3，4-庚二醇、2，6-二甲基-3，4-庚二酮、2，5-二甲基-3，4-庚二醇、2，5-二甲基-3，4-庚二酮、2，6- 二甲基-3-羥基-4-庚酮、2，6- 二甲基-4-羥基-3-庚酮、2，5- 二甲基-3-羥基-4-庚酮、2，5- 二甲基-4-羥基-3-庚酮、η-辛烷、I-辛烯、2-辛烯、I-辛醇、辛醛、辛酸、3-辛烯、4-辛烯、4-辛醇、4-辛酮、4，5-辛二醇、4，5-辛二酮、4-羥基-5-辛酮、2-甲基辛烷、2-甲基-3-辛烯、2-甲基-4-辛烯、7-甲基-3-辛烯、3-甲基-3-辛烯、
3-甲基-4-辛烯、6-甲基-3-辛烯、2-甲基-4-辛醇、7-甲基-4-辛醇、3-甲基-4-辛醇、
6-甲基-4-辛醇、2-甲基-4-辛酮、7-甲基-4-辛酮、3-甲基-4-辛酮、6-甲基-4-辛酮、2-甲基-4，5-辛二醇、2-甲基-4，5-辛二酮、3-甲基-4，5-辛二醇、3-甲基-4，5-辛二酮、2-甲基-4-羥基-5-辛酮、2-甲基-5-羥基-4-辛酮、3-甲基_4_羥基-5-辛酮、3-甲基_5_輕基_4_羊麗、2,7_ 二甲基羊燒、2,7_ 二甲基-3-羊稀、2,7_ 二甲基-4-羊稀、2,
7-二甲基-4-辛醇、2，7-二甲基-4-辛酮、2，7-二甲基-4，5-辛二醇、2，7-二甲基-4，5-辛二酮、2，7- 二甲基-4-羥基-5-辛酮、2，6- 二甲基辛烷、2，6- 二甲基-3-辛烯、2，6- 二甲基-4-辛烯、3，7- 二甲基-3-辛烯、2，6- 二甲基-4-辛醇、3，7- 二甲基-4-辛醇、2，6- 二甲基-4-辛酮、3，7-二甲基-4-辛酮、2，6-二甲基-4，5-辛二醇、2，6-二甲基-4，5-辛二酮、2，6-二甲基-4-羥基-5-辛酮、2，6-二甲基-5-羥基-4-辛酮、3，6-二甲基辛烷、3，6-二甲基-3-辛烯、3，6-二甲基-4-辛烯、3，6-二甲基-4-辛醇、3，6-二甲基-4-辛酮、3，6- 二甲基-4，5-辛二醇、3，6- 二甲基-4，5-辛二酮、3，6- 二甲基-4-羥基-5-辛酮、η-壬烷、I-壬烯、I-壬醇、壬醛、壬酸、2-甲基壬烷、2-甲基-4-壬烯、2-甲基-5-壬烯、8-甲基-4-壬烯、2-甲基-5-壬醇、8-甲基-4-壬醇、2-甲基-5-壬酮、8-甲基-4-壬酮、8-甲基_4，5-壬二醇、8-甲基-4，5-壬二酮、8-甲基-4-羥基-5-壬酮、8-甲基-5-羥基-4-壬麗、2,8_ _.甲基壬燒、2,8_ _■甲基-3_壬稀、2,8_ _■甲基-4_壬稀、2,8- _■甲基-5_壬稀、2，8-二甲基-4-壬醇、2，8-二甲基-5-壬醇、2，8-二甲基-4-壬酮、2，8-二甲基-5-壬酮、2，8-二甲基-4，5-壬二醇、2，8-二甲基-4，5-壬二酮、2，8-二甲基-4-羥基-5-壬酮、2，
8-二甲基-5-羥基-4-壬酮、2，7-二甲基壬烷、3，8-二甲基-3-壬烯、3，8-二甲基-4-壬烯、3，8-二甲基-5-壬烯、3，8-二甲基-4-壬醇、3，8-二甲基-5-壬醇、3，8-二甲基-4-壬酮、3，8-二甲基-5-壬酮、3，8-二甲基-4，5-壬二醇、3，8-二甲基-4，5-壬二酮、3，8-二甲基-4-羥基-5-壬酮、3，8- 二甲基-5-羥基-4-壬酮、η-癸烷、I-癸烯、I-癸醇、癸酸、2，
9-二甲基癸烷、2，9-二甲基-3-癸烯、2，9-二甲基-4-癸烯、2，9-二甲基-5-癸醇、2，9-二甲基-5-癸酮、2，9- 二甲基-5，6-癸二醇、2，9- 二甲基-6-羥基-5-癸酮、2，9- 二甲基-5，6-癸二酮、η- -| 燒、I- -\ 烯、I- -\ 醇、i 醒、i 酸、η-十二燒、I-十二烯、I-十二 醇、十二醛、十二酸、η-十二烷、I-十二烯、I-十二醇、十二醛、十二酸、η-十三烷、I-十三烯、I-十三醇、十三醛、十三酸、η-十四烷、I-十四烯、I-十四醇、十四醛、十四酸、η-十五烷、I-十五烯、I-十五醇、十五醛、十五酸、η-十六烷、I-十六烯、I-十六醇、十六醛、十六酸、η-十七烷、I-十七烯、I-十七醇、十七醛、十七酸、η-十八烷、I-十八烯、I-十八醇、十八醒、十八酸、η-十九燒、I-十九烯、I-十九醇、十九醒、十九酸、二十燒、I- 二十烯、I- 二十醇、二十醛、二十酸、3-羥基丙醛、1，3-丙二醇、4-羥基丁醛、1，4- 丁二醇、3-羥基-2- 丁酮、2，3_ 丁二醇、1，5_戊二醇、高檸檬酸、高異檸檬酸、b-羥基己二酸、戊二酸、戊二酸半醛、戊二醛、2-羥基-I-環(huán)戊酮、1，2_環(huán)戊二醇、環(huán)戊酮、環(huán)戊醇、(S)-2-乙酰乳酸、(R)-2，3-二羥基-異戊酸、2-氧代異戊酸、異丁酰-CoA、異丁酸、異丁醛、5-氨基戊醛、1，10- 二氨基癸燒、I，10-二氛基_5_癸稀、1,10- 二氛基-5-輕基癸燒、I，10-二氛基_5_癸麗、1，10- 二氨基-5,6-癸二醇、1,10- 二氨基-6-輕基-5-癸酮、苯基苯基乙醒、1,4- 二苯基丁燒、I,
4-_■苯基 _1- 丁稀、I，4- _■苯基-2- 丁稀、1，4- _■苯基 _2_ 丁醇、I，4- _■苯基-2- 丁麗、
1,4- 二苯基-2，3- 丁二醇、1，4_ 二苯基-3-羥基-2- 丁酮、1_(4_羥基苯基)-4_苯基丁烷、I-(4-羥基苯基)-4-苯基-I- 丁烯、I- (4-羥基苯基)-4-苯基-2- 丁烯、I- (4-羥基苯基)-4_苯基-2- 丁醇、I-(4-輕基苯基)-4_苯基-2- 丁酮、I-(4-輕基苯基)-4_苯基-2,
3-丁二醇、I- (4-羥基苯基)-4-苯基-3-羥基-2- 丁酮、I-(吲哚-3) -4-苯基丁烷、I-(吲哚-3) -4-苯基-I- 丁烯、I-(吲哚-3) -4-苯基-2- 丁烯、I-(吲哚-3) -4-苯基-2- 丁醇、I-(噴哚-3) -4-苯基-2- 丁酮、I-(吲哚-3) -4-苯基-2，3- 丁二醇、I-(吲哚-3) -4-苯基-3-羥基-2-丁酮、4-羥基苯基乙醛、1，4_ 二(4-羥基苯基)丁烷、1，4_ 二(4-羥基苯基)-1_ 丁烯、1，4-二(4-羥基苯基)-2-丁烯、1，4-二(4-羥基苯基)-2-丁醇、1，4-二(4-羥基苯基)-2-丁酮、I，4-二(4-羥基苯基)-2，3-丁二醇、I，4-二(4-羥基苯基)-3-羥基-2- 丁酮、I- (4-羥基苯基)-4-(吲哚-3-) 丁烷、1-(4-羥基苯基)-4-(吲哚-3)-I- 丁烯、I- 二 (4-羥基苯基)-4-(吲哚-3) -2- 丁烯、I- (4-羥基苯基)-4-(吲哚-3) -2- 丁醇、1-(4-羥基苯基)-4-(吲哚-3)-2-丁酮、1-(4-羥基苯基)-4-(吲哚-3)-2，3-丁二醇、I-(4-羥基苯基-4-(吲哚-3) -3-羥基-2- 丁酮、吲哚-3-乙醛、I，4- 二(吲哚_3_) 丁烷、I，
4-二(吲哚-3)-1-丁烯、I，4-二(吲哚-3)-2-丁烯、I，4-二(吲哚_3)-2-丁醇、I，4-二(吲哚-3) -2- 丁酮、1，4- 二(吲哚-3) -2，3- 丁二醇、1，4- 二(吲哚-3) -3-羥基-2- 丁酮、琥珀酸半醛、己烷-1，8- 二羧酸、3-己烯-1，8- 二羧酸、3-羥基-己烷-1，8- 二羧酸、3-己酮-1，8- 二羧酸、3，4-己二醇-1，8- 二羧酸、4-羥基-3-己酮_1，8_ 二羧酸、巖藻依聚糖、碘、葉綠素、類胡蘿卜素、鈣、鎂、鐵、鈉、鉀、磷酸鹽、乳酸、乙酸、甲酸、類異戊二烯和聚異戊二烯包括橡膠。本文使用的術語"發(fā)酵"具有本領域技術人員已知的普通含義，并且可以包括在適合的微生物培養(yǎng)基中或之上培養(yǎng)微生物或微生物組。微生物可以是需氧菌、厭氧菌、兼性厭氧菌、異養(yǎng)生物、自養(yǎng)生物、光合自養(yǎng)生物、光合異養(yǎng)生物、化學異養(yǎng)生物和/或化學異養(yǎng)生物。細胞活性，包括細胞生長，可以是生長需氧的 、微需氧的或厭氧的。細胞可以處于任何生長期，包括滯后期(或傳導期)、指數期、過渡期、穩(wěn)定器、衰亡期、休眠期、營養(yǎng)期、孢子形成期、等等。本文使用的術語"植物多糖"具有其本領域技術人員已知的普通含義，并且可以包括糖和糖衍生物的一種或多種碳水化合物聚合物以及糖聚合物的衍生物和/或植物物質中存在的其他聚合物材料。示例性的植物多糖包括木質素、纖維素、淀粉、果膠和半纖維素。其他多糖是殼多糖、磺化多糖，例如藻酸、瓊脂糖、角叉藻聚糖、金屬卟啉、紅藻膠和海蘿聚糖。一般而言，多糖具有兩個或多個糖單元或者糖單元的衍生物。糖單元和/或糖單元的衍生物可以規(guī)則模式或其他方式重復。糖單元可以是己糖單元或戊糖單元或這些的組合。糖單元的衍生物可以是糖醇、糖酸、氨基糖、等等。多糖可以是直鏈的、支鏈的、交聯的或其混合物。一種或一類多糖可以與另一種或一類多糖交聯。本文使用的術語"可發(fā)酵糖"具有其本領域技術人員已知的普通含義，并且可以包括可被微生物用作碳源的一種或多種糖和/或糖衍生物，包括這些化合物的單體、二聚體和多聚體，包括這些化合物的兩種或多種。在一些情況下，在引入分解的材料之前，生物體可以分解這些聚合物，例如通過水解。示例性的可發(fā)酵糖包括但不限于葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖、鼠李糖、纖維素二糖、乳糖、鹿糖、麥芽糖和果糖。本文使用的術語"糖化"具有其本領域技術人員已知的普通含義，并且可以包括植物多糖轉化為可被生物體就近利用的低分子量物類。對于一些生物體，這將包括將最多約七個單體單元以及類似大小鏈的糖衍生物和糖和糖衍生物組合轉化為單糖、二糖、三糖和寡糖。對于一些生物體，允許的鏈長可以更長(例如8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個單體單元或更多)，并且對于一些生物體，允許的鏈長可能更短(例如1、2、3、4、5、6個單體單元)。本文使用的術語“生物質”具有其本領域技術人員已知的普通含義，并且可以包括可被轉化成生物燃料、化學品或其他產物的一種或多種生物材料。生物質的一個示例性來源是植物物質。植物物質可以是例如木本植物物質、非木本植物物質、纖維材料、木質纖維素材料、半纖維材料、碳水化合物、果膠、淀粉、菊粉、果聚糖、葡聚糖、玉米、玉米秸桿、糖甘蔗、草、柳枝稷、竹材、海藻、海甘藍、椰子、麻風樹、黃麻和這些衍生的材料。植物物質可以進一步參考現有化學物類例如蛋白、多糖和油來描述。多糖包括各種單糖和單糖衍生物的聚合物，包括葡萄糖、果糖、乳糖、半乳糖醛酸、鼠李糖、等等。植物物質還包括農業(yè)廢物副產物或側線餾分，例如蘋果渣、玉米浸潰液體、玉米浸潰固體、玉米秸桿、玉米釜餾物、玉米棒、玉米粒、蒸餾顆粒、蒸餾溶質、甘蔗渣、蒸餾顆粒、廢胎面膠、凸點塑料、發(fā)酵廢物、木片、鋸末、木粉、木漿、紙漿、紙漿廢液稻草、廢棄雜物、污水、種子餅、外殼、稻殼、葉、草碎片、玉米秸桿、(玉米碎片)和食物殘羹。這些材料可以來自農場、水生環(huán)境、森林、工業(yè)源、家庭、等等。生物質的另一種非限制性實例是動物有機物質，包括例如牛奶、肉、脂肪、骨粉、動物加工廢物和動物廢物。"原料"常用語指用于例如本文描述的那些過程的生物質。本文使用的術語"培養(yǎng)基"具有其本領域技術人員已知的普通含義，并且可以包括可溶和不溶物質、懸浮物質、細胞和培養(yǎng)基的組合的全部內容，例如發(fā)酵反應的全部內容可以稱為發(fā)酵培養(yǎng)基。本文使用的術語"生產率"具有其本領域技術人員已知的普通含義，并且可以包括在給定時間、給定體積中產生的感興趣的物質的量。單位可以是例如克/升-小時，或者質量、體積和時間的一些其他組合。在發(fā)酵中，生產率常用于表征產物可以在給定發(fā)酵體積中制成的速度。體積可以參考發(fā)酵容器的總體積、發(fā)酵容器的工作體積或者被發(fā)酵的培養(yǎng)基的實際體積。該短語的上下文將指示本領域技術人員預期的含義。生產率(例如g/L/d)不同于“滴度”(例如g/L)，因為生產率包括時間術語，并且滴度類似于濃度。本文使用的術語"生物催化劑"具有其本領域技術人員已知的普通含義，并且可 以包括一種或多種酶和/或微生物，包括溶液、懸液、和酶和微生物的混合物。在一些上下文中，該詞語指酶或微生物發(fā)揮特定功能的可能用途，在其他上下文中，該詞語指兩者的組合用途，而在其他上下文中，該詞指兩者中的僅一種。該短語的上下文將指示本領域技術人員預期的含義。本文使用的術語"轉化效率"或“產率”具有其本領域技術人員已知的普通含義，并且可以包括從底物量得到的產物量。該術語可以表示為來自起始底物量的產物的百分比產量。對于從葡萄糖生產乙醇，凈反應被普遍接受為C6H12O6 — 2C2H50H+2C02且理論最大轉化效率或產率為51 % (wt.)。通常，轉化效率參考理論最大值，例如"理論最大值的80%"。在將葡萄糖轉化為乙醇的情況下，該表述將指示41% (wt.)的轉化效率。該短語的上下文將指示本領域技術人員預期的底物和產物。對于包含例如生物質中存在的不同碳源(木聚糖、木糖、葡萄糖、纖維素二糖、阿拉伯糖纖維素、半纖維素等)的混合物的底物，生物質至乙醇的理論最大轉化效率是由每種碳源的相對濃度衡量的個體碳源組分的最大轉化效率的平均值。在一些情況下，理論最大轉化效率基于假定的糖化效率來計算。僅作為例子，假定包含IOg纖維素的碳源，理論最大轉化效率可以通過假設纖維素糖化為約75%重量的可同化碳源葡萄糖來計算。在該實例中，IOg纖維素可以提供7. 5g葡萄糖，這可以提供約7. 5g*51%或3. Sg乙醇的最大理論轉化效率。在其他情況下，糖化步驟的效率可以被計算或測定(即，測量)。本發(fā)明預期的糖化效率包括對于任何碳水化合物碳源比單一單糖亞基大約 10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%或約100%。"預處理"或"預處理的"在本文用來指任何機械、化學、熱、生化過程或這些過程以組合步驟或順序進行的組合，這實現了生物質的破壞或膨脹以使生物質更容易受到酶和/或微生物的攻擊。在一些實施方案中，預處理可以包括去除或破壞木質素以使植物生物質中的纖維素和半纖維素聚合物更容易被纖維素酶和/或微生物利用，例如通過用酸或堿處理。在一些實施方案中，預處理可以包括使用一種類型的微生物以使植物多糖更容易被另一種類型微生物接近。在一些實施方案中，預處理還可以包括纖維素和/或半纖維素材料的破壞或膨脹。蒸汽爆發(fā)和氨纖維膨脹(或爆發(fā))(AFEX)是公知的熱/化學技術?？梢允褂盟?，包括利用酸和/或酶的方法。還可以使用其他熱、化學、生物化學、酶技術。本文使用的術語"補料分批"或"補料分批發(fā)酵"具有其本領域技術人員已知的普通含義，并且可以包括其中營養(yǎng)物、其他培養(yǎng)基組分或生物催化劑(包括例如酶、新鮮生物體、胞外培養(yǎng)基、等等)在培養(yǎng)期間添加至發(fā)酵罐但在發(fā)酵結束之前不從發(fā)酵罐收集培養(yǎng)基的培養(yǎng)微生物的方法，但它也可以包括其中收獲一部分發(fā)酵罐體積并然后向發(fā)酵罐中剩余培養(yǎng)基添加新鮮培養(yǎng)基的"自我接種"或"部分收獲"技術，其中至少一部分的接種物是留在發(fā)酵罐中的培養(yǎng)基。在一些實施方案中，補料分批過程可以用短語例如"細胞強化補料分批"來表示。該短語可以包括其中添加營養(yǎng)物和微生物細胞的操作或其中添加不含大量營養(yǎng)物的微生物細胞的操作。更概括的短語“補料分批”也涵蓋這些操作。其中使用這些短語的任何一個的上下文將指示本領域技術人員考慮的技術。本文使用的術語"肌醇六磷酸(鹽)"具有本領域技術人員已知的普通含義，可 以包括肌醇六磷酸、其鹽及其組合形式以及這些的組合。本文使用的術語"糖化合物"具有其本領域技術人員已知的普通含義，并且可以包括單糖，包括但不限于己糖和戊糖；糖醇；糖酸；糖胺；含有通過共價或離子鍵直接或間接連接在一起的這些的兩種或多種的化合物；及其混合物。本說明書包括二糖；三糖；寡糖；多糖；和任何長度的支鏈和/或直鏈的糖鏈。a.介紹生物質是可再生能量源，其可以被生物發(fā)酵以產生終產物，例如移動發(fā)動機便攜燃料(例如醇、乙醇、有機酸、乙酸、乳酸、甲烷或氫)或用于其他商業(yè)目的的化合物。生物質包括農業(yè)殘渣(玉米秸桿、草、禾桿、谷殼、甘蔗渣、等等)、動物廢物(來自牛、家禽和肥豬的糞肥)、藻類、木質材料(木料或樹皮、鋸末、林區(qū)廢料和磨屑)、城市廢物(廢紙、回收的衛(wèi)生紙、碎料等等)、能源作物(楊樹、柳樹、柳枝稷、苜蓿、草原須芒草、等等)。木質纖維生物質具有纖維素和半纖維素作為兩種主要組分。為達到木質纖維生物質向終產物(產率)的高發(fā)酵效率，重要的是提供預處理，以除去和/或脫毒至少一部分木質素含量并使纖維素和半纖維素更容易酶促水解。最近，已經實現了纖維素和半纖維素中聚合己糖和戊糖轉化為乙醇。參見English等人的美國專利號4，349，628 ;還參見等人的美國專利號4，400, 470 ；Ingram等人的美國專利號5，000, 000 ；Ingram等人的美國專利號5，028, 539 ;和Ingram等人的美國專利號5，162，516，其全部通過引用并入本文。在一些實施方案中，從生物質產生燃料是一個兩步驟過程，包括酶促水解，隨后發(fā)酵。生物質的酶促水解可以使用可商業(yè)途徑獲得的水解酶混合物、衍生自特定生物體或生物體組的酶、廢棄發(fā)酵培養(yǎng)基、或碳水化合物降解或糖化酶的任何來源來實現。在一個實施方案中，用于處理生物質的酶包括但不限于木聚糖酶、內切-1，4-β-木聚糖酶、木糖苷酶、β -D-木糖苷酶、纖維素酶、半纖維素酶、糖酶、葡聚糖酶、內切葡聚糖酶、內切-1，4-β -葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、葡糖苷酶、β -D-葡糖苷酶、淀粉酶、纖維二糖水解酶、外切纖維二糖水解酶、肌醇六磷酸酶、蛋白酶、果膠酸裂合酶、半乳糖醛酸酶、漆酶淀粉酶、蛋白酶、殼多糖酶、果膠酶或角蛋白酶。用于生物質的處理、生物質的預處理、生物質的酶處理或生物質準備用于發(fā)酵或轉化為有用終產物的其他方法和組合物由以下提供美國專利申請?zhí)?0090053770、20070031918、20070031953、20090053777、20090042259、20090042266、20090004698、20090004692,20090004706,20090011474,20090011484,20080227161,20080227162,20080044877、20080182323、20070148751、20060246563 和美國專利號 5865898、5628830、5693296,5837506和6090595，其每一個在此通過引用整體并入。生物質的酶處理導致高分子量碳水化合物聚合物降解成較小寡糖，并且在一些情況下最終降解成單聚體己糖和戊糖。在第二步，這些糖使用例如酵母或細菌菌株被發(fā)酵成終產物(例如，醇、乙醇、有機酸、乙酸、乳酸、甲烷或氫)。在其他實施方案中，水解和發(fā)酵過程被組合成單個步驟。在一些情況下，這可以通過減少資金和操作成本，例如通過最大限度減小對外部酶處理的需求而提供比兩步過程更經濟的過程。在其他實施方案中，己糖和戊糖兩者轉化為終產物與僅己糖或僅戊糖的轉化、或者與主要轉化戊糖而基本上不轉化己糖或主要轉化己糖而基本上不轉化戊糖的過程相 t匕，可以提供提高的每克生物質的終產物產率。已經報道常用的酵母(釀酒酵母)、真菌和細菌種能夠容易地將己糖(葡萄糖)轉化為乙醇。然而，戊糖(木糖和阿拉伯糖)的發(fā)酵依然是從生物質生產乙醇的技術瓶頸。一些研究者已經使用遺傳技術獲得發(fā)酵單胞菌、大腸桿菌、酵母菌和其他酵母的重組體。本發(fā)明提供了使用微生物例如植物發(fā)酵梭狀芽胞桿菌或其他梭狀芽胞桿菌種的方法，其在某些實施方案中能夠同時水解和發(fā)酵木質纖維生物質。在一個實施方案中，微生物同時發(fā)酵己糖和戊糖成分以產生發(fā)酵終產物。在另一個實施方案中，植物發(fā)酵梭狀芽胞桿菌或其他梭狀芽胞桿菌種可以通過其產生能夠水解多糖和高級糖為低分子量糖、寡糖、二糖和單糖的酶的能力而提供用于將生物質轉化為乙醇或其他發(fā)酵終產物(例如醇、有機酸、乙酸、乳酸、甲烷或氫)的有用優(yōu)點。在一些實施方案中，微生物(例如植物發(fā)酵梭狀芽胞桿菌或其他梭狀芽胞桿菌種)可用于本文描述的方法以進行水解高分子量的含糖生物質和/或高級糖或多糖為低級糖和發(fā)酵來自纖維素以及半纖維素的寡糖、二糖和單糖成為一種或多種發(fā)酵終產物(包括但不限于乙醇、甲烷、氫和其他化合物，例如有機酸，包括甲酸、乙酸和乳酸)的組合步驟。本文描述的方法還提供微生物例如植物發(fā)酵梭狀芽胞桿菌或其他梭狀芽胞桿菌種在包括以下的條件下生長、培養(yǎng)、發(fā)酵等等升高的乙醇濃度、高糖濃度、低糖濃度、利用可溶性碳源和厭氧條件。在一個實施方案中，植物發(fā)酵梭狀芽胞桿菌或其他梭狀芽胞桿菌種優(yōu)先發(fā)酵寡聚體而非單糖。該代謝特征可以被用來減少生物質預處理的時間和嚴重度。例如，導致寡聚體而非單糖釋放的較不強烈的酸處理減少預處理過程的時間和化學品成本。這可以導致生產發(fā)酵終產物的總成本較小。在這種過程中較少的糖被降解，由此添加生物質較高的糖含量和增加的乙醇或其他化學產物的產率。在一些實施方案中，本發(fā)明提供了發(fā)酵方法，例如連續(xù)發(fā)酵方法、分批發(fā)酵方法或補料分批發(fā)酵方法(例如，恒定體積或可變體積)。在一些實施方案中，所述方法提供了用微生物例如植物發(fā)酵梭狀芽胞桿菌或其他梭狀芽胞桿菌種發(fā)酵生物質。在一些情況下，提供補料分批發(fā)酵方法用于使用微生物例如植物發(fā)酵梭狀芽胞桿菌或其他梭狀芽胞桿菌種從生物質(例如玉米秸桿或本文提供的任何生物質)生產乙醇。在一個實施方案中，方法提供了 5至200g/L的乙醇滴度，具有約O. 5至20g/L/d的生產率。在另一個實施方案中，方法提供了約O. 1-1克乙醇/克發(fā)酵罐中加載的生物質的乙醇產率。在一些實施方案中，方法提供了發(fā)酵終產物(例如醇、乙醇、甲醇、有機酸、乙酸、乳酸、甲烷或氫)的理論最大可能產率的約45% -99. 5%或更大的收率。在一個實施方案中，方法提供了至少約5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、4、142、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、105、110、115、120 125、130、135、140、145、150，160、170、180、190 或 200g/L 或更多的乙醇滴度，具有約 O. 5,0. 6,0. 7,0. 8,0. 9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、
11、12、13、14、15、16、17、18、19或20g/L/d或更高的生產率。在另一個實施方案中，方法提供了約O. 1,0. 2,0. 3,0. 4,0. 5,0. 6,0. 7,0. 8,0. 9或Ig或更多乙醇/g發(fā)酵罐中加載的生物質的乙醇產率。在一些實施方案中，提供了發(fā)酵終產物(例如醇、乙醇、有機酸、乙酸、乳酸、甲烷或氫)的理論最大可能產率的至少約50%、60%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、 93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%,99. 5%或更高的產率。b.方法遞以下描述和實施例詳細地示例說明了本發(fā)明的某些優(yōu)選實施方案。本領域技術人員將理解，存在許多由其范圍涵蓋的變化和調整。因此，優(yōu)選實施方案的描述不應被認為限制本發(fā)明的范圍。提供用于發(fā)酵生物質和隨后生產有用的終產物的方法，所述終產物包括但不限于醇、乙醇、有機酸、乙酸、乳酸、甲烷或氫或其他化學品。在一些實施方案中，生物質(例如玉米秸桿)在發(fā)酵之前被加工或預處理。在一個實施方案中，預處理方法包括但不限于生物質粒度減小，例如粉碎、磨碎、切碎、壓碎、研磨或磨粉。在一些實施方案中，生物質粒度減小可以包括尺寸分離方法，例如篩分，或者本領域已知的根據尺寸分離材料的其他適合方法。在一個實施方案中，尺寸分離可以提供提高的產率。在一些實施方案中，精細粉碎的生物質(例如，直徑小于約 8mm，例如 8、7· 9,7. 7,7. 5,7. 3、7、6· 9,6. 7,6. 5,6. 3、6、5· 9,5. 7,5. 5、5. 3、5、4. 9、4. 7、4. 5、4. 3、4、3. 9、3. 7、3. 5、3. 3、3、2. 9、2. 7、2. 5、2· 3、2、1· 9、I. 7、I. 5、I. 3、1、0. 9,0. 8,0. 7,0. 6,0. 5,0. 4,0. 3,0. 2或O. Imm的顆粒)與較大顆粒的分離允許較大顆粒被回收回尺寸減小過程，從而增加被加工的生物質的最終產率。在一些實施方案中，預處理方法可以包括在高或低pH條件下的處理。高或低pH處理包括但不限于使用濃酸或濃堿的處理，或使用稀酸或稀堿的處理。用于在本發(fā)明方法中處理生物質的堿性組合物包括但不限于苛性堿，例如苛性石灰、苛性蘇打、苛性鉀、氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化鈣或氧化鈣。在一些實施方案中，適用于處理生物質的堿量范圍是每克待處理生物質O. Olg至3g堿(例如苛性堿)。在一些實施方案中，適用于處理生物質的堿量包括但不限于每克待處理生物質約O. Olg堿(例如苛性堿)、0. 02g、0. 03g、0. 04g、O. 05g、0. 075g、0. lg、0. 2g、0. 3g、0. 4g、0. 5g、0. 75g、lg、2g 或約 3g 堿(例如苛性堿)。在另一個實施方案中，生物質可以在升高的溫度和/或壓力下預處理。在一個實施方案中，生物質在20°C至400°C的溫度范圍預處理。在另一個實施方案中，生物質在約 20 0C >25 0C >30 0C >35 0C >40 0C >45 0C >50 0C >55 0C >60 V、65 0C >80 0C >90 V、100 V、120 V、150°c、200°c、250°c、30(rc，35(rc、40(rc或更高的溫度下預處理。在另一個實施方案中，升
高的溫度通過使用蒸汽、熱水或熱氣體來提供。在一個實施方案中，蒸汽可以被注射入含生物質的容器。在另一個實施方案中，蒸汽、熱水或熱氣可以被注射入容器套，使得它加熱但不直接接觸生物質。在另一個實施方案中，生物質可以在升高的壓力下處理。在一個實施方案中，生物質在約Ipsi至約30psi的壓力范圍預處理。在另一個實施方案中，生物質在約lpsi、2psi、3psi、4psi、5psi、6psi、7psi、8psi、9psi、IOpsi、12psi、15psi、18psi、20psi、22psi、24psi、26psi、28psi、30psi或更高壓力下預處理。在一些實施方案中，生物質可以通過注射蒸汽進入含有生物質的容器而用升高的壓力處理。在其他實施方案中，生物質可以在堿或酸處理或本文提供的任何其他處理方法之前或之后被處理至真空條件。在一個實施方案中，堿或酸預處理的生物質被洗滌(例如用水(熱的或冷的)或 其他溶劑例如醇(例如乙醇))、用酸、堿或緩沖劑(例如，磷酸鹽、檸檬酸鹽、硼酸鹽或碳酸鹽)中和pH，或者在發(fā)酵之前干燥。在一個實施方案中，干燥步驟可以在真空下進行以增加水或其他溶劑的蒸發(fā)速率?？蛇x地或附加地，干燥步驟可以在例如約20°C、25°C、30°C、35 °C >40 °C >45 °C >50 °C >55 °C >60 °C >65 °C >80 °C >90 V、100 V、120 V、150 °C >200 °C >250 V、300°C或更高的升高溫度下進行。在本發(fā)明一些實施方案中，預處理步驟包括固體回收步驟。固體回收步驟可以在預處理(例如，酸或堿預處理)期間或之后，或者在干燥步驟之前。在一些實施方案中，本發(fā)明方法提供的固體回收步驟包括使用濾網、濾器、篩或膜來分離液體和固體成分。在一個實施方案中，適合的濾網孔直徑尺寸范圍約O. 001微米至8mm,例如約O. 005微米至3mm或約O. 01微米至1mm。在一個實施方案中，濾網孔尺寸具有約O. 01微米、O. 02微米、O. 05微米、O. I微米、O. 5微米、I微米、2微米、4微米、5微米、10微米、20微米、25微米、50微米、75微米、100微米、125微米、150微米、200微米、250微米、300微米、400微米、500微米、750微米、Imm或更大的孔徑。在一個實施方案中，補料分批發(fā)酵對處理的生物質進行以產生發(fā)酵終產物(例如，醇、乙醇、有機酸、乙酸、乳酸、甲烷或氫)。在一個實施方案中，發(fā)酵過程包括使用一種或多種微生物同時水解和發(fā)酵生物質，所述微生物例如梭狀芽胞桿菌屬菌株、木霉菌屬菌株、酵母菌屬菌株、發(fā)酵單胞菌屬菌株、或適合發(fā)酵生物質的另一種微生物。在另一個實施方案中，發(fā)酵過程包括使用以下微生物同時水解和發(fā)酵生物質植物發(fā)酵梭狀芽胞桿菌、解木素梭狀芽胞桿菌(Clostridium algidixylanolyticum)、解木聚糖梭狀芽胞桿菌(Clostridium xylanolyticum)、卩遼纖維梭狀芽胞桿菌(Clostridiumcellulovorans)、解纖維梭狀芽胞桿菌(Clostridium cellulolyticum)、熱梭狀芽胞桿菌(Clostridium thermocellum)、約氏梭狀芽胞桿菌(Clostridium josui)、溶紙莎草梭狀芽胞桿菌(Clostridium papyrosolvens)、產纖維二糖梭狀芽胞桿菌(Clostridiumcellobioparum)、Clostridium hungatei、纖維素梭狀芽胞桿菌(Clostridiumcellulosi)、幾堆梭狀芽胞桿菌(Clostridium stercorarium)、白蟻梭狀芽胞桿菌(Clostridium termitidis)、熱幾梭狀芽胞桿菌(Clostridium thermocopriae)、速生梭狀芽胞桿菌(Clostridium celerecrescens)、解多糖梭狀芽胞桿菌(Clostridiumpolysaccharolyticum)、波氏梭狀芽胞桿菌(Clostridium populeti)、緩纖維梭狀芽胞桿菌(Clostridium Ientocellum)、Clostridium chartatabidum、阿氏梭狀芽胞桿菌(Clostridium aldrichii)、Clostridium herbivorans、角軍纖維素醋弧菌(Acetivibriocellulolyticus)、溶纖維素擬桿菌(Bacteroides cellulosolvens)、解糖熱解纖維素菌(Caldicellulosiruptor saccharoIyticum)、白色瘤胃球菌、生黃瘤胃球菌、產玻拍酸絲狀桿菌、溶纖維真桿菌(Eubacterium cellulosolvens)、溶纖維丁酸弧菌、Anaerocellumthermophilum、解纖維素嗜鹽菌(Halocella celIulolytica)、熱解糖熱厭氧桿菌(Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum)、 Sacharophagus degradans、或角軍糖熱厭氧桿菌(Thermoanaerobacterium saccharoIyticum)。在一個實施方案中，用于發(fā)酵生物質的一種或多種微生物是野生型微生物。野生型微生物是基本類似于獲自天然環(huán)境的分離株的那些微生物，并且包括在實驗室環(huán)境中 繁殖的分離株。在另一個實施方案中，一種或多種微生物被繁殖和/或根據期望特征來篩選。篩選或繁殖方法可以包括用包含是或類似于發(fā)酵終產物生產中利用的碳源的碳源的培養(yǎng)基生長。期望特征包括但不限于增加的生物質糖化、增加的特定發(fā)酵終產物生產、增加的乙醇生產、增加的對乙醇的耐受性、增加的酶合成或減少的孢子形成。篩選方法可以進一步包括使用誘變(例如通過化學或輻射方式)以產生期望的微生物群體。然后，可以根據期望特征篩選誘變的微生物，導致更高頻率的期望分離株。在另一個實施方案中，用于發(fā)酵的一種或多種微生物可以是重組微生物。重組微生物包括與各自野生型微生物相比對其核酸的一個或多個改變，這是自發(fā)(即，天然)突變沒有產生的。在一個實施方案中，重組微生物包括來自另一物類(例如另一種微生物)的外源性多核酸、合成多核酸、或從相同物類分離或衍生的多核酸。在一個實施方案中，發(fā)酵過程可以包括用一種或多種酶同時水解和發(fā)酵生物質，所述酶例如木聚糖酶、內切1，4-β -木聚糖酶、木糖苷酶、β-D-木糖苷酶、纖維素酶、半纖維素酶、糖酶、葡聚糖酶、內切葡聚糖酶、內切1，4-β-葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、葡糖苷酶、β -D-葡糖苷酶、淀粉酶、纖維二糖水解酶、外切纖維二糖水解酶、肌醇六磷酸酶、蛋白酶、過氧化物酶、果膠酸裂合酶、半乳糖醛酸酶或漆酶。在一個實施方案中，用于處理生物質的一種或多種酶是熱穩(wěn)定的。在另一個實施方案中，生物質在發(fā)酵之前用一種或多種例如本文提供的那些酶處理。在另一個實施方案中，生物質在發(fā)酵期間用一種或多種例如本文提供的那些酶處理。在另一個實施方案中，生物質在發(fā)酵之前和發(fā)酵期間用一種或多種例如本文提供的那些酶處理。在另一個實施方案中，用于預處理生物質的酶與發(fā)酵期間添加的那些酶相同。在另一個實施方案中，用于預處理生物質的酶不同于在發(fā)酵期間添加的那些酶。在一些實施方案中，發(fā)酵可以在諸如生物反應器、發(fā)酵容器、攪拌罐反應器或流化床反應器的裝置中進行。在一個實施方案中，處理的生物質可以補充適合的化學品以促進一種或多種發(fā)酵生物體的強力生長。在一個實施方案中，有用的補充包括但不限于氮和/或氨基酸來源，例如酵母提取物、半胱氨酸、銨鹽(例如，硝酸鹽、硫酸鹽、磷酸鹽等等)；簡單碳水化合物的來源，例如玉米浸潰液體和麥芽糖漿；維生素來源，例如酵母提取物；緩沖齊 ，例如鹽(包括但不限于檸檬酸鹽、磷酸鹽或碳酸鹽)；或礦脂營養(yǎng)素，例如鎂鹽、鈣鹽或鐵鹽。在一些實施方案中，氧化還原調節(jié)劑被添加至發(fā)酵混合物，包括但不限于半胱氨酸或巰基乙醇。用于本發(fā)明方法的化學品容易獲得并且可以購自商業(yè)供應商，例如Sigma-Aldricho 此外，商業(yè)酶混合物(例如，accellerase 1000、CelluSeb-TL、CelluSeb-TS、Cellic CTec、STARGEN 、Maxaliq 、Spezyme 、Distillase 、G-Zyme 、Fermenzyme 、Fermgen 、GC 212或Optimash )或任何其他商業(yè)酶混合物可以購自供應商，例如 Specialty Enzymes & Biochemicals Co.、Genencor 或 Novozymes?？蛇x地，酶混合物可以通過在適合培養(yǎng)基中培養(yǎng)一種或多種生物體例如真菌(例如，木霉菌、酵母菌、畢赤酵母、白腐菌等等)、細菌(例如梭狀芽胞桿菌(例如植物發(fā)酵梭狀芽胞桿菌)或大腸桿菌、運動發(fā)酵單胞菌、Sacharophagus degradans等等)并收獲從其產生的酶來制備。在一些實施方案中，收獲可以包括一個或多個酶純化步驟。在一個實施方案中，通過微生物生產發(fā)酵終產物(例如植物發(fā)酵梭狀芽胞桿菌)的滴度和/或生產率通過在包含一種或多種含有己糖和/或戍糖的化合物的培養(yǎng)基中培養(yǎng) 所述微生物來提高。在一個實施方案中，過程包括將起始材料(例如生物質)轉化為生物燃料，例如一種或多種醇。在一個實施方案中，本發(fā)明方法包括使包含己糖(例如葡萄糖、纖維素二糖)和戊糖(例如木糖、阿拉伯糖)的底物與植物發(fā)酵梭狀芽胞桿菌接觸以產生乙醇。在本發(fā)明的一些實施方案中，使用本發(fā)明方法用微生物(例如植物發(fā)酵梭狀芽胞桿菌)分批發(fā)酵己糖和戊糖的混合物提供了約O. l-8g/L/h或更高的己糖(例如葡萄糖、纖維素、纖維素二糖等等)和約O. l_8g/L/h或更高的戊糖(木糖、木聚糖、半纖維素等等)的攝取速率。在本發(fā)明的一些實施方案中，使用本發(fā)明方法用微生物(例如植物發(fā)酵梭狀芽胞桿菌)分批發(fā)酵己糖和戊糖的混合物提供了約O. 1,0. 2,0. 4,0. 5,0. 6,0. 7,0. 8、1、2、3、4、5或6g/L/h或更高的己糖(例如葡萄糖、纖維素、纖維素二糖等等)和約O. 1,0. 2,0. 4、O. 5,0. 6,0. 7,0. 8、1、2、3、4、5或6g/L/h或更高的戊糖(木糖、木聚糖、半纖維素等等)的攝取速率。在一個實施方案中，用于生產乙醇的方法在40小時或更短時間內產生約10g/l至120g/l。在另一個實施方案中，用于生產乙醇的方法在40小時內通過生物質發(fā)酵產生約10g/l、Ilg/L、12g/L、13g/L、14g/L、15g/L、16g/L、17g/L、18g/L、19g/L、20g/L、21g/L、22g/L、23g/L、24g/L、25g/L、26g/L、27g/L、28g/L、29g/L、30g/L、31g/L、32g/L、33g/L、34g/L、35g/L、36g/L、37g/L、38g/L、39g/L、40g/L、41g/L、42g/L、43g/L、44g/L、45g/L、46g/L、47g/L、48g/L、49g/L、50g/L、51g/L、52g/L、53g/L、54g/L、55g/L、56g/L、57g/L、58g/L、59g/L、60g/L、61g/L、62g/L、63g/L、64g/L、65g/L、66g/L、67g/L、68g/L、69g/L、70g/L、71g/L、72g/L、73g/L、74g/L、75g/L、76g/L、77g/L、78g/L、79g/L、80g/L、81g/L、82g/L、83g/L、84g/L、85g/L、86g/L、87g/L、88g/L、89g/L、90g/L、91g/L、92g/L、93g/L、94g/L、95g/L、96g/L、97g/L、98g/L、99g/L、100g/L、110g/l、120g/l或更多乙醇。在另一個實施方案中，通過包括同時發(fā)酵己糖和戊糖的方法生產乙醇。在另一個實施方案中，乙醇通過包括同時發(fā)酵己糖和戊糖的微生物生產。在另一個實施方案中，產生發(fā)酵終產物的微生物在高醇(例如乙醇或丁醇)濃度存在下耐受。在一個實施方案中，植物發(fā)酵梭狀芽胞桿菌在高醇(例如乙醇或丁醇)濃度存在下耐受。在一個實施方案中，微生物可以在達15% v/v的醇(例如乙醇或丁醇)濃度下生長并發(fā) 車功能。在另Iv實施方案中，微生物可以在I、2*%、3*%、4*%、5*%、6*%、7*%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%或15%￥八的醇(例如乙醇或丁醇)濃度下生長并發(fā)揮功能。在一個實施方案中，高醇濃度中的功能包括促進生產醇而無過度的醇和/或其他存在組分的抑制或壓抑的能力。在另一個實施方案中，高醇濃度中的功能包括將生物質原料中的己糖和戊糖碳源有效轉化成發(fā)酵終產物例如醇的能力。在一個實施方案中，植物發(fā)酵梭狀芽胞桿菌在高醇(例如乙醇或丁醇)濃度存在下耐受。已經發(fā)現，在包含植物發(fā)酵梭狀芽胞桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)基中乙醇濃度在分批發(fā)酵約36-48小時之后達到約15g/L的平穩(wěn)狀態(tài)，碳物質包括在培養(yǎng)基中。在另一個實施方案中，將發(fā)酵PH降低至約6. 5和/或添加不飽和脂肪酸至發(fā)酵培養(yǎng)基，導致生物體產生的乙醇量顯著增加，在48-96小時或更長發(fā)酵之后在培養(yǎng)基中發(fā)現約20g/L至約30、40、50、60或70g/L或更多的乙醇。此外，已經發(fā)現，當乙醇滴度低 時，生物體的生產率較高(至約IOg/L-d)，并且當乙醇濃度較高時，生物體的生產率較低(至約2g/L-d)。在減小的pH和/或添加脂質(例如脂肪酸)時的發(fā)酵可以導致乙醇生產率與未調節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)基相比約2至10倍(例如2x、3x、4x、5x、6x、7x、8x、9x或IOx增加)或更高的增加。在本發(fā)明一些實施方案中，己糖和戊糖的同時發(fā)酵還可實現乙醇生產率和/或產率的增加。在一些情況下，己糖和戊糖碳水化合物底物的同時發(fā)酵可與在減小的PH和/或添加脂質(例如脂肪酸)時的發(fā)酵組合使用以進一步增加生產率和/或產率。在一個實施方案中，脂質是脂肪或油，包括但不限于脂肪酸的甘油酯以及伴隨的磷脂、留醇、醇、烴、酮和相關化合物。在另一個實施方案中，脂質是磷脂。在一個實施方案中，脂肪酸是脂肪族或芳香族單羧酸。在另一個實施方案中，脂肪酸是不飽和脂肪酸。在一個實施方案中，不飽和脂肪酸是具有I至3個雙鍵的脂肪酸，并且"高度不飽和脂肪酸"指具有4個或更多雙鍵的脂肪酸。在另一個實施方案中，不飽和脂肪酸是ω-3高度不飽和脂肪酸，例如二十碳五烯酸、二十二碳五烯酸、α亞麻酸、二十二碳六烯酸及其軛合物。在另一個實施方案中，脂肪酸是飽和脂肪酸。在另一個實施方案中，脂肪酸是植物油，例如部分氫化的植物油，包括棕櫚油、棉籽油、玉米油、花生油、棕櫚仁油、巴巴蘇油、葵花油、紅花油或其混合物。在另一個實施方案中，包含脂肪酸的組合物還包括臘，例如蜂臘、石油臘、米糠臘、蓖麻油臘、微晶臘或其混合物。在另一個實施方案中，生物質在用微生物發(fā)酵之前用表面活性劑預處理。在另一個實施方案中，生物質在微生物發(fā)酵期間與表面活性劑接觸。在一個實施方案中，所述表面活性劑是Tween系列表面活性劑(例如Tween 20或Tween 80)或Triton系列表面活性劑(例如Triton X-100)。在另一個實施方案中，所述表面活性劑是聚山梨酯60、聚山梨酯80、丙二醇、二辛基磺基琥珀酸鈉、月桂基硫酸鈉、脂肪酸的乳酸酯、脂肪酸的聚甘油酯或其混合物。在另一個實施方案中，生物質在用微生物發(fā)酵之前用表面活性劑和脂質預處理。在另一個實施方案中，生物質在用微生物發(fā)酵期間與表面活性劑和脂質接觸。在另一個實施方案中，發(fā)酵培養(yǎng)基包括螯合劑(例如檸檬酸三鈉的二水合物或EDTA)。在一個實施方案中，螯合劑是與某些金屬離子形成可溶性絡合分子的化學品，使所述離子失活以使它們不與其他元素或離子反應。在一個實施方案中，發(fā)酵培養(yǎng)基中螯合劑的濃度大于約O. 2g/L、大于約O. 5g/L或大于約lg/L。在另一個實施方案中，發(fā)酵培養(yǎng)基中螯合劑的濃度小于約10g/L、小于約5g/L或小于約2g/L。在一個實施方案中，生物可接受螯合劑是5-磺基水楊酸二水合物、檸檬酸二胺、草酸銨一水合物、檸檬酸、乙二胺四乙酸、乙二胺四乙酸二鈉鹽二水合物、L-(+)_酒石酸、草酸鉀一水合物、酒石酸鉀鈉四水合物、檸檬酸三鈉二水合物、L-酒石酸二鈉二水合物、草酸鈉、乙二醇-雙(2-氨基乙醚)-N，N，N'，N'-四乙酸、檸檬酸三鎂九水合物、乙二胺四乙酸二銨鹽、乙二胺四乙酸二鉀鹽二水合物、四草酸鉀二水合物、酒石酸二鈉二水合物、乙二胺四乙酸三鉀鹽二水合物、乙二胺四乙酸三鈉鹽二水合物、酒石酸二銨、檸檬酸三鋰四水合物、檸檬酸鉀、酒石酸氫鈉一水合物、檸檬酸鈉、乙二胺四乙酸四鈉鹽水合物、N，N-二甲基癸胺N-氧化物、N，N-二甲基十二胺N-氧化物、次氮基三乙酸、檸檬酸三鉀、D-酒石酸鉀、過氧化硫酸氫鉀、酒石酸鉀鈉、苯均四酸水合物、酒石酸二鈉溶液、檸檬酸濃縮溶液、乙二胺四乙酸二鈉鹽、依地酸二鈉、檸檬酸鈉、乙二胺四(亞甲基磷酸)、二羧基甲基谷氨酸、二乙胺二琥珀酸(EDDS)、甲胺、綠膿菌素、綠膿菌熒光素、腸菌素、蛋氨酸，例如植物螯合肽、蘋果酸、次氮基三乙酸、草酸或去鐵草酰胺B。在一個實施方案中，螯合劑根據靶向螯合的金屬的特異性和/或通過螯合劑在預處理環(huán)境中發(fā)揮作用的能力來選擇。在一個實施方案中，當堿性PH通過向原料添加堿劑來維持時，選擇的螯合劑將能夠在堿性PH下發(fā)揮作用。在另一個實施方案中，當酸性pH通過向原料添加酸劑來維持時，選擇的螯合劑將能夠在酸性PH下發(fā)揮作用。在另一個實施方案中，當在預處理過程中利用高溫時，選擇的螯合劑能夠在高溫發(fā)揮作用。在另一個實施方案中，發(fā)酵培養(yǎng)基包括超過一種螯合劑。在一個實施方案中，一種或多種螯合劑在微生物例如植物發(fā)酵梭狀芽胞桿菌發(fā)酵生物質期間被添加至發(fā)酵培養(yǎng)基。
牛物質在一些實施方案中，微生物(例如植物發(fā)酵梭狀芽胞桿菌)與預處理或非預處理的原料接觸，所述原料包含纖維素、半纖維素和/或木質纖維素材料。其他營養(yǎng)素可以存在或添加至生物質材料以被微生物加工，所述營養(yǎng)素包括含氮化合物，例如氨基酸、蛋白、水解蛋白、氨、尿素、硝酸鹽、亞硝酸鹽、大豆、大豆衍生物、酪蛋白、酪蛋白衍生物、乳粉、乳衍生物、乳清、酵母提取物、水解酵母、自溶酵母、玉米浸潰液體、玉米浸潰固體、谷氨酸單鈉和/或其他發(fā)酵氮源。維生素和/或礦物補充物。在一些實施方案中，一種或多種其他低分子量碳源可以被添加或存在，例如葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、玉米糖漿、蒸餾干燥可溶物(DDS)、蒸餾干燥顆粒(DDG)、濃縮蒸餾可溶物(CDS)、蒸餾濕潤顆粒(DWG)、蒸餾干燥顆粒及可溶物(DDGS)、乳酸等等。此類低分子量碳源可以發(fā)揮多種功能，包括在發(fā)酵期開始時提供初始碳源，幫助構建細胞技術，控制碳/氮比例，去除過量氮，或一些其他功能。在一些實施方案中，添加另一種培養(yǎng)基補充物，例如PH調節(jié)劑、脂質(例如脂肪酸)、表面活性劑或螯合劑)。在一些實施方案中，需氧/厭氧循環(huán)用于將纖維素或木質纖維素材料轉化為燃料和化學品。在一些實施方案中，厭氧微生物可以直接發(fā)酵生物質而無需預處理。在一些實施方案中，原料與能夠將植物衍生的聚合物材料分解成低分子量產物的生物催化劑接觸，低分子量產物隨后可以被生物催化劑轉化為燃料和/或其他期望的化學品。在一些實施方案中，本發(fā)明提供了通過微生物同時糖化和發(fā)酵來自生物質的纖維素固體成為燃料或另一種發(fā)酵終產物的方法。在一個實施方案中，微生物是植物發(fā)酵梭狀芽胞桿菌。在一個實施方案中，通過微生物對預處理的原料的水解和對寡糖的水解在單個發(fā)酵反應容器中同時發(fā)生。在一個實施方案中，微生物是植物發(fā)酵梭狀芽胞桿菌。在另一個實施方案中，預處理的原料的水解、寡糖的水解和單糖轉化為乙醇可以在單個反應容器中同時發(fā)生。在一個實施方案中，單一微生物同時進行水解和轉化。在一個實施方案中，微生物是植物發(fā)酵梭狀芽胞桿菌。在另一個實施方案中，微生物的第一和第二個種進行水解和轉化步驟。在一個實施方案中，方法包括用可以糖化C5/C6糖的微生物在封閉容器中處理生物質。在另一個實施方案中，方法包括用植物發(fā)酵梭狀芽胞桿菌細菌或另一梭狀芽胞桿菌種在封閉容器中在其中植物發(fā)酵梭狀芽胞桿菌細菌或其他微生物產生足以充分轉化生物質成為單糖和二糖的糖解酶的條件下處理生物質。在另一個實施方案中，方法包括用可以糖化C5/C6糖的微生物在容器中處理生物質并添加一種或多種酶以幫助碳水化合物或木質纖維素材料的分解或脫毒。在另一個實施方案中，方法包括用植物發(fā)酵梭狀芽胞桿菌或另一種類似的C5/C6梭狀芽胞桿菌種在容器中處理微生物并添加一種或多種酶以幫助碳水化合物或木質纖維素材料的分解或脫毒。在一些實施方案中，培養(yǎng)物在用第一微生物(例如植物發(fā)酵梭狀芽胞桿菌)發(fā)酵之后可以與第二微生物接觸，其中第二微生物能夠充分轉化單糖和二糖成為期望的發(fā)酵產物，例如燃料(例如乙醇或丁醇)。在一個實施方案中，第二微生物是真菌。在另一個實施方案中，第二微生物是酵母。在另一個實施方案中，第二微生物是貝酵母(Saccharomyces bayanus)、布拉酵母(Saccharomyces boulardii)、 博伊丁酵母(Saccharomyces bulderi)、Saccharomyces cariocanus、Saccharomycescariocus、釀酒酵母、薛瓦酵母(Saccharomyces chevalieri)、 Saccharomycesdairenensis、葡萄酵母(Saccharomyces ellipsoideus) >Saccharomyces martiniae、摩納酵母(Saccharomyces monacensis) >Saccharomyces norbensis、奇異酵母(Saccharomycesparadoxus)、巴氏酵母(Saccharomyces pastorianus) > Saccharomyces spencerorum、圖列茨酵母(Saccharomyces turicensis)、單胞酵母(Saccharomyces unisporus)、葡萄汁酵母(Saccharomyces uvarum)、Saccharomyces zonatus。在另一個實施方案中，第二微生物是酵母菌或念珠菌。在另一個實施方案中，第二微生物是梭狀芽胞桿菌種，例如熱梭狀芽胞桿菌、丙酮丁醇梭狀芽胞桿菌和噬纖維梭狀芽胞桿菌或運動發(fā)酵單胞菌。在一些實施方案中，提供了從含有木質素的生物質生產生物燃料或其他化學品的方法。該方法包括1)使含木質素的生物質與濃度足以水解至少一部分含木質素的生物質的堿水溶液接觸；2)將處理的生物質中和至pH 5至9 (例如5. 5、6、6. 5、7、7. 5、8、8. 5或9) ；3)在封閉容器中用植物發(fā)酵梭狀芽胞桿菌或另一種類似的C5/C6梭狀芽胞桿菌種在其中植物發(fā)酵梭狀芽胞桿菌(任選添加一種或多種酶至容器)充分轉化被處理的生物質成為單糖和二糖和/或生物燃料或其他發(fā)酵終產物的條件下處理生物質；和4)任選地，引入第二微生物培養(yǎng)物，其中所述第二微生物能夠充分轉化單糖和二糖成為發(fā)酵終產物，例如生物燃料。微牛物的遺傳修飾另一方面，提供了通過構建和使用遺傳修飾微生物來生產發(fā)酵終產物例如一種或多種醇例如乙醇的組合物和方法。在一個實施方案中，遺傳修飾微生物是植物發(fā)酵梭狀芽胞桿菌。在一個實施方案中，遺傳修飾針對調節(jié)或編碼與發(fā)酵生化途徑、糖解酶表達或增加發(fā)酵期間環(huán)境條件耐受性相關的蛋白的核酸序列。在另一個實施方案中，遺傳修飾針對微生物中的核酸序列。在一個實施方案中，微生物用編碼感興趣的途徑、酶或蛋白的一個或多個基因的多核苷酸轉化。在另一個實施方案中，微生物被轉化以產生感興趣的途徑、酶或蛋白的一個或多個基因的多個拷貝。在一些實施方案中，被轉化入微生物的多核苷酸是異源的。在其他實施方案中，所述多核苷酸衍生自微生物。在一個實施方案中，微生物用編碼一個或多個基因的異源多核苷酸轉化，所述一個或多個基因編碼用于發(fā)酵己糖的酶，其中所述基因以足以賦予所述微生物轉化子與未轉化的微生物相比增加的濃度、生產率水平或產率生產乙醇的能力的水平表達。在另一個實施方案中，微生物用編碼一個或多個基因的異源多核苷酸轉化，所述一個或多個基因編碼用于發(fā)酵戊糖的酶，其中所述基因以足以賦予所述微生物轉化子與未轉化的微生物相比增加的濃度、生產率水平或產率生產乙醇或其他終產物的能力的水平表達。在其他實施方案中，微生物用發(fā)酵己糖和戊糖的酶的組合轉化。在一些實施方案中，可以實現提高的終產物生產率。在另一個實施方案中，微生物用編碼一個或多個基因的異源多核苷酸轉化，所述一個或多個基因編碼用于多糖糖化的糖解酶，其中所述基因以足以賦予轉化的微生物與未轉化的微生物相比增加的濃度、糖化速率或單糖、二糖或寡糖的產率糖化多糖為單糖、二糖或寡糖的能力的水平表達。在另一個實施方案中，遺傳修飾針對植物發(fā)酵梭狀芽胞桿菌中的核酸序列。在一個實施方案中，植物發(fā)酵梭狀芽胞桿菌用編碼感興趣的途徑、酶或蛋白的一個或多個基因的多核苷酸轉化。在另一個實施方案中，植物發(fā)酵梭狀芽胞桿菌被轉化以產生感興趣的途徑、酶或蛋白的一個或多個基因的多個拷貝。在一些實施方案中，被轉化入植物發(fā)酵梭狀芽胞桿菌的多核苷酸是異源的。在其他實施方案中，多核苷酸衍生自植物發(fā)酵梭狀芽胞桿菌。 在一個實施方案中，植物發(fā)酵梭狀芽胞桿菌用編碼一個或多個基因的異源多核苷酸轉化，所述一個或多個基因編碼用于發(fā)酵己糖的酶，其中所述基因以足以賦予所述植物發(fā)酵梭狀芽胞桿菌轉化子與未轉化的植物發(fā)酵梭狀芽胞桿菌相比增加的濃度、生產率水平或產率生產乙醇的能力的水平表達。在另一個實施方案中，植物發(fā)酵梭狀芽胞桿菌用編碼一個或多個基因的異源多核苷酸轉化，所述一個或多個基因編碼用于發(fā)酵戊糖的酶，其中所述基因以足以賦予所述植物發(fā)酵梭狀芽胞桿菌轉化子與未轉化的植物發(fā)酵梭狀芽胞桿菌相比增加的濃度、生產率水平或產率生產乙醇或其他終產物的能力的水平表達。在其他實施方案中，植物發(fā)酵梭狀芽胞桿菌被用于發(fā)酵己糖和戊糖的酶的組合轉化。在一些實施方案中，可以實現提聞的終廣物生廣率。在另一個實施方案中，植物發(fā)酵梭狀芽胞桿菌用編碼一個或多個基因的異源多核苷酸轉化，所述一個或多個基因編碼用于多糖糖化的糖解酶，其中所述基因以足以賦予所述植物發(fā)酵梭狀芽胞桿菌轉化子與未轉化的予植物發(fā)酵梭狀芽胞桿菌相比增加的濃度、糖化速率或單糖、二糖或寡糖的產率使多糖糖化為單糖、二糖或寡糖的能力的水平表達。宿主產生糖解酶以及該糖解酶隨后釋放入培養(yǎng)基，減少了降解生物質或多糖成為可發(fā)酵單糖和寡糖所必需的商業(yè)酶的量。糖解DNA可以是宿主本身的，但更通常DNA是外來的，S卩外源的。有利的糖解基因包括纖維素分解、木聚糖分解和淀粉降解酶，例如纖維素酶、木聚糖酶、葡聚糖酶、葡糖苷酶和淀粉酶。糖解酶可以至少部分由宿主分泌，或者它可以大量地在細胞內累積以隨后釋放。有利地，熱穩(wěn)定的細胞內累積的酶可以在需要時通過熱誘導的溶胞來釋放。酶的組合可以由異源DNA編碼，一些異源DNA被分泌，而一些異源DNA被累積。在另一個實施方案中，可以做出其他修飾以增加重組微生物的終產物(例如乙醇)生成。在一個實施方案中，重組微生物可以進一步包含其他異源DNA區(qū)段，其表達產物是參與單糖和/或寡糖轉運進入重組宿主的蛋白。同樣，來自糖解途徑的其他基因可以被加入宿主。以這種方式，可以實現增加的乙醇生成速率。
為了提高發(fā)酵終產物(例如甲醇)的生成，可以在以下中進行修飾轉錄調節(jié)子，用于形成有機酸的基因，碳水化合物轉運基因，孢子形成基因，影響酶輔因子形成/再生的基因，影響乙醇耐受性的基因，影響鹽耐受性的基因，影響生長速率的基因，影響氧耐受性的基因，影響代謝物阻遏的基因，影響氫生成的基因，影響對重金屬耐受性的基因，影響對酸耐受性基因，或影響對醛耐受性的基因。本領域技術人員將理解可以對本文示例的方法進行許多修飾。例如，可以利用多種啟動子來驅動異源基因在重組植物發(fā)酵梭狀芽胞桿菌宿主中表達。受益于本公開內容的技術人員能夠容易選擇和利用可用于此目的的各種啟動子的任何一種。類似地，作為常規(guī)偏好的問題，技術人員可以利用較高拷貝數的質粒。在另一個實施方案中，可以制備用于期望基因染色體整合的構建體。外來基因的染色體整合可以提供超過基于質粒的構建的幾個優(yōu)點，基于質粒的構建對于商業(yè)化過程具有某些限制。產甲烷基因被染色體整合入大腸桿菌 B;參見 Ohta 等.(1991) Appl. Environ. Microbiol. 57 :893_900。一般而言，這通過 DNA 片段的純化來進行，所述DNA片段含有(I)來自抗生素抗性基因上游的期望基因和(2)來自靶生物體的異源DNA的片段。該DNA可以被連接形成無復制子的環(huán)并用于轉化。因此，感興趣的基因可以被引入異源宿主，例如大腸桿菌，并且短的隨機片段可以被分離并連接入植物發(fā)酵梭狀芽胞桿菌以促進同源重組。在其他實施方案中，可以不使用重組DNA技術而獲得可以表現出期望性質例如增加的生產率、增加的產率或增加的滴度的植物發(fā)酵梭狀芽胞桿菌分離株。例如，可以通過化學方式或通過微生物輻射來進行誘變或隨機誘變。然后，可以根據表現出一種或多種期望性質的有益突變來篩選被誘變的微生物群體。篩選可以通過在含有將在發(fā)酵生產終產物的過程中使用的碳源的底物上培養(yǎng)誘變微生物來進行。篩選還可以包括在生物體生長期間測量終產物生成，或者測量碳源的消化或同化。如此獲得的分離株可以進一步用重組多核苷酸轉化，或者與本文提供的任何方法和組合物組合使用，以進一步改善燃料生產。生物燃料廠和產生生物燃料的方法一方面，本文提供了包括用于水解包括高分子量碳水化合物的生物質材料的水解設備和用于容納培養(yǎng)基和其中分散的微生物的發(fā)酵罐的燃料廠。在一個實施方案中，微生物是植物發(fā)酵梭狀芽胞桿菌。另一方面，本文提供了制備燃料或化學終產物的方法，包括在培養(yǎng)基中混合微生物(例如植物發(fā)酵梭狀芽胞桿菌細胞或類似的C5/C6梭狀芽胞桿菌種)和木質纖維素材料(和/或其他生物質材料)，并在足以產生發(fā)酵終產物例如燃料(例如乙醇、丙醇、甲烷或氫)的條件和時間下發(fā)酵木質纖維素材料。在一些實施方案中，提供了使用酸水解預處理從生物質產生發(fā)酵終產物(例如乙醇或氫)的方法。在一些實施方案中，提供了使用酶水解預處理從生物質產生發(fā)酵終產物(例如乙醇或氫)的方法。在另一個實施方案中，提供了使用已經酶預處理的生物質從生物質產生發(fā)酵終產物(例如乙醇或氫)的方法。在另一個實施方案中，提供了使用已經化學或酶預處理但任選蒸汽處理的生物質從生物質產生發(fā)酵終產物(例如乙醇或氫)的方法。另一方面，本文提供了通過本文描述的任何方法制成的終產物。本領域技術人員將理解可以對本文示例的方法進行許多修飾。例如，可以利用多種啟動子來驅動異源基因在重組微生物(例如植物發(fā)酵梭狀芽胞桿菌)中表達。受益于本公開內容的技術人員能夠容易選擇和利用可用于此目的的各種啟動子的任何一種。類似地，作為常規(guī)偏好的問題，技術人員可以利用較高拷貝數的質粒。在另一個實施方案中，可以制備用于期望基因染色體整合的構建體。外來基因的染色體整合可以提供超過基于質粒的構建的幾個優(yōu)點，基于質粒的構建對于商業(yè)化過程具有某些限制。產甲烷基因被染色體整合入大腸桿菌 B ;參見 Ohta 等.(1991) Appl. Environ. Microbiol. 57 :893_900。一般而言，這通過DNA片段的純化來進行，所述DNA片段含有(I)來自抗生素抗性基因上游的期望基因和(2)來自靶生物體的異源DNA的片段。該DNA可以被連接形成無復制子的環(huán)并用于轉化。因此，感興趣的基因可以被引入異源宿主，例如大腸桿菌，并且短的隨機片段可以被分離并連接入植物發(fā)酵梭狀芽胞桿菌以促進同源重組。從生物質大規(guī)模生產發(fā)酵終產物
一方面，利用微生物例如植物發(fā)酵梭狀芽胞桿菌從生物質大規(guī)模生產發(fā)酵終產物(例如乙醇)。在一個實施方案中，首先將包括高分子量碳水化合物的生物質材料水解為低分子量碳水化合物，然后使用微生物細胞發(fā)酵低分子量碳水化合物以產生乙醇。在另一個實施方案中，發(fā)酵生物質材料本身而無化學和/或酶預處理。在第一方法中，水解可以使用酸例如布朗斯臺德酸(例如硫酸或鹽酸)、堿例如氫氧化鈉、熱液處理、蒸汽爆發(fā)、氨纖維爆發(fā)處理("AFEX")、石灰處理、酶、或這些的組合來完成。如果需要，氫和其他發(fā)酵產物可以被捕獲并純化，或者例如通過燃燒而處理掉。例如，氫氣可以被點燃，或者用作過程中的能源，例如以驅動蒸汽鍋爐，例如通過燃燒。生物質的水解和/或蒸汽處理可以例如增加生物質的孔隙率和/或表面積，通常使纖維素材料更多暴露于微生物細胞，這可以增加發(fā)酵速率和產率。木質素的去除可以例如提供用于驅動鍋爐的燃料，并且還可以例如增加生物質的孔隙率和/或表面積，經常增加發(fā)酵速率和產率。在一些實施方案中，培養(yǎng)基中碳水化合物的初始濃度大于20mM，例如大于30禮、501111、751111、1001111、1501111、2001111或甚至大于500mMo牛物質加工廠和從牛物質產牛產物的方法一方面，本發(fā)明特征為燃料廠，包括用于水解包括高分子量碳水化合物的生物質材料的水解設備，用于容納具有分散其中的C5/C6水解微生物(例如植物發(fā)酵梭狀芽胞桿菌)的培養(yǎng)基的發(fā)酵罐，和分離終產物與相關副產物和共產物的一個或多個產物回收系統(tǒng)。另一方面，本發(fā)明特征為制備終產物的方法，包括混合C5/C6水解微生物(例如植物發(fā)酵梭狀芽胞桿菌)和培養(yǎng)基中的生物質原料，并在足以產生生物燃料、化學產物或發(fā)酵終產物(例如乙醇、丙醇、氫、木質素、萜類等)的條件和時間下發(fā)酵生物質材料。另一方面，本發(fā)明特征為通過本文描述的任何方法制成的發(fā)酵終產物。從生物質大規(guī)模生產發(fā)酵終產物一般而言，有兩種基本方法利用C5/C6水解微生物(例如植物發(fā)酵梭狀芽胞桿菌)從生物質大規(guī)模生產一種或多種發(fā)酵終產物。在所有方法中，根據生物質類型及其物理表現，方法之一可以包括經由濕研磨或干研磨來磨碎含碳材料，以減少材料尺寸并增加表面體積比(物理改性)。在一個實施方案中，包含高分子量碳水化合物的生物質材料被水解以使其脫木質素或者以分離碳水化合物和非碳水化合物。使用熱、化學和/或酶處理的組合，水解的材料可以被分離以形成液體和脫水蒸汽，其可以被單獨處理并保持分離或重新組合，然后使用C5/C6水解微生物(例如植物發(fā)酵梭狀芽胞桿菌)發(fā)酵低分子量碳水化合物以產生一種或多種化學產物。在第二方法中，發(fā)酵生物質材料本身而無熱、化學和/或酶預處理。在第一方法中，水解可以使用酸(例如硫酸或鹽酸)、堿(例如氫氧化鈉)、熱液處理、氨纖維爆發(fā)處理("AFEX")、石灰處理、酶、或這些的組合來完成。生物質的水解和/或蒸汽處理可以例如增加生物質的孔隙率和/或表面積，常使纖維素材料更多暴露于C5/C6水解微生物(例如植物發(fā)酵梭狀芽胞桿菌)，這可以增加發(fā)酵速率和產率。生物質的水解和/或蒸汽處理可以例如產生副產物或共產物，其可以被分離或處理以提高發(fā)酵速率和產率，或者用于產能以驅動過程，或者經進一步加工或無需進一步加工而用作產品。木質素的去除可以例如提供用于驅動鍋爐的燃料。如果需要，發(fā)酵產物氣體(例如甲烷、氫或CO2)、液體(例如乙醇和有機酸)或固體(例如木質素)可以被捕獲并純化，或者例如通過燃燒處理掉。例如，氫氣可以被點燃，或例如通過燃燒用作過程中的能源以例如驅動蒸汽鍋爐。從發(fā)酵罐排 出的產物可以被進一步加工，例如乙醇可以被轉移至蒸餾和精餾，產生濃縮的乙醇混合物，或者固體可被分離用于提供能源或作為化學產物。在一些實施方案中，預處理包括用酸預處理的步驟。在一些實施方案中，酸是稀酸。在一些實施方案中，酸處理在約85至140°C之間的升高溫度下進行。在一些實施方案中，方法還包括例如使用濾網回收酸處理的生物質固體。在一些實施方案中，濾網包括直徑大約150-250微米的開口。在一些實施方案中，方法還包括用水或其他溶劑洗滌酸處理的生物質。在一些實施方案中，方法還包括用堿中和酸。在一些實施方案中，方法還包括干燥酸處理的生物質。在一些實施方案中，干燥步驟在約15-45°C之間的升高溫度下進行。在一些實施方案中，分離的材料的液體部分被進一步處理以除去毒性材料。在一些實施方案中，液體部分與固體分離，然后單獨發(fā)酵。在一些實施方案中，從酸處理形成固體和液體的漿體，然后一起發(fā)酵。圖11描繪通過用酸在升高的溫度和壓力下在水解設備中處理生物質而從生物質產生化學產物的方法的實例。生物質可以首先通過添加熱水或蒸汽來加熱。生物質可以通過將氣體二氧化硫鼓泡經過懸浮于水中的生物質或者通過添加強酸例如硫酸、鹽酸或硝酸來酸化，添加或不添加預熱/預蒸汽/水。酸化過程中，pH保持在低水平，例如低于約5。溫度和壓力可以在酸添加之后被升高。除了已經在酸化設備中的酸外，任選地，可以添加金屬鹽例如硫酸亞鐵、硫酸鐵、氯化鐵、硫酸鋁、氯化鋁、硫酸鎂或這些的混合物以輔助生物質的水解。含酸的生物質被添加入預處理設備的水解部分。蒸汽被注入預處理設備的水解部分以直接接觸并加熱生物質至期望的溫度。添加蒸汽之后的生物質溫度在例如約130°C和220°C。然后將水解產物排入預處理設備的閃蒸罐部分，并在罐內保持一段時間以進一步水解生物質成寡糖和單糖。也可以使用蒸汽爆發(fā)來進一步分解生物質?？蛇x地，對于任何高壓預處理過程，生物質可以通過空氣閥排放。然后水解產物從預處理反應器排放，添加或不添加水，例如固體濃度為約15%至60%。預處理之后，生物質可以被脫水和/或用一定量的水洗滌，例如通過擠壓或通過離心，或者通過過濾，使用例如逆流提取器、壓洗器、壓濾器、壓力過濾器、螺旋運輸提取器或真空皮帶提取器以除去酸化流體。經或不經進一步處理例如添加堿(例如石灰)和或氨(例如磷酸銨)，酸化流體可以例如在預處理設備的酸化部分中被重復使用，或者被添加至發(fā)酵，或者被收集用于其它用途/處理。產物可以衍生自酸化流體的處理，例如石膏或磷酸銨。酶或酶混合物可以在預處理期間添加以幫助高分子量組分的水解，例如對纖維素、半纖維素、果膠和淀粉組分活性的內切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶(CBH)、β-葡糖苷酶、糖苷水解酶、糖基轉移酶、裂合酶和酯酶。發(fā)酵罐被添加水解的生物質、來自生物質預處理的任何液體級分、植物發(fā)酵梭狀芽胞桿菌細胞的活性種子培養(yǎng)物、可能需要的輔助發(fā)酵微生物，例如酵母或大腸桿菌，和可能需要的促進植物發(fā)酵梭狀芽胞桿菌或其他微生物生長的營養(yǎng)素。可選地，預處理的生物質或液體級分可以被分入多個發(fā)酵罐，每個發(fā)酵罐含有不同菌株的植物發(fā)酵梭狀芽胞桿菌和/或其他微生物，并且每個發(fā)酵罐在特定物理條件下操作。允許發(fā)酵進行一段時間，例如約15至150小時，同時保持溫度在例如約25°C至50°C。發(fā)酵期間產生的氣體從發(fā)酵罐吹掃并排放、收集或點燃，有或沒有其他處理，例如氫氣可以被收集并用作能源或純化為共產物。發(fā)酵后，發(fā)酵罐內容物被轉移至產物回收。產物被提取，例如乙醇通過蒸餾和精餾回收。 無預處理從牛物質化學牛產圖12描繪了通過將生物質裝入發(fā)酵容器而從生物質產生化學品的方法。生物質可以被允許浸泡一段時間，添加或不添加熱、水、酶或酸/堿。加工容器中的壓力可以保持在大氣壓或之上。可以在預處理期末添加酸或堿以中和。在預處理期末，或者在預處理開始的同時，添加C5/C6水解微生物(例如,植物發(fā)酵梭狀芽胞桿菌)的活性種子培養(yǎng)物、可能需要的輔助發(fā)酵微生物，例如酵母或大腸桿菌，和可能需要的促進C5/C6水解微生物(例如，植物發(fā)酵梭狀芽胞桿菌)生長的營養(yǎng)素。如上所述進行發(fā)酵。發(fā)酵后，發(fā)酵罐內容物被轉移至如上所述的產物回收。可以使用化學生產方法和/或特征的任何組合以產生組合生產方法。在本文所述方法的任何一種中，產物可以在任何步驟被去除、添加或組合。C5/C6水解微生物(例如，植物發(fā)酵梭狀芽胞桿菌)可以單獨使用或者與一種或多種其他微生物(例如酵母、真菌或其他細菌)組合協(xié)同使用。在一些實施方案中，不同方法可以用于單一工廠以產生不同終產物。另一方面，本發(fā)明特征為包括用于水解包括高分子量碳水化合物的生物質材料的水解設備和用于容納培養(yǎng)基和其中分散的C5/C6水解微生物(例如，植物發(fā)酵梭狀芽胞桿菌)的發(fā)酵罐的燃料廠。另一方面，本發(fā)明特征為制備燃料的方法，包括在培養(yǎng)基中混合C5/C6水解微生物(例如，植物發(fā)酵梭狀芽胞桿菌)和木質纖維素材料(和/或其他生物質材料)，并在足以產生燃料例如乙醇、丙醇和/或氫或另一種化合物的條件和時間下發(fā)酵木質纖維素材料。
在一些實施方案中，本發(fā)明提供了使用酸水解預處理從生物質生產乙醇和氫的方法。在一些實施方案中，本發(fā)明提供了使用酶水解預處理從生物質生產乙醇和氫的方法。其他實施方案提供了使用未經酶預處理的生物質從生物質生產乙醇和氫的方法。其他實施方案公開了使用已經化學或酶預處理但任選蒸汽處理的生物質從生物質產生乙醇和氫的方法。 圖10公開了產生己糖或戊糖或寡聚體的預處理，其然后不經處理或進一步處理并單獨或一起發(fā)酵。圖IOA描繪了產生固相和液相的方法(例如酸預處理)，其然后被單獨發(fā)酵。圖IOB描繪了產生固相和液相的類似預處理。液相與固相分離，并且對于發(fā)酵微生物毒性的成分在發(fā)酵之前被去除。在發(fā)酵開始時，兩相被重新組合并在一起共發(fā)酵。這是比單獨發(fā)酵每個相更有經濟效益的方法。第三方法(圖IOC是成本最低的)。預處理產生液體或固體的漿體，其然后被共發(fā)酵。存在很少的糖分損失和最小的設備需求。
實施例實施例I :牛物質加工和預處理稈序 玉米秸桿在切碎機中切碎至O. 25英寸大小，然后通過2mm濾網篩選。篩選的玉米秸桿與水混合以制備10% (w/v)漿體。玉米秸桿漿體的堿消化在高壓釜中121°C和15PSI下使用O. 2g NaOH每克玉米秸桿進行2小時。消化的玉米秸桿用自來水(5-7體積)洗滌以中和pH。中和后，固體通過250微米濾網過濾回收并在35攝氏度干燥至濕量約5%。干燥的團簇在添加至發(fā)酵罐之前被研磨。培養(yǎng)基的脫氣和滅菌程序:所有用于接種物繁殖的血清瓶在室溫下真空(約400mbar絕對壓力)脫氣約5分鐘，在氮氣吹掃下真空破碎。進行最少三個脫氣循環(huán)。血清瓶、培養(yǎng)基和發(fā)酵容器通過在121°C溫度和15PSI壓力下高壓滅菌來滅菌。發(fā)酵罐在接種之前用氮氣吹掃I小時以降低氧化還原電勢至大約_300mV。接種物繁殖植物發(fā)酵梭狀芽胞桿菌的冷凍培養(yǎng)物將在含有O. 3%纖維素二糖和在去離子水中的 I. 5g/L KH2PO4,2. 9g/L K2HP04、4. 6g/L 硫酸銨、2g/L 半胱氨酸-HC1、lg/L MgCl2 6H20、
0.15g/L CaCl2 2Η20、0· 00125g/L FeSO4 7H20 的 IOmL 管中 35°C下繁殖 48 小時。用 2N NaOH調節(jié)培養(yǎng)基的pH至7. 5。在測試管中繁殖后，接種物將在IOOmL血清瓶中35°C生長24小時，使用2% (v/v)種子量。血清瓶具有在去離子水中的20g/L麥芽糖漿、I. 5g/L KH2PO4,2. 9g/L K2HP04、4. 6g/L 硫酸銨、2g/L 半胱氨酸-HCl、3g/L 檸檬酸鈉、lg/L MgCl2 6Η20、0· 15g/LCaCl2 2Η20、0· 00125g/L FeSO4 7Η20。生物質的同時水解和發(fā)酵:5L攪拌的罐反應器以補料分批模式以2L起始體積運行。培養(yǎng)基含有50g/L預處理的玉米秸桿以及溶解于去離子水的3g/L K2HPO4U. 6g/L KH2PO4、2g/L檸檬酸鈉· 2H20、
1.2g/L 檸檬酸 Η20、0· 5g/L (NH4)2SO4'lg/L NaCl、0· 8g/L MgCl2 · 6Η20、0· lg/L CaCl2 · 2H20、0. 00125g/L FeSO4 WH2OUg/!半胱氨酸 HCl、10g/L 酵母提取物(Bacto)以及 5g/L 玉米漿粉。在一些情況下，50mL CelluSeb-TL在接種之前通過O. 2微米濾器添加至發(fā)酵罐以增強水解并增加產率。然后發(fā)酵罐用氮氣吹掃I小時以降低氧化還原電勢至大約_300mV，隨后接種20ml濃縮接種物。運行pH和溫度分別是6. 5和35 °C，并且發(fā)酵罐以300rpm連續(xù)攪拌。25-50g預處理的玉米秸桿的團塊以規(guī)律的時間間隔提供。7. 5和25mL酶的額外劑在接種后72小時和240小時提供。樣品收集和分析:
樣品以時間間隔收集并使用裝配有Aminex HPX-87H Exclusion柱(300mmx7. 8mm)和RI檢測器的HPLC分析糖、有機酸和乙醇。O. OlN H2SO4用作流動相，O. 6mL/分鐘，并且柱保持在55 °C。益果發(fā)酵開始于添加50g/L固體。額外批量補料25g/L預處理的玉米秸桿固體在第3天和第4天進行。發(fā)現初始乙醇生產率是約10g/L-d，這在不進一步添加玉米秸桿的情況下在第4天至第8天下降至約2g/L-d。從第9天開始，固體批量補料量減至12. 5g/L,并每24小時提供，如圖I所示。這幫助提高乙醇生產率至高于3g/L-d。乙醇是主要的發(fā)酵產物。預處理玉米秸桿的組成分析使用酸分析進行。組成分析結果顯不甸聚糖、木聚糖、阿拉伯聚糖和不溶物的百分比分別是64*%、26 *%、3和6(圖2)。基于該組成，在預處理玉米秸桿中可發(fā)酵的量是約93%。假設糖化效率是90%，觀察的乙醇產率被計算為每克加載的生物質O. 39g。
實施例2從己糖和戊糖生產乙醇通過使用植物發(fā)酵梭狀芽胞桿菌在攪拌的罐反應器中同時發(fā)酵己糖(葡萄糖、纖維素二糖)和戊糖(木糖和阿拉伯糖)來進行分批發(fā)酵以生產乙醇。使用的化學品:該實驗中使用的所有化學品是試劑級，來自Sigma-Aldrich。脫氣和滅菌程序所有用于接種物繁殖的反應器和血清瓶在室溫下真空(約400mbar絕對壓力)脫氣約5分鐘，在氮氣吹掃下真空破碎。進行最少三個脫氣循環(huán)。容器通過在121°C溫度和15PSI壓力下高壓滅菌來滅菌。接種物繁殖植物發(fā)酵梭狀芽胞桿菌的冷凍培養(yǎng)物將在含有O. 3%纖維素二糖和在去離子水中的 I. 5g/L KH2PO4,2. 9g/L K2HP04、4. 6g/L 硫酸銨、2g/L 半胱氨酸-HC1、lg/L MgCl2 6H20、0. 15g/L CaCl2 2Η20、0· 00125g/L FeSO4 7H20 的 IOmL 管中 35°C下繁殖 48 小時。用 2N NaOH調節(jié)培養(yǎng)基的pH至7. 5。在高壓滅菌后，接種物在IOOmL血清中35°C生長24小時，使用2%(v/v)種子量。血清瓶含有在去離子水中的20g/L麥芽糖漿、I. 5g/L KH2PO4,2. 9g/L K2HPO4,
4.6g/L硫酸銨、2g/L半胱氨酸-HCl、3g/L檸檬酸鈉、lg/L MgCl2 6H20、0. 15g/L CaCl2 2H20、0. 00125g/L FeSO4 7H20。擴增的接種物被檢查純度并在3000rpm離心15分鐘以產生IOmL濃縮的生物質(2-4g/L總懸浮固體)以用作每個發(fā)酵罐的接種物。B糖和戊糖的同時發(fā)酵:400mL工作體積的兩個攪拌罐反應器以分批模式運行。在生物反應器BRl中，30g/L纖維素二糖和30g/L木糖用作碳源，以及溶于去離子水的3g/L K2HPO4U. 6g/L KH2PO4,2g/L 檸檬酸鈉· 2Η20、1· 2g/L 檸檬酸 Η20、0· 5g/L(NH4)2SO4、lg/L NaCl,0. 8g/L MgCl2 · 6H20、0. lg/L CaCl2 · 2H20、0. 00125g/L FeSO4 · 7H20、lg/L 半胱氨酸 HClUOg/L 酵母提取物(Bacto)以及5g/L玉米漿粉。第二反應器BR2含有作為碳源的30g/L的葡萄糖和30g/L的木糖，以及與BRl相同的營養(yǎng)素。每個發(fā)酵罐接種IOml接種物。發(fā)酵罐在35°C和pH 6.5下運行，并300rpm連續(xù)攪拌。樣品以不同的時間間隔收集并使用裝配有Aminex HPX-87H Exclusion柱(300mmx7. 8mm)和RI檢測器的HPLC分析糖、有機酸和乙醇。O. 005N H2SO4用作流動相，O. 6mL/分鐘，并且柱保持在55 °C。顯示于表I和圖3A和3B的結果描繪了在發(fā)酵過程中己糖和戊糖底物的充分利用和這些底物轉化為乙醇。結果還表明，戊糖(例如木糖)至少與己糖(例如纖維素二糖或葡萄糖)一樣快速且完全地轉化為乙醇。表I.糖和乙醇的濃度

權利要求
1.一種通過用第一微生物發(fā)酵包含己糖和戍糖的木質纖維素生物質來制備一種或多種發(fā)酵終產物的方法，其中所述第一微生物同時水解和發(fā)酵所述木質纖維素生物質以產生發(fā)酵終產物。
2.權利要求I所述的方法，其中所述發(fā)酵終產物的至少一種是乙醇，并且其中乙醇以至少約45g/L的滴度被制備。
3.權利要求I所述的方法，其中所述第一微生物是梭狀芽胞桿菌屬菌株。
4.權利要求3所述的方法，其中所述梭狀芽胞桿菌屬菌株是植物發(fā)酵梭狀芽胞桿菌。
5.權利要求I所述的方法，其中所述方法還包括使用第二微生物發(fā)酵己糖和戊糖。
6.權利要求5所述的方法，其中所述第二微生物是釀酒酵母、熱梭狀芽胞桿菌、丙酮丁醇梭狀芽胞桿菌、噬纖維梭狀芽胞桿菌或運動發(fā)酵單胞菌。
7.權利要求I所述的方法，其中所述己糖包括選自由纖維素、半纖維素、淀粉、甘露聚糖、果糖、葡萄糖、半乳糖、鼠李糖和甘露糖組成的組的碳水化合物。
8.權利要求I所述的方法，其中所述戊糖包括選自由木聚糖、半纖維素、木糖和阿拉伯糖組成的組的碳水化合物。
9.權利要求4所述的方法，其中所述植物發(fā)酵梭狀芽胞桿菌是非重組或重組微生物。
10.權利要求4所述的方法，其中所述植物發(fā)酵梭狀芽胞桿菌包括一種或多種異源多核苷酸。
11.權利要求I所述的方法，還包括在所述第一微生物生長過程中向培養(yǎng)基添加一種或多種包括己糖或戊糖的培養(yǎng)基補充物。
12.權利要求11所述的方法，其中所述己糖或戊糖相對于被所述第一微生物轉化為其他化合物的糖量來添加。
13.權利要求I所述的方法，還包括預處理所述生物質。
14.權利要求I所述的方法，其中所述預處理包括蒸汽爆發(fā)或熱水浸提、暴露于酸或堿條件。
15.權利要求I所述的方法，還包括添加發(fā)酵培養(yǎng)基補充物，其中所述發(fā)酵培養(yǎng)基補充物是脂肪酸、表面活性劑、螯合劑、微生物、礦物質、PH調節(jié)劑、酵母提取物和鹽。
16.權利要求I所述的方法，其中所述第一微生物同時發(fā)酵所述己糖和戊糖。
17.權利要求I所述的方法，還包括添加一種或多種酶，其中所述一種或多種酶不是衍生自第一微生物。
18.權利要求17所述的方法，其中所述一種或多種酶是纖維素酶、半纖維素酶、半乳糖醛酸酶、果膠酸裂合酶、糖酶、木聚糖酶、葡聚糖酶、和內切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、葡糖苷酶、淀粉酶、肌醇六磷酸酶或漆酶。
19.權利要求I所述的方法，其中所述己糖和戊糖包括麥芽糖漿、玉米浸潰液體、蒸餾干燥顆?；蛴衩捉⒐腆w。
20.權利要求I所述的方法，其中所述方法還包括批量添加生物質固體的生物質補料分批發(fā)酵。
21.權利要求I所述的方法，其中所述生物質固體使用濾網回收。
22.權利要求21所述的方法，其中所述濾網包括多個直徑約150-250微米的孔。
23.一種通過在包含木質纖維素生物質的培養(yǎng)基中培養(yǎng)植物發(fā)酵梭狀芽胞桿菌菌株而制備的生物燃料產物；其中所述植物發(fā)酵梭狀芽胞桿菌同時水解和發(fā)酵所述木質纖維素生物質。
24.一種制備乙醇的方法，所述方法包括以下步驟 a)在包含木質纖維素生物質的培養(yǎng)基中培養(yǎng)植物發(fā)酵梭狀芽胞桿菌菌株；其中所述植物發(fā)酵梭狀芽胞桿菌同時水解和發(fā)酵所述木質纖維素生物質；和 b)以大于約45g/L的產率制備乙醇。
25.權利要求24所述的方法，還包括在所述植物發(fā)酵梭狀芽胞桿菌的生長過程中向培養(yǎng)基添加一種或多種培養(yǎng)基補充物，其中所述培養(yǎng)基補充物的一種或多種包含一種或多種己糖和/或戊糖化合物，并且一種或多種糖化合物相對于被所述植物發(fā)酵梭狀芽胞桿菌轉化為其他化合物的糖量來添加。
26.—種用于制備發(fā)酵終產物的系統(tǒng),包括 a)發(fā)酵容器； b)木質纖維素生物質；和 c)同時水解和發(fā)酵所述木質纖維素生物質的第一微生物；其中所述發(fā)酵容器適于提供適合同時水解和發(fā)酵所述木質纖維素生物質的條件。
27.權利要求26所述的系統(tǒng)，還包括包含己糖和戊糖的培養(yǎng)基補充物。
28.權利要求26所述的系統(tǒng)，其中所述第一微生物是梭狀芽胞桿菌屬菌株。
29.權利要求26所述的系統(tǒng)，其中所述梭狀芽胞桿菌屬菌株是植物發(fā)酵梭狀芽胞桿菌。
30.權利要求29所述的系統(tǒng)，其中所述植物發(fā)酵梭狀芽胞桿菌包括一種或多種異源多核苷酸。
31.權利要求26所述的系統(tǒng)，其中所述生物質在與所述第一微生物接觸之前通過蒸汽爆發(fā)或熱水浸提、暴露于酸或堿條件來預處理。
32.權利要求31所述的系統(tǒng)，其中經預處理的生物質進一步用非衍生自所述第一微生物的一種或多種酶處理。
33.權利要求27所述的系統(tǒng)，其中所述己糖和戊糖包括玉米浸潰固體、玉米浸潰液體、麥芽糖漿、木聚糖、纖維素、半纖維素、果糖、葡萄糖、甘露糖、鼠李糖或木糖的一種或多種。
34.權利要求26所述的系統(tǒng)，其中所述發(fā)酵培養(yǎng)基還包括非衍生自所述第一微生物的一種或多種酶。
35.權利要求26所述的系統(tǒng)，其中所述發(fā)酵培養(yǎng)基還包括選自由脂肪酸、表面活性劑、螯合劑、維生素、礦物質、PH調節(jié)劑、酵母提取物和鹽組成的組的發(fā)酵培養(yǎng)基補充物。
36.權利要求26所述的系統(tǒng)，還包括第二微生物。
37.權利要求36所述的系統(tǒng)，其中所述第二微生物是釀酒酵母、熱梭狀芽胞桿菌、丙酮丁醇梭狀芽胞桿菌、噬纖維梭狀芽胞桿菌或運動發(fā)酵單胞菌。
全文摘要
一方面，本發(fā)明涉及通過微生物例如植物發(fā)酵梭狀芽胞桿菌同時水解和發(fā)酵而從生物質制備有用的發(fā)酵終產物。本發(fā)明還涉及發(fā)展有效預處理和高轉化效率(產率)轉化木質纖維素生物質為終產物的方法。另一方面，本文公開了通過用微生物例如植物發(fā)酵梭狀芽胞桿菌發(fā)酵己糖(C6)和戊糖(C5)而產生發(fā)酵終產物的方法。
文檔編號C12P7/10GK102985550SQ201080017643
公開日2013年3月20日 申請日期2010年4月20日 優(yōu)先權日2009年4月20日
發(fā)明者S·帕瑞克, W·G·拉圖夫 申請人:奎特羅斯公司