葉酸-殼聚糖修飾姜黃素納米脂質(zhì)體的制備方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明具體涉及一種葉酸-殼聚糖修飾姜黃素納米脂質(zhì)體的制備方法，可進一步 應用于食品、藥品、化妝品等領域。
【背景技術】
[0002] 姜黃素（curcumin, Cur)是從姜黃根莖中提取的低分子量多酸類化合物，作為一 種常見的著色劑、香料和防腐劑被應用于食品和化學工業(yè)。姜黃素因其具有諸多生理活性， 如抗氧化、抗炎癥、抗菌、抗病毒和抗癌癥等生物活性，但是，姜黃素的水溶性差、熱穩(wěn)定性 差，在弱堿性和生理環(huán)境下不穩(wěn)定，口服生物利用率極低，限制了其在食品和制藥工業(yè)中的 應用。隨著包埋技術的發(fā)展，微膠囊、膠束、復合物納米粒子、微乳和脂質(zhì)體（liposomes)等 被用來包埋姜黃素，旨在提高其生物利用率和擴大其應用范圍。
[0003] 脂質(zhì)體主要成分是磷脂和膽固醇，具有良好的生物相容性，可以運載親水性的、親 脂性的和兩性的藥物、營養(yǎng)素、功能性因子等。葉酸（folic acid，F(xiàn)A)即蝶酰谷氨酸，存在 于大多數(shù)蔬菜中，是人體必需的B族維生素，且葉酸受體在多種腫瘤細胞中過度表達，葉酸 作為癌細胞靶向分子被廣泛研究。在N-羥基琥珀酰亞胺和1-(3-二甲氨基丙基）-3-乙基 碳乙二胺鹽酸鹽的催化作用下，殼聚糖（chitosan，CS)分子的氨基可以和葉酸發(fā)生?；?應產(chǎn)生葉酸-殼聚糖復合物，可通過靜電相互作用修飾在脂質(zhì)體表面。
[0004] 薄膜分散法是脂質(zhì)體制備最經(jīng)典的方法，該法更適合包埋脂溶性藥物。動態(tài)高壓 微射流設備可產(chǎn)生100~300MPa的靜壓力，使得物料發(fā)生強剪切粉碎、高速撞擊、氣蝕、振 蕩和膨化等作用。薄膜分散結合動態(tài)高壓微射流法可獲取穩(wěn)定均一的小粒徑脂質(zhì)體。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術不足提供一種為優(yōu)化葉酸-殼聚糖修飾姜黃素納 米脂質(zhì)體的制備方法，以提高脂質(zhì)體的穩(wěn)定性，評價葉酸-殼聚糖修飾姜黃素納米脂質(zhì)體 的儲存穩(wěn)定性和緩釋性能，為葉酸-殼聚糖修飾姜黃素納米脂質(zhì)體的開發(fā)提供理論依據(jù)和 技術參考。
[0006] 本發(fā)明所述方法包括下列步驟：
[0007] (一）葉酸-殼聚糖復合物的合成：
[0008] (1)所用催化劑和各原料及其摩爾比為：N-羥基琥珀酰亞胺/1-(3-二甲氨基丙 基）-3_乙基碳乙二胺鹽酸鹽/葉酸/殼聚糖中氨基量=6:9:9:10,按上述摩爾比分別稱 取N-羥基琥珀酰亞胺、1-(3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳乙二胺鹽酸鹽和葉酸，將0. 150g/ mL濃度的葉酸溶于二甲基亞砜中，活化4h ;
[0009] (2)將濃度為0· 025g/mL的殼聚糖加入0· 3 %的冰醋酸溶液中，200r/min持續(xù)攪拌 至溶液清澈透明；
[0010] (3):將步驟⑴所得到的葉酸溶液緩慢加入到步驟⑵所得到的殼聚糖溶液中， 同時以200r/min持續(xù)攪拌反應16h ;
[0011] (4)用0· 1M氫氧化鈉溶液將步驟（3)所得反應產(chǎn)物調(diào)至pH 9· 0,并轉(zhuǎn)移至3. 5KDa 的透析袋中，于pH 7. 4的磷酸鹽緩沖溶液即PBS中透析2天，再于蒸餾水中透析2天；
[0012] (5)將步驟（4)所得溶液冷凍干燥，得到黃色海綿狀葉酸-殼聚糖復合物；
[0013] 全部操作均在避光環(huán)境下進行；
[0014] (二）薄膜分散一動態(tài)高壓微射流法制備姜黃素納米脂質(zhì)體：
[0015] (1)脂質(zhì)體原材料各組分及其重量百分比為：姜黃素0.05% -0.2%，大豆磷脂 1.4% -5. 6%，膽固醇 0.22 % -0.88%，吐溫-800. 4 % -1.6%，其余的是 pH 6. 5 濃度為 0. 05M的磷酸鹽緩沖溶液即PBS，為91. 7% -97. 9%;按上述重量百分比分別稱取姜黃素、大 豆磷脂、膽固醇和吐溫-80,在45°C水浴條件下，按lg大豆磷脂溶于15mL無水乙醇，使得各 組分完全溶解；
[0016] (2)將步驟（1)所得溶液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上減壓除去無水乙醇，形成均勻薄膜；
[0017] (3)加入pH 6. 5濃度為0· 05M的磷酸鹽緩沖溶液（PBS)洗膜，形成黃色粗脂質(zhì)體 懸濁液；
[0018] (4)用高壓微射流均質(zhì)機處理步驟（3)得到的脂質(zhì)體懸濁液，壓力為120MPa，處理 次數(shù)為2次，得到黃色透亮的姜黃素納米脂質(zhì)體溶液；
[0019] (三）葉酸-殼聚糖修飾姜黃素納米脂質(zhì)體的制備：
[0020] (1)葉酸-殼聚糖復合物與磷脂的重量比為1:16. 8 ;將步驟（一）得到的葉酸-殼 聚糖復合物按5mg/mL溶于1%的冰醋酸溶液中，200r/min持續(xù)攪拌至溶液清澈透明；
[0021] (2)按上述質(zhì)量將步驟⑴所得溶液緩慢加入到步驟（二）所得姜黃素納米脂質(zhì) 體溶液中，300r/min持續(xù)攪拌反應2h，得到葉酸-殼聚糖修飾姜黃素納米脂質(zhì)體。
[0022] 本發(fā)明的有益效果是：制備的葉酸-殼聚糖修飾姜黃素納米脂質(zhì)體平均粒徑 為103. 6±4. lnm，zeta電位為16. 35±3. 54mv，分散系數(shù)為0. 378±0. 01，載藥量達到了 35. 7mg/g磷脂，在25°C儲存穩(wěn)定性良好，在pH 7. 4和pH 5. 5的環(huán)境下緩釋性良好，且可通 過改變pH控制姜黃素的釋放。
【附圖說明】
[0023] 圖1為葉酸-殼聚糖修飾姜黃素納米脂質(zhì)體的工藝路線示意圖；
[0024] 圖2 (a)為葉酸-殼聚糖修飾姜黃素納米脂質(zhì)體的粒徑分布圖；
[0025] 圖2 (b)為葉酸-殼聚糖修飾姜黃素納米脂質(zhì)體的微觀形貌圖；
[0026] 圖3為脂質(zhì)體的緩釋性能；
[0027] 圖中：NLs-Cur和FA-CS-NLs-Cur分別表示姜黃素納米脂質(zhì)體和葉酸-殼聚糖修 飾姜黃素納米脂質(zhì)體。
【具體實施方式】
[0028] 原料：大豆磷脂（95 %，德國 lipoid GmbH)、膽固醇（Sigma. MKBF1936V)、吐 溫-80(上海申宇醫(yī)藥）、姜黃素（98%，阿拉丁試劑上海有限公司）、殼聚糖（MW50000,脫酰 度90%，美國Sigma-Aldrich公司）、葉酸（阿拉丁試劑上海有限公司）、1-(3-二甲氨基 丙基）-3-乙基碳乙二胺鹽酸鹽（阿拉丁試劑上海有限公司）、N-羥基琥珀酰亞胺（阿拉丁 試劑上海有限公司）。
[0029] 實施例1
[0030] (1)稱取1.036g N-羥基琥珀酰亞胺、1.725g 1-(3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳乙 二胺鹽酸鹽和2. 648g葉酸，完全溶于溶于20mL二甲基亞砜中，放置活化4h。稱取1. 46g殼 聚糖加入60mL 0. 3%的冰醋酸溶液中，200以11^11持續(xù)攪拌至完全溶解。將殼聚糖溶液緩慢 加入活化的葉酸溶液中，同時以200r/min持續(xù)攪拌反應16h。用0. 1M氫氧化鈉溶液將所得 反應產(chǎn)物調(diào)至pH 9. 0,并轉(zhuǎn)移至3. 5KDa的透析袋中，于pH7. 4的磷酸鹽緩沖溶液（PBS)中 透析2天，再于蒸餾水中透析2天，除去雜質(zhì)。將透析后所得樣品冷凍干燥，得到黃色海綿 狀葉酸-殼聚糖復合物。
[0031] (2)稱取0· 050g姜黃素、1. 400g大豆磷脂、0· 220g膽固醇、0· 400g吐溫-80完全溶 解于28mL無水乙醇中，在45°C水浴條件下真空旋轉(zhuǎn)除去乙醇，形成均勻薄膜。加入100mL pH 6. 5濃度為0.05M的磷酸鹽緩沖溶液（PBS)洗膜，形成的均勻懸濁液即為粗脂質(zhì)體。將 粗脂質(zhì)體加入到DHPM中，于120MPa條件下微流化處理2次，即制備得到姜黃素納米脂質(zhì) 體。
[0032] (3)稱取0. 050g步驟（1)所得葉酸-殼聚糖復合物溶于10mLl %的冰醋酸溶液中， 200r/min持續(xù)攪拌至溶液清澈透明，得到葉酸-殼聚糖復合物溶液。取60mL步驟（2)所得 姜黃素納米脂質(zhì)體緩慢滴加至10mL葉酸-殼聚糖復合物溶液中，300r/min持續(xù)攪拌反應 2h，得到葉酸-殼聚糖修飾姜黃素納米脂質(zhì)體。制得的葉酸-殼聚糖修飾姜黃素納米脂質(zhì) 體為透明黃色溶液，載藥量為35. 5mg/g磷脂，平均粒徑為104. 9nm，zeta電位為16. 08mv， 分散系數(shù)為〇. 378 ;葉酸-殼聚糖修飾姜黃素納米脂質(zhì)體在pH 7. 4環(huán)境下24h姜黃素釋放 量為17. 3%，在pH 5. 5環(huán)境下24h姜黃素釋放量為27. 5% ;25°C儲存一個月，葉酸-殼聚 糖修飾姜黃素納米脂質(zhì)體的粒徑、表面點位以及姜黃素含量無顯著變化。
[0033] 實施例2
[0034] (1)稱取0.259g N-羥基琥珀酰亞胺、0.431g 1-(3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳乙 二胺鹽酸鹽和〇. 662g葉酸，完全溶于溶于5mL二甲基亞砜中，放置活化4h。稱取0. 3650g 殼聚糖加入15mL 0. 3%的冰醋酸溶液中，200以11^11持續(xù)攪拌至完全溶解。將殼聚糖溶液緩 慢加入活化的葉酸溶液中，同時以200r/min持續(xù)攪拌反應16h。用0. 1M氫氧化鈉溶液將所 得反應產(chǎn)物調(diào)至pH 9. 0,并轉(zhuǎn)移至3. 5KDa的透析袋中，于pH 7. 4的磷酸鹽緩沖溶液（PBS) 中透析2天，再于蒸餾水中透析2天，除去雜質(zhì)。將透析后所得樣品冷凍干燥，得到黃色海 綿狀葉酸-殼聚糖復合物。
[0035] (2)稱取0· 025g姜黃素、0· 700g大豆磷脂、0· 110g膽固醇、0·