專利名稱：一種體外誘導(dǎo)巨核祖細(xì)胞和巨核細(xì)胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域中單個(gè)核細(xì)胞的體外誘導(dǎo)方法，特別是涉及一種將單個(gè)核細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化為巨核祖細(xì)胞和巨核細(xì)胞的方法。
背景技術(shù)：
腫瘤(Tumor)是機(jī)體在各種致癌因素作用下，局部組織的某一個(gè)細(xì)胞在基因水平 上失去對(duì)其生長(zhǎng)的正常調(diào)控，導(dǎo)致細(xì)胞克隆性異常增生而形成的新生物。腫瘤可分為良性 和惡性兩大類。惡性腫瘤是目前嚴(yán)重危害人類健康的主要疾病之一，其常規(guī)的治療手段仍 然是手術(shù)治療并結(jié)合放化療。當(dāng)患者在接受高劑量放化療后，骨髓造血功能低下，常會(huì)出現(xiàn) 血小板減少，嚴(yán)重時(shí)會(huì)造成患者出血死亡。臨床上常采用輸注血小板，但血小板來(lái)源有限， 存活期短，體外易失活，且反復(fù)輸注血小板易導(dǎo)致輸注無(wú)效并增加輸血傳播疾病的危險(xiǎn)。 1997 年，Bertolini 等(Bertolini 等，Megakaryocytic progenitors can be expanded ex vivo and safely administeredto autologous peripheral blood progenitor cell transplant recipients. Bloodl997，89 (8) 2679)從外周血中分離 CD34+，體外誘導(dǎo)擴(kuò) 增巨核細(xì)胞7天，用于患者血小板恢復(fù)。結(jié)果顯示，體外誘導(dǎo)的巨核細(xì)胞可替代血小板 輸入，或減少血小板輸入次數(shù)。2000年，Paquette等(Paquette等，Ex vivo expanded unselectedperipheral blood progenitor cells reduce posttransplantation neutropenia, thrombocytopenia, and anemia in patients with breast cancer. Blood, 2000,96(7) 2385)將體外動(dòng)員的外周血細(xì)胞經(jīng)體外誘導(dǎo)擴(kuò)增巨核細(xì)胞9天后，用于改善 大劑量化療的乳腺癌病人中性粒細(xì)胞減少、血小板減少和貧血癥狀。Van denOudenri jn等 (Van den Oudenrijn 等 Differences in megakaryocyte expansionpotential between CD34(+)stem cells derived from cord blood, peripheral bloodand bone marrow from adults and children. Exp Hematol，2000，28 (9) : 1054)對(duì)外周血、骨髓、臍血來(lái)源的 CD34+ 細(xì)胞體外擴(kuò)增進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)臍血來(lái)源的CD34+具有更強(qiáng)的巨核細(xì)胞擴(kuò)增能力。由于臍血來(lái) 源廣泛、免疫原性低、對(duì)供者無(wú)損害、污染少、無(wú)倫理道德問(wèn)題，已成為臨床關(guān)注的焦點(diǎn)。由 于臍血造血干細(xì)胞移植后血小板的恢復(fù)較外周血、骨髓慢，因此采用體外誘導(dǎo)、擴(kuò)增巨核祖 細(xì)胞和巨核細(xì)胞，然后輸注患者體內(nèi)，進(jìn)一步發(fā)育成血小板，縮短血小板的恢復(fù)期。文獻(xiàn)報(bào) 道種子細(xì)胞多為CD34+細(xì)胞，而以單個(gè)核細(xì)胞為體外誘導(dǎo)擴(kuò)增的種子細(xì)胞具有花費(fèi)低，且操 作簡(jiǎn)便，造血干細(xì)胞損失小等優(yōu)點(diǎn)。莫文健等人(莫文健等，無(wú)血清臍血巨核系祖細(xì)胞體外擴(kuò)增的研究。中國(guó)實(shí)驗(yàn)血 液學(xué)雜志，2004 ;12 (2) :133-137;莫文健等，兩步法臍血巨核細(xì)胞體外擴(kuò)增的研究。中國(guó)輸 血雜志，2005;18(5) 381-383)公開(kāi)了一種以單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)行體外誘導(dǎo)擴(kuò)增的技術(shù)，其主 要是用羥乙基淀粉從臍血中沉降紅細(xì)胞(臍血與6%羥乙基淀粉按5 1比例混合)，然后 經(jīng)PBS洗滌，F(xiàn)icoll分離單個(gè)核細(xì)胞。單個(gè)核細(xì)胞加入無(wú)血清培養(yǎng)液中孵育2h去掉黏附 細(xì)胞，再在含誘導(dǎo)因子的無(wú)血清培養(yǎng)基(含細(xì)胞因子終濃度為50ng/ml ΤΡ0, 20ng/ml IL_3、 50ng/ml SCF, 20ng/ml IL-6的StemSpan SFEM無(wú)血清培養(yǎng)基)中進(jìn)行培養(yǎng)、誘導(dǎo)分化得到巨核細(xì)胞。然而該文獻(xiàn)介紹的方法較為繁瑣，且臍血單個(gè)核細(xì)胞擴(kuò)增后10天CD41+細(xì)胞 百分?jǐn)?shù)16. 68士 1. 27%，14天⑶41+細(xì)胞表達(dá)量為24. 41 士 1. 90%，顯示表達(dá)量不高
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種操作簡(jiǎn)便且可以提高表達(dá)量的體外誘導(dǎo)巨核祖細(xì)胞和巨核細(xì) 胞的方法及其專用培養(yǎng)基。為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采取以下技術(shù)方案用于體外誘導(dǎo)巨核祖細(xì)胞和巨 核細(xì)胞的專用培養(yǎng)基，命名為st36無(wú)血清培養(yǎng)基，是在StemSpan 無(wú)血清培養(yǎng)基中，加入 細(xì)胞因子TPO終濃度為50ng/mL、IL-3終濃度為20ng/mL、SCF終濃度為50ng/mL、IL-6終 濃度為50ng/mL。所述StemSpan 為進(jìn)口無(wú)血清培養(yǎng)基(生產(chǎn)商加拿大stemcell公司)。本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種體外誘導(dǎo)巨核祖細(xì)胞和巨核細(xì)胞的方法。本發(fā)明所提供的體外誘導(dǎo)巨核祖細(xì)胞和巨核細(xì)胞的方法，可包括以下步驟1)單個(gè)核細(xì)胞的分離用常規(guī)的Ficoll密度梯度離心方法從臍血中分離單個(gè)核 細(xì)胞，其中，采用質(zhì)量/體積百分比濃度為6% (g/100ml)的羥乙基淀粉(生產(chǎn)商美國(guó) B. BRAUN公司)沉降臍血中的紅細(xì)胞；2)細(xì)胞培養(yǎng)和誘導(dǎo)分化將單個(gè)核細(xì)胞接種于st36無(wú)血清培養(yǎng)基中，在37°C、5% CO2條件下體外培養(yǎng)4-14天，取第4-14天的細(xì)胞得到巨核祖細(xì)胞和巨核細(xì)胞混合物。優(yōu)選 體外培養(yǎng)7-14天。在上述方法中，所述步驟1)中6 %羥乙基淀粉與臍血的混合比例為 1:2-1: 3(羥乙基淀粉的終濃度為1.5%-2.0%)，優(yōu)選為1 3(羥乙基淀粉的終濃度 為1. 5% )；單個(gè)核細(xì)胞的分離方法具體為用6%的羥乙基淀粉按比例與臍血混合沉降紅 細(xì)胞30min，吸取上清，1800rpm離心5min，將細(xì)胞懸于生理鹽水中，再將細(xì)胞懸液緩慢加入 等體積的人淋巴細(xì)胞分離液表面，22°C、2000rpm離心25min，得到單個(gè)核細(xì)胞。步驟2)中單個(gè)核細(xì)胞的接種量為IO6細(xì)胞/ml ；在培養(yǎng)第4、7、10天時(shí)進(jìn)行原體積 的1/3量補(bǔ)液，加入新鮮培養(yǎng)基和細(xì)胞因子。用上述方法獲得的巨核祖細(xì)胞和巨核細(xì)胞也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。其中，體外 培養(yǎng)7-10天得到的巨核祖細(xì)胞和巨核細(xì)胞形態(tài)和活性最優(yōu)。本發(fā)明主要提供了一種體外誘導(dǎo)巨核祖細(xì)胞和巨核細(xì)胞的方法及其專用培養(yǎng)基。 在分離單個(gè)核細(xì)胞過(guò)程中，首先要沉降紅細(xì)胞，采用羥乙基淀粉、明膠、甲基纖維素等均可 獲得較好的結(jié)果，但明膠、甲基纖維素不適用于臨床應(yīng)用，而本發(fā)明采用的羥乙基淀粉是紅 細(xì)胞沉降劑，它可加快紅細(xì)胞的沉降效率，阻礙白細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的黏附，從而達(dá)到直接分 離紅細(xì)胞的目的；本發(fā)明還優(yōu)化了羥乙基淀粉的使用濃度，提高了有核細(xì)胞的收率；本發(fā) 明進(jìn)而將沉降紅細(xì)胞后的上清按體積比1 1緩慢加入人淋巴細(xì)胞分離液(FICOLL)上， 進(jìn)行密度梯度離心，可得到純度較高的單個(gè)核細(xì)胞。本發(fā)明中省去了分離的單個(gè)核細(xì)胞去 黏附細(xì)胞的操作而直接進(jìn)行誘導(dǎo)，從而簡(jiǎn)化了操作過(guò)程，減少了污染，縮短了時(shí)間。另一方 面，本發(fā)明在細(xì)胞培養(yǎng)和誘導(dǎo)分化過(guò)程中，通過(guò)采用合適的培養(yǎng)基并合理配伍使用各種細(xì) 胞因子(特別是調(diào)整了 IL-6的終濃度為50ng/mL)，選擇恰當(dāng)?shù)难a(bǔ)液時(shí)機(jī)(在培養(yǎng)第4、7、 10天)和補(bǔ)液量(按原體積1/3量補(bǔ)液)進(jìn)行體外擴(kuò)增巨核細(xì)胞，獲得了最佳擴(kuò)增效果和表達(dá)量。本發(fā)明將臍血單個(gè)核細(xì)胞高效誘導(dǎo)分化為巨核祖細(xì)胞和巨核細(xì)胞的方法，具有操 作簡(jiǎn)單、成本低廉和分化效率高等優(yōu)點(diǎn)，并提供了一個(gè)巨核祖細(xì)胞和巨核細(xì)胞的補(bǔ)充來(lái)源， 將在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域發(fā)揮重要作用，應(yīng)用前景廣闊。下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。


圖1為不同濃度羥乙基淀粉沉降紅細(xì)胞效果比較結(jié)果圖2為含不同因子組合的國(guó)產(chǎn)無(wú)血清培養(yǎng)基體外誘導(dǎo)臍血單個(gè)核細(xì)胞7d⑶41/ ⑶61表達(dá)情況圖3為含st36(SCF、TPO、IL-3、IL-6)因子組合的進(jìn)口無(wú)血清培養(yǎng)基體外誘導(dǎo)不 同時(shí)間的細(xì)胞形態(tài)(X200)圖4為臍血單個(gè)核細(xì)胞體外誘導(dǎo)后細(xì)胞瑞氏吉姆薩染色(X 1000)圖5為臍血單個(gè)核細(xì)胞體外誘導(dǎo)不同時(shí)間半固體培養(yǎng)CFU-MK集落數(shù)
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所用方法如無(wú)特別說(shuō)明均為常規(guī)方法。所述百分比濃度均為質(zhì)量/ 體積(W/ν)百分比濃度或體積/體積(V/V)百分比濃度。實(shí)施例1 培養(yǎng)基中因子組合的確定實(shí)驗(yàn)一、采用含不同細(xì)胞因子組合的國(guó)產(chǎn)無(wú)血清培養(yǎng)基誘導(dǎo)臍血單個(gè)核細(xì)胞，觀 察表達(dá)⑶41/⑶61細(xì)胞數(shù)的變化該實(shí)驗(yàn)中所用國(guó)產(chǎn)無(wú)血清培養(yǎng)基為購(gòu)自北京博特納科技有限公司的BTN無(wú)血清
培養(yǎng)基。將單個(gè)核細(xì)胞(從臍血中獲得，分離單個(gè)核細(xì)胞的過(guò)程參見(jiàn)實(shí)施例2)接種于24 孔板中，每孔1ml，IO6細(xì)胞/ml。培養(yǎng)基分別為培養(yǎng)基A:國(guó)產(chǎn)無(wú)血清培養(yǎng)基，其中含116t因子組合10ng/mL IL-IlUOng/ mLIL-6、100ng/mL TPO。培養(yǎng)基B 國(guó)產(chǎn)無(wú)血清培養(yǎng)基，其中含st36因子組合50ng/mL SCF、50ng/mLTP0、 20ng/mL IL-3、50ng/mLIL_6o培養(yǎng)基C 國(guó)產(chǎn)無(wú)血清培養(yǎng)基，其中含pt36因子組合50ng/mL PDGF、50ng/mLTP0、 20ng/mL IL_3、50ng/mL IL-6。培養(yǎng)基D:國(guó)產(chǎn)無(wú)血清培養(yǎng)基，其中含pst36因子組合50ng/mL PDGF、50ng/ mLSCF、50ng/mL TP0、20ng/mL IL_3、50ng/mL IL_6。培養(yǎng)條件37°C、5% C02培養(yǎng)箱體外培養(yǎng)7d。于第4d進(jìn)行1/3量補(bǔ)液，加入新鮮 培養(yǎng)基(含有與原培養(yǎng)基相同濃度的因子)。采用含不同細(xì)胞因子組合的國(guó)產(chǎn)無(wú)血清培養(yǎng)基誘導(dǎo)臍血單個(gè)核細(xì)胞，觀察表達(dá) D41/CD61陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)的變化，結(jié)果培養(yǎng)基B效果較好(圖2)，確定本發(fā)明采用的因子組合 為st36因子組合。實(shí)驗(yàn)二、培養(yǎng)基B與含st36因子組合的進(jìn)口無(wú)血清培養(yǎng)基(培養(yǎng)基E)對(duì)臍血單 個(gè)核細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化影響
實(shí)驗(yàn)中所用進(jìn)口無(wú)血清培養(yǎng)基為StemSpan SFEM無(wú)血清培養(yǎng)基，生產(chǎn)商為加拿 大stemcell公司。與實(shí)驗(yàn)一類似，采用培養(yǎng)基E，(含st36因子組合，即50ng/mL SCF、50ng/mLTP0、 20ng/mL IL_3、50ng/mL IL-6的StemSpgm 無(wú)血清培養(yǎng)基)，體外誘導(dǎo)培養(yǎng)單個(gè)核細(xì)胞4d、 7d、10d、14d，分別于第4d、7d、10d按原體積的1/3量補(bǔ)液，加入新鮮培養(yǎng)液和相同濃度的因
子。 結(jié)果表明，采用培養(yǎng)基E體外誘導(dǎo)臍血單個(gè)核細(xì)胞表明，隨著誘導(dǎo)時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞 數(shù)增加，CD41/CD6表達(dá)提高(表1)。在觀察培養(yǎng)基B與培養(yǎng)基E對(duì)臍血單個(gè)核細(xì)胞誘導(dǎo)分 化影響，發(fā)現(xiàn)隨著誘導(dǎo)時(shí)間延長(zhǎng)，臍血單個(gè)核細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)基B體外誘導(dǎo)培養(yǎng)(參見(jiàn)實(shí)驗(yàn)一) 存活率降低，細(xì)胞狀態(tài)不佳。而以培養(yǎng)基E作為培養(yǎng)誘導(dǎo)體系，細(xì)胞存活時(shí)間延長(zhǎng)，存活率 提高。隨著細(xì)胞培養(yǎng)誘導(dǎo)時(shí)間延長(zhǎng)，出現(xiàn)貼壁的基質(zhì)細(xì)胞，以及呈卵圓形、圓形的懸浮細(xì)胞， 大小不一，且細(xì)胞數(shù)逐漸增加，體積變大。表明，在貼壁生長(zhǎng)的基質(zhì)細(xì)胞作用下，懸浮的臍血 干細(xì)胞向巨核祖細(xì)胞和巨核細(xì)胞分化，逐漸成熟，擴(kuò)增。因此，確定采用培養(yǎng)基E作為用于 體外誘導(dǎo)巨核祖細(xì)胞和巨核細(xì)胞的專用培養(yǎng)基。表1體外培養(yǎng)誘導(dǎo)臍血單個(gè)核細(xì)胞不同時(shí)間細(xì)胞數(shù)變化和⑶41/⑶6表達(dá)(η = 5) 通過(guò)以上實(shí)驗(yàn)確定本發(fā)明用于體外誘導(dǎo)巨核祖細(xì)胞和巨核細(xì)胞的專用培養(yǎng)基 (即培養(yǎng)基E，命名為st36無(wú)血清培養(yǎng)基)，是在進(jìn)口無(wú)血清培養(yǎng)基(StemSpan 無(wú)血清培 養(yǎng)基)中，加入的細(xì)胞因子TPO終濃度為50ng/mL、IL-3終濃度為20ng/mL、SCF終濃度為 50ng/mL、IL-6 終濃度為 50ng/mL。實(shí)施例2、體外誘導(dǎo)臍血單個(gè)核細(xì)胞分化為巨核祖細(xì)胞和巨核細(xì)胞及檢測(cè)實(shí)驗(yàn)三、不同濃度的羥乙基淀粉(HES)沉降臍血紅細(xì)胞的沉降效果比較將6%羥乙基淀粉與臍血按一定比例混合，使羥乙基淀粉終濃度分別為2.0%、 1.5%,1.2%,1.0% ( “ ％ ”含義為"g/100ml，，)，室溫沉降紅細(xì)胞30min,比較沉降效果。 然后，小心吸取上清，ISOOrpm離心5min，細(xì)胞懸于生理鹽水中，將細(xì)胞懸液緩慢加入等體 積的人淋巴細(xì)胞分離液(FIC0LL，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所灝洋生物)表面，22°C、 2000rpm離心25min，收集單個(gè)核細(xì)胞層，生理鹽水洗滌2次，細(xì)胞計(jì)數(shù)。比較2. 0%、1. 5%、1. 2%、1. 0%濃度的羥乙基淀粉沉降臍血紅細(xì)胞的沉降效果， 結(jié)果顯示2.0%或1.5%羥乙基淀粉的沉降效果較好(6%羥乙基淀粉與臍血按1 2或 1 3比例混合)，其中1.5%羥乙基淀粉的沉降效果最佳(圖1，1 4:羥乙基淀粉濃度分 別為2.0%、1.5%、1.2%、1.0% )，且回收的有核細(xì)胞量最多(表1)。表2不同濃度羥乙基淀粉沉降紅細(xì)胞后獲得有核細(xì)胞的量 η = 4 與 1· 5%的 HES 相比，* :ρ < 0. 05，f :ρ < 0. 05以下操作中使用6%的羥乙基淀粉并使其終濃度為1. 5%。一、體外誘導(dǎo)臍血單個(gè)核細(xì)胞分化為巨核祖細(xì)胞和巨核細(xì)胞用本發(fā)明的方法體外誘導(dǎo)臍血單個(gè)核細(xì)胞分化為巨核祖細(xì)胞和巨核細(xì)胞，具體包 括以下步驟1)單個(gè)核細(xì)胞的分離用常規(guī)的Ficoll密度梯度離心方法從臍血中分離單個(gè)核 細(xì)胞，具體方法為用6%羥乙基淀粉與臍血按1 3體積比混合(羥乙基淀粉的終濃度為 1. 5%)沉降紅細(xì)胞30min，吸取上清，1800rpm離心5min，將細(xì)胞懸于生理鹽水中，再將細(xì)胞 懸液緩慢加入等體積的人淋巴細(xì)胞分離液上，22°C、2000rpm離心25min，得到單個(gè)核細(xì)胞。2)細(xì)胞培養(yǎng)和誘導(dǎo)分化將單個(gè)核細(xì)胞接種于24孔板中，每孔1ml，IO6細(xì)胞/ml， 添加實(shí)施例1確定的培養(yǎng)基E中，在37°C、5% CO2條件下體外培養(yǎng)，并在培養(yǎng)第4、7、10天 時(shí)進(jìn)行原體積的1/3量補(bǔ)液，加入新鮮培養(yǎng)基，取4、7、10、14天得到的巨核祖細(xì)胞和巨核細(xì) 胞混合物。二、細(xì)胞形態(tài)觀察用倒置顯微鏡觀察誘導(dǎo)的單個(gè)核細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞的大體形態(tài)變化。瑞氏吉姆 薩染色，普通光學(xué)顯微鏡觀察誘導(dǎo)分化的巨核祖細(xì)胞和巨核細(xì)胞。單個(gè)核細(xì)胞接種培養(yǎng)基后于倒置顯微鏡下觀察，可見(jiàn)細(xì)胞小，圓形。隨著培養(yǎng)時(shí)間 延長(zhǎng)，細(xì)胞數(shù)增加，出現(xiàn)梭形貼壁細(xì)胞，圓形、卵圓形細(xì)胞，大小不一，且細(xì)胞體積逐漸變大。 7天后細(xì)胞增殖明顯(圖3，(1) (5)分別為體外誘導(dǎo)0d、4d、7d、10d、14d的細(xì)胞形態(tài))。 瑞氏吉姆薩染色，可見(jiàn)有不同階段巨核細(xì)胞存在。光學(xué)顯微鏡下觀察顯示有原巨核，幼巨核 細(xì)胞(核大，紫紅色，細(xì)胞邊緣不規(guī)則，可有指狀突起)和顆粒型巨核細(xì)胞(胞體巨大，胞質(zhì) 豐富，含細(xì)小紫紅色顆粒，核互相聚集呈環(huán)狀)存在，10天后出現(xiàn)成熟的巨核細(xì)胞(參見(jiàn)圖 4其中箭頭所指細(xì)胞，①②誘導(dǎo)IOd巨核細(xì)胞③④誘導(dǎo)14d巨核細(xì)胞)。三、流式細(xì)胞儀檢測(cè)誘導(dǎo)4d、7d、10d、14d獲得的巨核祖細(xì)胞和巨核細(xì)胞分別用生理鹽水洗滌，并將誘 導(dǎo)不同時(shí)間的細(xì)胞均分成兩管，各加入鼠抗人⑶41—PE、⑶61-FITC抗體和鼠的IgGl-PE、 IgGl-FITC抗體(英國(guó)ρ印rotech公司)，4°C、30min孵育，流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD41/CD61表 達(dá)。數(shù)據(jù)參見(jiàn)表3。表3體外培養(yǎng)誘導(dǎo)臍血單個(gè)核細(xì)胞不同時(shí)間細(xì)胞數(shù)變化和⑶41/⑶6表達(dá)(η = 5)
結(jié)果誘導(dǎo)10d、14d時(shí)，⑶41/⑶61表達(dá)分別達(dá)到20 %、54%，該數(shù)據(jù)與莫文健 等人(莫文健等，無(wú)血清臍血巨核系祖細(xì)胞體外擴(kuò)增的研究。中國(guó)實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志， 2004； 12 (2) :133-137;莫文健等，兩步法臍血巨核細(xì)胞體外擴(kuò)增的研究。中國(guó)輸血雜 志，2005;18(5) 381-383)報(bào)道的結(jié)果(臍血單個(gè)核細(xì)胞擴(kuò)增后10天⑶41+細(xì)胞百分?jǐn)?shù) 16. 68 士 1.27%，14天⑶41+細(xì)胞表達(dá)量為24. 41 士 1.90% )相比，定向誘導(dǎo)巨核細(xì)胞的效 果更佳。本發(fā)明獲得較好的表達(dá)量，與培養(yǎng)基中使用的因子濃度、誘導(dǎo)過(guò)程的補(bǔ)液的時(shí)機(jī)、 補(bǔ)液方式有關(guān)，且單個(gè)核細(xì)胞接種后貼壁的基質(zhì)細(xì)胞可能也有利于細(xì)胞誘導(dǎo)分化。四、巨核祖細(xì)胞集落培養(yǎng)采用含0.9%甲基纖維素，BSA，10_4M β -巰基乙醇，200 μ g/mL人轉(zhuǎn)鐵蛋白， 10μ g/mL 重組人胰島素，2mM L-谷氨酰胺，10ng/mL rhIL-6,10ng/mL rhIL-3，50ng/mL rhTPO的巨核祖細(xì)胞集落培養(yǎng)基對(duì)步驟2)獲得的體外誘導(dǎo)培養(yǎng)0、7、10、14d的巨核祖細(xì)胞 進(jìn)行集落培養(yǎng)10-12天，倒置顯微鏡下計(jì)CFU-MK集落數(shù)。結(jié)果如圖5所示，隨著單個(gè)核細(xì)胞在培養(yǎng)基E中誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，CFU-MK集落數(shù) 呈增加趨勢(shì)。體外誘導(dǎo)7d、10d、14d的細(xì)胞，CFU-MK集落數(shù)均高于未誘導(dǎo)的單個(gè)核細(xì)胞，且 差別非常顯著(P <0.01)。表明，增加體外誘導(dǎo)時(shí)間，可獲得更多的巨核祖細(xì)胞。實(shí)施例2確定了本發(fā)明較好的體外誘導(dǎo)臍血單個(gè)核細(xì)胞分化為巨核祖細(xì)胞和巨 核細(xì)胞的方法，并且，取使用該方法體外誘導(dǎo)7d-14d的細(xì)胞表達(dá)量有明顯提高，而從獲得 的細(xì)胞形態(tài)和活性看，7d-10d的細(xì)胞較好。
權(quán)利要求
用于體外誘導(dǎo)巨核祖細(xì)胞和巨核細(xì)胞的專用培養(yǎng)基，命名為st36無(wú)血清培養(yǎng)基，是含有終濃度50ng/mL SCF、50ng/mL TPO、20ng/mL IL-3和50ng/mL IL-6的st36因子組合的無(wú)血清培養(yǎng)基。FSA00000126734100011.tif
2.—種體外誘導(dǎo)巨核祖細(xì)胞和巨核細(xì)胞的方法，包括以下步驟1)單個(gè)核細(xì)胞的分離用常規(guī)的Ficoll密度梯度離心方法從臍血中分離單個(gè)核細(xì)胞， 其中，采用質(zhì)量/體積(W/V)百分比濃度為6%的羥乙基淀粉沉降臍血中的紅細(xì)胞；2)細(xì)胞培養(yǎng)和誘導(dǎo)分化將單個(gè)核細(xì)胞接種于用權(quán)利要求1所述專用培養(yǎng)基中，在 37°C,5% CO2條件下體外培養(yǎng)4-14天，取4_14天的懸浮細(xì)胞得到巨核祖細(xì)胞和巨核細(xì)胞。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述步驟1)中6%羥乙基淀粉與臍血的 混合比例為1 2-1 3，使羥乙基淀粉的終濃度為1.5%-2.0%。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的培養(yǎng)方法，其特征在于所述步驟2)培養(yǎng)時(shí)間為7-14天。
5.根據(jù)權(quán)利要求2或3或4所述的方法，其特征在于所述步驟1)單個(gè)核細(xì)胞的分 離過(guò)程為用6%的羥乙基淀粉沉降按與臍血按比例混合沉降紅細(xì)胞30min，吸取上清， ISOOrpm離心5min，將細(xì)胞懸于生理鹽水中，再將細(xì)胞懸液緩慢加入等體積的人淋巴細(xì)胞 分離液表面，22°C、2000rpm離心25min，得到單個(gè)核細(xì)胞。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述步驟1)中6%羥乙基淀粉與臍血的 混合比例為1 3，使羥乙基淀粉的終濃度為1.5%。
7.根據(jù)權(quán)利要求2至6任一所述的方法，其特征在于所述步驟1)得到的單個(gè)核細(xì)胞 直接用于步驟2)的細(xì)胞培養(yǎng)和誘導(dǎo)分化中，無(wú)需增加去掉單個(gè)核細(xì)胞中的黏附細(xì)胞的過(guò) 程。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7任一所述的方法，其特征在于所述步驟2)在培養(yǎng)第4、7、10天 時(shí)進(jìn)行原體積的1/3量補(bǔ)液，加入新鮮權(quán)利要求1所述專用培養(yǎng)基。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-7任一所述的方法，其特征在于所述步驟2)中單個(gè)核細(xì)胞的接種 量為IO6細(xì)胞/ml。
10.用權(quán)利要求2-9任一項(xiàng)所述方法獲得的巨核祖細(xì)胞和巨核細(xì)胞混合物，優(yōu)選步驟 2)中體外培養(yǎng)7-10天得到的巨核祖細(xì)胞和巨核細(xì)胞混合物。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種體外誘導(dǎo)巨核祖細(xì)胞和巨核細(xì)胞的方法及其專用培養(yǎng)基。該專用培養(yǎng)基是含有50ng/mL SCF、50ng/mL TPO、20ng/mL IL-3和50ng/mL IL-6的無(wú)血清培養(yǎng)基。該方法包括以下步驟1)用常規(guī)的Ficoll密度梯度離心方法從臍血中分離單個(gè)核細(xì)胞，其中用濃度為6％的羥乙基淀粉沉降臍血中的紅細(xì)胞；2)將單個(gè)核細(xì)胞用專用培養(yǎng)基在37℃、5％CO2條件下體外培養(yǎng)4-14天，得到巨核祖細(xì)胞和巨核細(xì)胞混合物。本發(fā)明提供了一個(gè)巨核祖細(xì)胞和巨核細(xì)胞的補(bǔ)充來(lái)源，并具有操作簡(jiǎn)單、成本低廉和分化效率高等優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明將在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域發(fā)揮重要作用，應(yīng)用前景廣闊。
文檔編號(hào)C12N5/0786GK101864396SQ20101017885
公開(kāi)日2010年10月20日 申請(qǐng)日期2010年5月17日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月17日
發(fā)明者主鴻鵠, 劉大慶, 呂洋, 岳 文, 師偉, 李艷華, 裴雪濤, 謝小燕, 陳琳 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院野戰(zhàn)輸血研究所