專利名稱：鑒別杉木無(wú)性系開(kāi)天3號(hào)的分子特異性標(biāo)記引物及方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一對(duì)鑒別杉木無(wú)性系開(kāi)天3號(hào)的分子特異性標(biāo)記引物，以及利用該引 物對(duì)杉木無(wú)性系開(kāi)天3號(hào)進(jìn)行快速鑒定的方法。
背景技術(shù)：
杉木(Cunninghamialanceolata(Lamb.)Hook.)是我國(guó)南方省(區(qū))主要用材、造 林樹(shù)種，其栽培歷史悠久，自然分布區(qū)域廣泛，生態(tài)環(huán)境多樣。自20世紀(jì)50年代以來(lái)，以穗 條扦插方式進(jìn)行的杉木無(wú)性系育種工作逐漸開(kāi)展起來(lái)，杉木無(wú)性系苗造林在福建、湖南、浙 江、廣西等省區(qū)也隨之得到發(fā)展。杉木萌芽性強(qiáng)、易于無(wú)性系繁殖，其無(wú)性系個(gè)體在形態(tài)特 征上高度相似，傳統(tǒng)的形態(tài)特征識(shí)別方法由于易受樹(shù)齡和環(huán)境的影響，很難對(duì)其進(jìn)行準(zhǔn)確 的分類鑒定。此外，近年來(lái)各杉木產(chǎn)區(qū)、科研機(jī)構(gòu)間開(kāi)展杉木育種材料的交流及引種調(diào)撥頻 繁，再加上各自命名等原因，不僅造成了一定程度上杉木優(yōu)良無(wú)性系的種源難以區(qū)分辨別， 也導(dǎo)致了在管理和利用上的混亂局面。開(kāi)天3號(hào)是經(jīng)過(guò)國(guó)家鑒定過(guò)的優(yōu)良杉木無(wú)性系，10年生每畝年生產(chǎn)木材2立方米 (蓄積)，平均樹(shù)高13. 5米，胸徑15. 4厘米，是普通杉木速生豐產(chǎn)林的3倍多。而且其具有 木質(zhì)不易開(kāi)裂，抗病蟲(chóng)能力強(qiáng)等特點(diǎn)。是浙江西部最主要的造林無(wú)性系。但是由于開(kāi)天3 號(hào)于其他杉木無(wú)性系在形態(tài)上極為相似，不易區(qū)分辨別，影響杉木的推廣與造林生產(chǎn)工作。 因此對(duì)開(kāi)天3號(hào)無(wú)性系的準(zhǔn)確鑒別不僅有利于我國(guó)杉木資源的保護(hù)、發(fā)掘與利用，而且對(duì) 于指導(dǎo)當(dāng)前的杉木造林、更好地發(fā)揮杉木在我國(guó)林業(yè)生產(chǎn)上的巨大作用具有重要的現(xiàn)實(shí)意 義。杉木研究在目前已達(dá)到分子水平，并已取得一些成效，但在杉木無(wú)性系的分子識(shí) 別上，目前應(yīng)用的RAPD、ISSR技術(shù)并不理想，不夠便捷。其中，RAPD標(biāo)記的競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)導(dǎo)致其 重復(fù)性和穩(wěn)定性較差，而且檢測(cè)到的譜帶通常有5 10條；ISSR在應(yīng)用上需要反復(fù)摸索建 立最適的反應(yīng)條件，而且不同ISSR標(biāo)記的反應(yīng)條件不同。顯然，以杉木無(wú)性系的分子識(shí)別、 鑒定為目的，理想的分子手段應(yīng)該是針對(duì)不同的杉木無(wú)性系設(shè)計(jì)不同的特異引物，以特異 引物的PCR檢測(cè)獲得的穩(wěn)定DNA譜帶作為特異指紋用于杉木無(wú)性系的可靠識(shí)別與鑒定。SCAR(特征性片段擴(kuò)增區(qū)域)標(biāo)記是1993年由Paran和Michelmore在RAPD基礎(chǔ) 上提出的，它基于對(duì)特異RAPD片段的測(cè)序，根據(jù)兩端序列設(shè)計(jì)一對(duì)18 24堿基的引物，在 較高的退火溫度下進(jìn)行特異擴(kuò)增實(shí)現(xiàn)的，其專一性引物的采用排除了隨機(jī)引物結(jié)合位點(diǎn)之 間的競(jìng)爭(zhēng)，因而它是一種十分穩(wěn)定的分子標(biāo)記，在應(yīng)用上具有迅速、簡(jiǎn)便、低成本的特點(diǎn)。到 目前為止，在我國(guó)杉木種質(zhì)資源的研究上，除建立了杉木種子隨體染色體的二對(duì)SCAR標(biāo)記 外，SCAR標(biāo)記尚未用于杉木種質(zhì)資源間的分子識(shí)別與鑒定。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一種可區(qū)別杉木無(wú)性系開(kāi)天3號(hào)的分子特異性標(biāo)記引物，以及 一種利用該引物對(duì)杉木無(wú)性系開(kāi)天3號(hào)進(jìn)行快速辨別的方法。
本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一種鑒別杉木無(wú)性系開(kāi)天3號(hào)的分子特異性標(biāo)記引物，所述引物序列如下上游引物5‘ -TCGCCCAGTCGATCAGATAA-3 ‘下游引物5'-TCGCCCAGTCCACCCTCA-3‘。該引物對(duì)是采用PCR技術(shù)，經(jīng)過(guò)大量篩選試驗(yàn)，采用RAPD標(biāo)記獲得杉木無(wú)性系開(kāi) 天3號(hào)的差異DNA片段，將該片段克隆測(cè)序，以得到DNA序列為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)特異性引物。以該 引物對(duì)對(duì)杉木無(wú)性系開(kāi)天3號(hào)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，可從杉木無(wú)性系開(kāi)天3號(hào)中獲得1211bp大小 的特異性片段。本發(fā)明還涉及利用所述分子特異性標(biāo)記引物對(duì)杉木無(wú)性系開(kāi)天3號(hào)進(jìn)行快速鑒 別的方法，所述方法包括提取待測(cè)杉木基因組DNA作為模板、以所述分子特異性標(biāo)記引物 作為擴(kuò)增引物，配制PCR反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)，若電泳結(jié)果出 現(xiàn)1211bp的DNA條帶，則待測(cè)杉木品種為杉木無(wú)性系開(kāi)天3號(hào)，所述分子特異性標(biāo)記引物 序列為上游引物5‘ -TCGCCCAGTCGATCAGATAA-3 ‘下游引物5'-TCGCCCAGTCCACCCTCA-3‘。所述方法關(guān)鍵在于擴(kuò)增引物的選擇，DNA提取、PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件確定，以 及電泳檢測(cè)，均可按照本領(lǐng)域常規(guī)方法進(jìn)行。此外，需要說(shuō)明的是，本發(fā)明分子特異性標(biāo)記引物和檢測(cè)方法僅適用于杉木無(wú)性 系開(kāi)天3號(hào)的區(qū)分，即待測(cè)杉木無(wú)性系是限定為杉木無(wú)性系開(kāi)天3號(hào)的范圍內(nèi)。由于杉木之 間形態(tài)特征差異非常小，市場(chǎng)上將杉木區(qū)分辨別錯(cuò)誤的情況時(shí)有發(fā)生，而采用本發(fā)明方法， 可對(duì)杉木無(wú)性系開(kāi)天3號(hào)進(jìn)行快速區(qū)分和鑒定，方法簡(jiǎn)單、快捷、準(zhǔn)確。優(yōu)選的，所述PCR反應(yīng)體系每20 u 1組成如下PCR Buffer 終濃度為 IXdNTPs各 1.0 2.0mMMgCl21. 5 2. OmMTaqDNA 酶 1 5U上、下游引物各0. 5 0. 8iiM模板 DNA60 80ngddH20 補(bǔ)足至 20 ii 1 ；PCR反應(yīng)條件如下94°C預(yù)變性 6min 后；94°C變性 40s，63°C退火 40s，72°C延伸 2min，共 28 個(gè)循環(huán)； 最后于72°C補(bǔ)平7min，終止溫度為4°C。PCR Buffer終濃度為IX，是指PCR Buffer中各組分在反應(yīng)體系中的濃度與 1XPCR Buffer相同，通常選用體積為反應(yīng)體系體積1/10的10XPCR Buffer。10XPCR Buffer 成分為100mM Tris-HCl (pH8. 5)、500mMKCl、25mM MgCl2 和 1. 0% Triton-X-100，溶 劑為ddH20。具體的，所述方法如下(1)取待測(cè)杉木幼嫩葉片，以SDS-CTAB法提取待測(cè)杉木基因組DNA ；(2)以步驟(1)提取的基因組DNA為模板，以所述分子特異性標(biāo)記引物作為擴(kuò)增引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增 PCR反應(yīng)體系組成如下10XPCR Buffer 2 u 110mM dNTPs3. 2 u 125mM MgCl21. 5u 15U/ u L Taq DNA 酶 0. 5 ii 125iiM上、下游引物各0.5 ill20ng/ u L 模板 DNA 3 u 1ddH20 補(bǔ)足至 20u 1 ；PCR反應(yīng)條件如下94°C預(yù)變性 6min 后；94°C變性 40s，63°C退火 40s，72°C延伸 2min，共 28 個(gè)循環(huán)； 最后于72°C補(bǔ)平7min，終止溫度為4°C ；(3)取步驟(2)擴(kuò)增產(chǎn)物5 iU，與1 ill 0. 25%溴酚蘭緩沖液混勻，點(diǎn)樣于1. 5% 的瓊脂糖凝膠上，于1 XTAE緩沖液中、5V/cm電壓下電泳，電泳結(jié)束后EB染色，于自動(dòng)凝膠 圖像分析儀上照相，若電泳結(jié)果出現(xiàn)1211bp的DNA條帶，則待測(cè)杉木為無(wú)性系開(kāi)天3號(hào)。所述EB染色為在含0. 5 u g/ml EB的水溶液中染色30分鐘。本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在本發(fā)明檢測(cè)方法與常規(guī)形態(tài)學(xué)檢測(cè)相比，具有檢 測(cè)時(shí)間短，準(zhǔn)確性高的優(yōu)點(diǎn)；本發(fā)明方法檢測(cè)所需時(shí)間只要1 2天。


圖1為對(duì)杉木無(wú)性系進(jìn)行PCR擴(kuò)增的結(jié)果；M :Marker,即DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；12 開(kāi) 天3號(hào)；箭頭所指為編號(hào)為12的杉木無(wú)性系開(kāi)天3號(hào)擴(kuò)增出的分子量為1211bp的特殊DNA 條帶。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于 此實(shí)施例1 (1)以杉木幼嫩葉子提取基因組DNA，采用SDS-CTAB法，并使用DNA純化試劑盒 (杭州博日科技有限公司)對(duì)提取的DNA進(jìn)行純化。純化的基因組DNA先用1. 5%的瓊脂糖 凝膠電泳定性檢測(cè)，再用DNA/RNA紫外分光光度計(jì)(GeneQuant Pro，GE Healthcare公司) 定量檢測(cè)。DNA提取物于-20。C冰箱貯藏備用。(2)設(shè)計(jì)特異PCR擴(kuò)增引物，引物對(duì)的序列為上游引物 5' -TCGCCCAGTCGATCAGATAA-3 ‘和下游引物 5' -TCGCCCAGTCCACCCTCA-3 ‘，由上海生物 工程技術(shù)有限公司合成。(3)50六1 分子標(biāo)記的？0 擴(kuò)增10\卩0 Buffer 2u 1,10mM dNTPs (dATP、dCTP、 dGTP、dTTP 各 10mM)3. 2ii l，25mM MgCl2l. 5u l,5U/u ITaq DNA 酶(杭州博日科技有限公 司)0. 5 ill，25 ii M 特異引物對(duì)各 0. 5 ill，20ng/ u 1 模板 DNA 3u 1, ddH20 補(bǔ)足至 20 yl。擴(kuò) 增反應(yīng)在TC-XP型擴(kuò)增儀(杭州博日科技有限公司)上進(jìn)行。94°C預(yù)變性6min后；94°C
6變性40s，63°C退火40s，72°C延伸2min，共28個(gè)循環(huán)；最后于72°C補(bǔ)平7min，終止溫度為
4°C。(4)電泳檢測(cè)取步驟(3)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物5ul,與lul 0. 25%溴酚蘭緩沖液混勻， 點(diǎn)樣于1. 5%的瓊脂糖凝膠上，于1XTAE緩沖液中，5V/cm電壓下電泳，電泳結(jié)束后，在含 0.5ug/ml EB的水溶液中染色30分鐘，然后在上海培清JS-380A自動(dòng)凝膠圖像分析儀上照相。按照上述方法，分別對(duì)多個(gè)杉木無(wú)性系(編號(hào)1 20代表杉木無(wú)性系依次為1 龍15號(hào)；2 湘5號(hào)；3 黔2號(hào)；4 福建1號(hào)；5 浙江15號(hào)；6 湘23號(hào)；7 湘4號(hào)；8 浙江 16號(hào)；9 湘3號(hào)；10 浙江5號(hào)；11 浙江13號(hào)；12 開(kāi)天3號(hào)；13 黔4號(hào)；14 浙江4號(hào)； 15 湘1號(hào)；16 湘12號(hào)；17 浙江8號(hào)；18 浙江14號(hào)；19 浙江7號(hào)；20 浙江2號(hào))進(jìn)行 檢測(cè)，電泳結(jié)果見(jiàn)圖1。其中編號(hào)為12的開(kāi)天3號(hào)無(wú)性系，擴(kuò)增出了分子量為1211bp的特 殊DNA條帶，其余編號(hào)為其它杉木無(wú)性系，未見(jiàn)有1211bp的特殊DNA條帶產(chǎn)生。
權(quán)利要求
一種鑒別杉木無(wú)性系開(kāi)天3號(hào)的分子特異性標(biāo)記引物，所述引物序列如下上游引物5′ TCGCCCAGTCGATCAGATAA 3′下游引物5′ TCGCCCAGTCCACCCTCA 3′。
2.一種利用權(quán)利要求1所述分子特異性標(biāo)記引物對(duì)杉木無(wú)性系開(kāi)天3號(hào)進(jìn)行快速鑒別 的方法，所述方法包括提取待測(cè)杉木基因組DNA作為模板、以所述分子特異性標(biāo)記引物作 為擴(kuò)增引物，配制PCR反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)，若電泳結(jié)果出現(xiàn) 1211bp的DNA條帶，則待測(cè)杉木為杉木無(wú)性系開(kāi)天3號(hào)，所述分子特異性標(biāo)記引物序列為上游引物5 ‘ -TCGCCCAGTCGATCAGATAA-3 ‘ 下游引物5 ‘ -TCGCCCAGTCCACCCTCA-3 ‘。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于 所述PCR反應(yīng)體系每20 μ 1組成如下 PCR Buffer終濃度為1 XdNTPs各 1. 0 2. OmMMgCl21. 5 2. OmMTaq DNA 酶1 5U上、下游引物 各0. 5 0. 8μΜ 模板DNA60 80ngddH20 補(bǔ)足至 20 μ 1 ； PCR反應(yīng)條件如下94°C預(yù)變性 6min 后；94°C變性 40s，63°C退火 40s，72°C延伸 2min， 共28個(gè)循環(huán)；最后于72°C補(bǔ)平7min，終止溫度為4°C。
4.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述方法如下(1)取待測(cè)杉木幼嫩葉片，以SDS-CTAB法提取待測(cè)杉木基因組DNA；(2)以步驟⑴提取的基因組DNA為模板，以所述分子特異性標(biāo)記引物作為擴(kuò)增引物， 進(jìn)行PCR擴(kuò)增PCR反應(yīng)體系組成如下 10XPCR Buffer IOmM dNTPs 25mM MgCl2 5U/μ LTaq DNA 酶 25 μ M上、下游引物 20ng/ μ L 模板 DNA ddH20 補(bǔ)足至 20 μ 1 ； PCR反應(yīng)條件如下94°C預(yù)變性6min后；94°C變性40s，63°C退火40s，72°C延伸2min，共28個(gè)循環(huán)；最后 于72°C補(bǔ)平7min，終止溫度為4°C ；(3)取步驟(2)擴(kuò)增產(chǎn)物5μ L，與1 μ 1 0. 25%溴酚蘭緩沖液混勻，點(diǎn)樣于1. 5%的瓊 脂糖凝膠上，于1 XTAE緩沖液中、5V/cm電壓下電泳，電泳結(jié)束后EB染色，于自動(dòng)凝膠圖像 分析儀上照相，若電泳結(jié)果出現(xiàn)1211bp的DNA條帶，則待測(cè)杉木為無(wú)性系開(kāi)天3號(hào)。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述EB染色為在含0.5 μ g/ml EB的水溶液 中染色30分鐘。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種可鑒別杉木無(wú)性系開(kāi)天3號(hào)的分子特異性標(biāo)記引物，以及利用該引物對(duì)杉木無(wú)性系開(kāi)天3號(hào)進(jìn)行區(qū)別和鑒定的方法。所述引物序列為上游引物5′-TCGCCCAGTCGATCAGATAA-3′，下游引物5′-TCGCCCAGTCCACCCTCA-3′；本發(fā)明檢測(cè)方法與常規(guī)形態(tài)學(xué)檢測(cè)杉木無(wú)性系相比，具有檢測(cè)時(shí)間短，準(zhǔn)確性高的優(yōu)點(diǎn)；本發(fā)明方法檢測(cè)所需時(shí)間只要1～2天。
文檔編號(hào)C12N15/11GK101899505SQ20101017963
公開(kāi)日2010年12月1日 申請(qǐng)日期2010年5月24日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月24日
發(fā)明者李海波, 樊琳, 江波, 沈愛(ài)華 申請(qǐng)人:浙江省林業(yè)科學(xué)研究院