專利名稱：一種新型殼聚糖納米顆粒及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明專利涉及一種可用于食品工業(yè)中制備新型殼聚糖-酪蛋白磷酸肽納米顆 粒的方法。
背景技術(shù)：
酪蛋白磷酸肽(Casein Phosphop印tides，簡稱CPP)是以牛乳酪蛋白為原料，經(jīng) 單一酶或復(fù)合酶系水解，再經(jīng)分離純化而得到的含有成簇的磷酸絲氨?；碾?，在動物小 腸內(nèi)能與Ca2+結(jié)合，阻止磷酸鈣沉淀，使小腸對Ca2+的溶解度大大增加。鈣、鐵、鋅在動物體 內(nèi)起著重要作用，由于飼料原料中含有大量植酸鹽、纖維素、糖醛酸、藻酸鈉和草酸等，從而 阻礙了動物對鈣、鐵、鋅等礦物質(zhì)的吸收。CPP可提高鈣、鐵、鋅等礦物質(zhì)的溶解度從而促進(jìn) 礦物質(zhì)的吸收。另外，CPP對動物免疫和繁殖也有著重要作用。殼聚糖近年來被廣泛用做生物醫(yī)藥輸送載體，具有很好的生物可降解性、生物相 容性和黏膜吸附性。殼聚糖納米顆粒能夠吸附到黏膜表面，并迅速打開上皮細(xì)胞之間緊密 的黏結(jié)，避開腸道清除機(jī)制，在人體腸道中保留較長時間。完整的殼聚糖納米顆粒能夠被人 體細(xì)胞吞噬，從而顯著提高被其包封的活性分子的生物利用率。大量毒理學(xué)研究已經(jīng)證明， 殼聚糖對人體安全，無毒副作用。1992年日本將甲殼素及其衍生物列為功能性食品成分。 因此，殼聚糖是非常理想的制備食品納米材料的原料，可以作為食品功能因子的安全輸送 載體.目前通常使用三聚磷酸鈉交聯(lián)殼聚糖的方法制備殼聚糖納米顆粒。但是，作為口服 輸送載體，殼聚糖納米顆粒不耐強(qiáng)酸，在低PH值條件下會迅速解離、降解，導(dǎo)致被輸送營養(yǎng) 物在胃酸環(huán)境中遭破壞而不能被靶向輸送至腸道吸收。本發(fā)明專利解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是利用胰蛋白酶水解酪蛋白，通 過PH值選擇性沉淀以及陰離子交換分離、純化得到的富含磷酸基團(tuán)的酪蛋白磷酸肽。通過 條件優(yōu)化，選擇合適的PH值條件、殼聚糖/酪蛋白磷酸肽質(zhì)量比制備新型的殼聚糖_酪蛋 白磷酸肽納米顆粒。由于表面磷酸基團(tuán)負(fù)電荷的作用，殼聚糖-酪蛋白磷酸肽納米顆粒在 體內(nèi)能夠避免酸和酶的降解而具有很強(qiáng)的穩(wěn)定性，具有一定的靶向和緩釋性能。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明專利利用胰蛋白酶水解酪蛋白，通過等電點(diǎn)沉淀和陰離子交換樹脂分離純 化功能性酪蛋白磷酸肽。由于表面磷酸基團(tuán)負(fù)電荷的作用，酪蛋白磷酸肽在體內(nèi)能夠避免 酸和酶的降解而具有很強(qiáng)的穩(wěn)定性。本專利在國際上首次將制備得到的酪蛋白磷酸肽用 于與殼聚糖相互交聯(lián)作用形成以酪蛋白磷酸肽聚集體為核，過量殼聚糖反吸附到其表面的 “芯-殼”納米顆粒結(jié)構(gòu)。這種方法一方面提供了制備殼聚糖納米顆粒的新方法；另一方 面，也為包封和保護(hù)生物活性多肽以及活性酶提供了一種溫和、高效而便捷的高分子納米 材料。


圖1.隨著殼聚糖/酪蛋白磷酸肽質(zhì)量比升高過程中，形成的納米顆粒透射電鏡圖
具體實(shí)施例方式1.稱取50g酪蛋白，加入0. 05M的NaOH溶液500mL，用磁力攪拌器持續(xù)攪拌，待其 充分溶解后，調(diào)節(jié)PH至8.0。稱取胰蛋白酶0. 25g，溶于0. 75mL去離子水中。將胰蛋白酶溶 液加入酪蛋白-氫氧化鈉溶液中，充分混勻，置于50°C水浴鍋中恒溫反應(yīng)，并且不斷以IM的 NaOH溶液調(diào)節(jié)水解液的pH，使水解液的pH恒定8. 0。當(dāng)水解液的pH最后一次調(diào)回8. 0后， 保持半小時以上不再變化時，認(rèn)為反應(yīng)結(jié)束。反應(yīng)結(jié)束后，將水解液以沸水浴5min滅酶。 待水解液溫度回到室溫后，用IM的HCl將水解液的pH調(diào)至4. 6，以2000r/min離心30min， 取上清液，即為CPP粗提產(chǎn)物。調(diào)節(jié)CPP初產(chǎn)物pH值至pH8. 9，通過HiPr印column (16/10 QXL, Amersham Biosciences)陰離子交換柱分離純化，并凍干得到富含磷酸基團(tuán)的酪蛋白 磷酸肽。2.將殼聚糖溶于1 %的醋酸溶液，濃度為8mg/ml，用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至6. 0。3.將酪蛋白磷酸肽以去離子水復(fù)溶，濃度為8mg/ml，以HCl溶液調(diào)節(jié)pH值至6.0。4、在500ml酪蛋白磷酸肽溶液中逐滴滴加殼聚糖溶液，直至殼聚糖與酪蛋白磷酸 肽的質(zhì)量比為1/5，溶液呈現(xiàn)明顯的乳光。5、將納米顆粒溶液以20000g離心30分鐘，移除上清液，以含0. OlM NaCl的10mMTris-HCl緩沖液將納米顆粒沖洗三次之后，以pH2. 5的HCl溶液將納米顆粒重新分散開。6、將納米顆粒的鹽酸溶液凍干，制成凍干粉。
權(quán)利要求
一種新型殼聚糖-酪蛋白磷酸肽納米顆粒的制備方法，其特征是殼聚糖與酪蛋白磷酸肽的質(zhì)量比為1/5，粒徑為100-200nm，Zeta電位為0-30mV。
2.一種新型殼聚糖_酪蛋白磷酸肽納米顆粒的制備方法，通過離交聯(lián)反應(yīng)在室溫下合 成，其特征是(1)殼聚糖溶于的醋酸溶液；(2)將酪蛋白磷酸肽以去離子水溶解后，調(diào) 節(jié)溶液PH為6 ； (3)攪拌條件下，在酪蛋白磷酸肽溶液中逐滴滴加殼聚糖溶液，使酪蛋白磷 酸肽與殼聚糖互相交聯(lián)，形成納米顆粒，此時溶液呈現(xiàn)乳光。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的殼聚糖-酪蛋白磷酸肽納米顆粒的制備方法，其特征是殼聚 糖的醋酸溶液在使用前要加堿調(diào)節(jié)PH至6。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的殼聚糖-酪蛋白磷酸肽納米顆粒的制備方法，其特征是殼聚 糖是市售產(chǎn)品，分子量為IOOkDa,脫乙酰度為90%。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的殼聚糖-酪蛋白磷酸肽納米顆粒的制備方法，其特征是所用 的酪蛋白磷酸肽是酪蛋白以胰蛋白酶水解后經(jīng)等電點(diǎn)沉淀及陰離子交換樹脂純化后的富 含磷酸基團(tuán)的多肽。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的酪蛋白磷酸肽的制備方法，其特征是酪蛋白以1 10(w/v) 溶于0.05M的NaOH溶液，調(diào)節(jié)pH至8.0。加入33% (w/v)胰蛋白酶水溶液，胰蛋白酶與酪 蛋白質(zhì)量比為1 200，50°C水浴恒溫反應(yīng)，并且不斷以IM的NaOH溶液調(diào)節(jié)水解液的pH， 使水解液的PH恒定g. 0。當(dāng)水解液的pH最后一次調(diào)回8. 0后，保持半小時以上不再變化 時，認(rèn)為反應(yīng)結(jié)束。反應(yīng)結(jié)束后，以沸水浴5min滅酶。水解液溫度回到室溫后，用IM的HCl 將水解液的PH調(diào)至4. 6，以2000r/min離心30min，取上清液，即為CPP粗提產(chǎn)物。調(diào)節(jié)CPP 初產(chǎn)物 PH 值至 ρΗ8· 9，通過 HiPr印 column (16/10 QXL, Amersham Biosciences)陰離子交 換柱分離純化CPP，凍干后得到富含磷酸基團(tuán)的酪蛋白磷酸肽。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的殼聚糖-酪蛋白磷酸肽納米顆粒的制備方法，其特征是酪蛋 白磷酸肽用去離子水復(fù)溶后，要調(diào)節(jié)PH值至6。
8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的殼聚糖-酪蛋白磷酸肽納米顆粒的制備方法，其特征是殼聚 糖與酪蛋白磷酸肽的最終質(zhì)量比為1/5，且溶液呈現(xiàn)乳光。
全文摘要
本發(fā)明專利是一種可用于食品工業(yè)中制備新型殼聚糖-酪蛋白磷酸肽納米顆粒的方法。目前通常使用三聚磷酸鈉交聯(lián)殼聚糖的方法制備殼聚糖納米顆粒。但作為口服輸送載體，此殼聚糖納米顆粒不耐強(qiáng)酸，導(dǎo)致被輸送營養(yǎng)物在胃酸中遭破壞而不能被靶向輸送至腸道吸收。本發(fā)明利用胰蛋白酶水解酪蛋白的產(chǎn)物經(jīng)分離純化得到酪蛋白磷酸肽，通過條件優(yōu)化，將酪蛋白磷酸肽與殼聚糖相互交聯(lián)形成“芯-殼”納米顆粒結(jié)構(gòu)。由于表面磷酸基團(tuán)負(fù)電荷的作用，殼聚糖-酪蛋白磷酸肽納米顆粒在體內(nèi)能夠避免酸和酶的降解而具有很強(qiáng)的穩(wěn)定性，具有一定的靶向和緩釋性能，解決了目前殼聚糖-三聚磷酸鈉納米顆粒作為口服輸送載體易被胃酸降解的問題。
文檔編號C12P21/06GK101838467SQ20101017925
公開日2010年9月22日 申請日期2010年5月21日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月21日
發(fā)明者孫怡, 曾曉雄, 王舒舒, 胡冰 申請人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)