專利名稱：造血干細胞、祖細胞以及巨核細胞的擴增方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新的擴增造血干、祖細胞，主要是巨核細胞及其祖細胞的方法，聯(lián)合相繼應(yīng)用血小板第四因子(Plateletfactor4，簡稱PF4)、造血細胞生長因子以及能調(diào)節(jié)血細胞生長因子活性的藻類多糖物質(zhì)。
已知造血多能干細胞在一定的條件下，如在不同的造血細胞生長因子的刺激下能向粒單細胞、紅細胞或巨核細胞祖細胞分化，進一步增殖產(chǎn)生成熟的白細胞、紅細胞或巨核細胞。每個巨核細胞又能產(chǎn)生數(shù)千個有功能的血小板。
造血干細胞分化增殖產(chǎn)生成熟的血細胞這一復(fù)雜的細胞和生物學過程稱造血發(fā)生(Hematopoiesis)。而造血干細胞分化成為巨核細胞祖細胞，再增殖產(chǎn)生巨核細胞，后者進一步成熟產(chǎn)生血小板，這一細胞和生物學過程稱巨核細胞生成(Megakaryocytopoiesis)(韓忠朝等，中華血液學雜志，14159-161，1993)。
已知不少因子如白介素(Interleukin或IL)3，6，11，粒單細胞集落形成刺激因子(GM-CSF)，干細胞因子(SCF)和紅細胞生成素(EPO)能對巨核細胞生成這一過程起調(diào)節(jié)作用，但一些在體外有一定刺激作用的因子在體內(nèi)卻沒有作用或作用甚微(Han等，Int J Hemnatol，543-14，1991)。已知再生障礙性貧血(再障)病人或動物血清中含有多種造血細胞生長因子如SCF、EPO、GM—CSF、IL6、粒細胞集落形成刺激因子(G-CSF)和成纖維細胞生長因子(FGF)，對造血干細胞和祖細胞有明顯的刺激作用。此外還含有對巨核細胞和血小板的生長有特異性刺激作用的因子。目前已經(jīng)純化分離和分子克隆出二種因子，一種是c-Mpl ligandthrombopoietin/MK-CSF(血小板生成素/巨核細胞集落形成刺激因子)，對巨核細胞和血小板生成有明顯刺激作用(Sauvage etal，Nature369533-538，1994；Kaushansky et al，Nature369568-571，1994)，另一種是發(fā)明者從再障病人的尿中純化分離出一種新的造血細胞生長因子——巨核細胞生成素(MPO)，它對巨核細胞的生長和血小板生成也有明顯刺激作用。
在正常情況下，造血干細胞和祖細胞主要存在于骨髓中，新生兒臍帶血中含量也很豐富，成人末梢血則含量甚微。骨髓和臍帶血都可用作造血干祖細胞的來源。但是每個臍帶所含的血中和每次可采集的骨髓中含有的造血干祖細胞的絕對數(shù)較低，不能滿足移植的需要。根據(jù)一些資料統(tǒng)計，每個臍帶所含的血量平均為100ml，可分離40×107單個核細胞，約2-5×104粒單細胞集落形成單位(CFU-GM)。如模擬體內(nèi)條件(EX VIV0)進行體外擴增可以使造血干祖細胞的數(shù)量增加幾倍到幾十倍。這些細胞可以供移植需要，也可長期凍存，建立造血干細胞庫。這些細胞輸入體內(nèi)，可很快分化增殖形成成熟血細胞，因此可以治療各種血細胞減少癥，也可移植給骨髓衰竭病人，重建其造血功能。
目前進行造血干祖細胞EX VIVO擴增的方法主要為分離采集臍帶血或骨髓單個核細胞或CD34+細胞，然后體外培養(yǎng)，加入一種或多種血細胞生長因子去刺激干細胞向祖細胞分化，使祖細胞的數(shù)量在一定時間內(nèi)明顯增多。最常用的因子有IL1、IL3、IL6、SCF、GM-CSF、G-CSF和EPO。這些方法能擴增CFU-GM和暴式紅細胞集落形成單位(BFU-E)，對于細胞也有作用，但對巨核細胞祖細胞的作用有限。最近的資料進一步表明臍帶血單個核細胞移植后的血小板恢復(fù)較慢。因此新的祖細胞擴增和采集方法為臍帶血或骨髓的移植所必需。
為此，本發(fā)明目的是提供一種體外擴增和大量制備人和動物造血干細胞、祖細胞以及巨核細胞的方法，是在培養(yǎng)條件中加入人血小板第四因子和(或)藻類多糖，或與造血細胞生長因子聯(lián)合相繼或同時使用。
本發(fā)明涉及的方法明顯優(yōu)于已知的方法，其主要特征之一是PF4的應(yīng)用。PF4是造血細胞特別是巨核細胞祖細胞的生長抑制因子。將PF4加到人骨髓細胞培養(yǎng)中能顯著抑制巨核細胞祖細胞(CFU-MK)，粒單細胞祖細胞(CFU-GM)以及混合集落形成細胞(mCFU-MK)的生長(HAN等，Blood，761234-1239，1990；Br JHaematol，811-5，1992)，但對高增殖多能造血干細胞(HPP-CFS)的生長沒有抑制作用(Har，J Lab&Clin Med，123610-6，1994)。本發(fā)明用人血小板中純化的或基因重組的PF4，并采用FACS(流式細胞分析儀)分析PF4對細胞生長周期的作用，觀察到PF4能阻止細胞進入G2/M期，并使增殖細胞壽命延長。經(jīng)PF4孵育的巨核細胞株細胞洗滌后重新種植到富含造血生長因子的培養(yǎng)基中，能很快增殖使細胞數(shù)顯著增多。同樣，經(jīng)PF4孵育3-6天的骨髓細胞洗滌后重新種植到富含造血生長因子的培養(yǎng)基中，能使集落形成顯著增多。這些結(jié)果證實PF4對造血細胞生長的抑制是可逆非細胞毒的，其作用主要是延緩細胞增殖。
本發(fā)明的另一特征是藻類多糖的使用。藻類多糖是從海洋藻類中分離出來的粘多糖樣物質(zhì)。實驗證明，低濃度的海洋藻類在有血清，特別是再障血清時，對巨核細胞生長有明顯的刺激作用。海洋藻類還能中和PF4和轉(zhuǎn)移生長因子β1(TGFβ1)對巨核細胞生長的抑制作用。此外，藻類多糖并能增強MPO，IL6和FGF刺激巨核細胞生長的活性，與GM-CSF和EPO分別合用能協(xié)同刺激CFU-GM和BFU-E的生長。用藻類多糖作原料生產(chǎn)的藥物藻酸雙脂鈉也具有類似作用。
將藻酸雙脂鈉注射入小鼠體內(nèi)，每天一次共注射5天，便能使小鼠骨髓中巨核細胞和末梢血中血小板數(shù)量增加。如與IL6合用，這一促巨核細胞-血小板生長的作用更為明顯。綜上所述，藻類多糖實為一種新的促巨核細胞-血小板生長的物質(zhì)。以藻類多糖單獨或復(fù)合一些生長因子而制備的藥品可用于治療血小板減少癥和其它血細胞減少癥。
本發(fā)明的另一特征是使用臍帶血清或再障血清替代造血細胞生長因子去擴增造血干、祖細胞。由于造血細胞生長因子價格高昂且來源有限，因此價格低廉的造血細胞生長因子替代物的使用更為實用。臍帶血通常為遺棄物。需接受干細胞移植的病人如再障或白血病化療后移植前均有血細胞減少，故其血清含較高的造血細胞生長刺激活性，特別是受體血清的使用還可減少免疫反應(yīng)和移植排斥現(xiàn)象。本發(fā)明的實驗證實臍帶血清和再障病人血清具有造血細胞生長因子同樣甚至更明顯的擴增作用。藻類多糖與再障血清，或與MPO、IL6、IL3、GM-CSF、FGF、EPO和SCF一起加到骨髓細胞培養(yǎng)中，能使這些因子刺激細胞集落形成的活性進一步增高。這些可通過流式細胞儀分析發(fā)現(xiàn)人CD34陽性細胞數(shù)目、骨髓和臍帶血造血細胞集落形成分析來證實。
本發(fā)明的又一特征是PF4、造血細胞生長因子(或臍帶血清和再障血清)以及藻類多糖的先后有機結(jié)合使用。其原理是將骨髓或臍帶血細胞與含有PF4和臍帶血清或再障血清的培養(yǎng)液孵育3-6天，促使早期干細胞向祖細胞分化增殖，阻止祖細胞進入G2/M期進行分裂增殖，并加速原已喪失增殖能力的細胞成熟死亡，從而使造血干細胞和祖細胞的比例和絕對數(shù)值大大增高。細胞然后經(jīng)含藻類多糖的培養(yǎng)液洗滌，去除PF4，再種植到富含造血細胞生長因子(或臍帶血清和再障血清)以及藻類多糖的培養(yǎng)液中培養(yǎng)擴增，從而獲得大量的造血干細胞和祖細胞。根據(jù)所給造血細胞生長因子的不同，可定向擴增不同的造血干細胞和祖細胞，還可以從中擴增和分離濃縮巨核細胞-血小板。
本發(fā)明用下列實施例進一步說明，但并不限制本發(fā)明范圍例1，人紅白細胞白血病(HEL)是一種具有巨核細胞特征白血病，PF4能抑制HEL的生長(Han et al，J Lab&Clin Med，1201992)。將純化的人PF4(5μg)加到HEL培養(yǎng)體系中培養(yǎng)3天，然后用FACS觀察PF4對細胞周期的作用。結(jié)果顯示PF4延長細胞S期時間，使進入G2/M期的細胞明顯減少，說明PF4的作用是阻止細胞進入分裂(表1)。采用基因重組的人PF4作上述試驗，得出的結(jié)果相似(結(jié)果未列入)。
表1，人血小板因子4(PF4)對細胞周期的作用
例2，將人PF4、TGFβ1和藻類多糖(ZD)分別與Balb/c小鼠的骨髓細胞(2×105/ml)一起加到含10％人再障血清的血漿凝塊培養(yǎng)體系中培養(yǎng)10天，然后按Han et al的方法(Br J Haematol，811-5，1992)，鑒別各類祖細胞數(shù)量。表2顯示PF4和TGFβ1對CFU-GM、CFU-MK和BFU-E有抑制作用，對HPP-CFC沒作用。它們的抑制作用能被從海帶中分離的藻類多糖物質(zhì)(ZD)的同時加入所中和。ZD本身對CFU-MK的生長也有刺激作用。
表2，人PF4和TGFβ1對造血祖細胞生長的作用
結(jié)果以均數(shù)＋標準差表示。符號*和#分別表示P＜0.01和P＜0.05。統(tǒng)計分析采用Student′st檢驗。
例3，藻類多糖(ZD)除單獨能刺激CFU-MK生長外，還能在體外與MPO、IL6和bFGF起協(xié)同刺激作用，促進巨核細胞集落的形成，還與GM-CSF或EPO協(xié)同刺激CFU-GM或BFU-E的生長。表3顯示ZD單獨或與生長因子聯(lián)合對造血干細胞和祖細胞生長的作用。
表3，藻類多糖(ZD)單獨或與生長因子聯(lián)合對造血干細胞和祖細胞生長的作用
例4，將藻酸雙脂鈉注射到不同組的Balb/c小鼠(250g/只)體內(nèi)，每組至少5只小鼠。劑量為1-50μg/次，每天兩次，連續(xù)注射6天，然后檢測其骨髓造血干細胞和血液中血小板的數(shù)量。其結(jié)果見下表4
該符號表示與劑量0組比較，P＜0.05。
本實驗用的藻酸雙脂鈉系青島第三制藥廠生產(chǎn)的藻酸雙脂鈉注射液。此藥主要用于抗凝、隆血脂、改善微循環(huán)，劑量1-3mg/kg體重量/日。本實驗證明低劑量藻酸雙脂鈉可升高巨核細胞和血小板的數(shù)量。
例5，經(jīng)人PF4孵育24小時的骨髓細胞經(jīng)含藻類多糖物質(zhì)的培養(yǎng)液二次洗滌后，骨髓細胞再種植到血漿凝塊培養(yǎng)體系中。結(jié)果發(fā)現(xiàn)其干、祖細胞的生長不再明顯受到抑制(表5)，說明藻類多糖有能中和PF4的作用。
例6，將每公斤150毫克的5-fluorouracil注入Balb/c小鼠，注射后第六天，小鼠出現(xiàn)骨髓衰竭，此時將采集的骨髓細胞，與PF4孵育48小時，然后將孵育后的細胞重新種植到含干細胞因子或IL3加IL6的血漿凝塊培養(yǎng)體系中培養(yǎng)12天，然后檢測各類造血細胞集落數(shù)量，發(fā)現(xiàn)PF4孵育后被干細胞因子或IL3加IL6刺激生長的造血細胞集落數(shù)量明顯增高。這些結(jié)果表明PF4的孵育能增高干細胞的數(shù)量(表6)。
例7，將臍帶血單個核細胞(2×105細胞/毫升)加到含10-4M的2-巰基乙醇和1％牛血清白蛋白的α-培養(yǎng)液中，再加10％體積的再障血清、臍帶血清以及藻類多糖和細胞生長因子培養(yǎng)6天，然后用FACS檢測CD34+細胞的百分率。另一實驗是將臍帶血單個核細胞加到含不同因子來源的血漿凝塊中培養(yǎng)12天，然后檢測CFU-州、CFU-MK和BFU-E的數(shù)量。結(jié)果見表7，發(fā)現(xiàn)臍帶血清具有再障血清以及五種因子組合的類似活性。藻類多糖的添加使它們的活性進一步增高。
表5，藻類多糖物質(zhì)(ZD)對PF4的作用
<p>表6，PF4孵育對造血細胞集落生長的作用
表7，再障血清、臍帶血清以及各種因子組合對造血干祖細胞數(shù)量的作用比較
例8，基于這些發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明先將PF4與臍帶血單個核細胞在含5％臍帶血清的培養(yǎng)液中孵育48小時，細胞然后經(jīng)含藻類多糖脂物質(zhì)的培養(yǎng)液洗滌后，再加入到含再障血清或臍帶血清或生長因子和藻類多糖組份的血漿凝塊培養(yǎng)液中培養(yǎng)12天去檢測各種造血祖細胞的數(shù)量，結(jié)果顯示HPP-CFC、CFU-MK和CFU-GM的數(shù)量明顯增高，其中以PF4加再障血清加藻類多糖或PF4加IL6加IL3加藻類多糖的配方對提高CFU-MK的數(shù)量最佳，而PF4加GM-CSF加SCF加藻類多糖的配方對提高CFU-GM的數(shù)量作用最佳，PF4加SCF加EPO加藻類多糖的配方對提高BFU-E的數(shù)量作用最佳，PF4加SCF加bFGF加藻類多糖對干細胞的作用最佳。
表8，PF4孵育對造血干、祖細胞生長的影響
結(jié)果以與未加PF4但加5％臍帶血清孵育48小時后的臍帶血單個核細胞再經(jīng)血漿凝塊培養(yǎng)所得的結(jié)果比較得出的倍數(shù)來表達。
權(quán)利要求
1.一種體外擴增和大量制備人造血干細胞、祖細胞以及巨核細胞的方法，其特征是在培養(yǎng)條件中加入人血小板第四因子和(或)藻類多糖。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是所應(yīng)用的人血小板第四因子可以是從人血小板中純化的天然蛋白，也可以是基因重組或化學合成的蛋白肽或其活性片斷。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是所應(yīng)用的藻類多糖是從海藻中分離的粘多糖樣物質(zhì)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是人血小板第四因子和藻類多糖可以與造血細胞生長因子或臍帶血清和再生障礙性貧血病人血清相繼或同時聯(lián)合使用。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是擴增制備的造血干細胞和祖細胞以及巨核細胞懸液可凍存建立干細胞庫。
6.根據(jù)權(quán)利要求1、2、3、4所述的方法，其特征是用人血小板第四因子或藻類多糖以單一成份或復(fù)合成份或與治療有效量的造血細胞因子和白細胞介素配制成可在體內(nèi)擴增血細胞的藥物。
全文摘要
本發(fā)明涉及體外擴增造血干細胞和祖細胞，特別是巨核細胞及其祖細胞的方法，可以單獨使用人血小板第四因子(簡稱PF4)或藻類多糖(簡稱ZD)和一些造血細胞生長因子相繼或同時聯(lián)合使用，擴增的造血干細胞和祖細胞制劑，可凍存建立造血干細胞和祖細胞庫，用于治療細胞供者本人或其他人在患血細胞特別是血小板減少癥，各種骨髓移植適應(yīng)癥時輸注或移植，采用本發(fā)明方法涉及的人PF4和ZD制作成藥物，可用于體內(nèi)擴增血細胞達到治療目的。
文檔編號C12N5/08GK1122368SQ9411397
公開日1996年5月15日 申請日期1994年11月4日 優(yōu)先權(quán)日1994年11月4日
發(fā)明者韓忠朝 申請人:上海貝特生物技術(shù)有限公司