專利名稱：：干細(xì)胞的提純、識(shí)別以及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：該項(xiàng)發(fā)明涉及新的干細(xì)胞群的提純以及其在血管病理和其他類型的人類病理的治療的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：眾所周知，成體的外周血中含有來(lái)源于骨髓的循環(huán)細(xì)胞(circulatingcells),該細(xì)胞能夠分化為成熟的內(nèi)皮細(xì)胞(ECs)，所以又叫做內(nèi)皮袓細(xì)胞(EPCs)。這些細(xì)胞可以位于缺血的部位，用來(lái)形成新的血管。由于具有這些特質(zhì)，EPCs細(xì)胞已成功地應(yīng)用在體內(nèi)動(dòng)物模型以及急性心肌梗塞和慢性缺血性心臟病病人的組織修復(fù)中。另一方面，終末分化的成熟內(nèi)皮細(xì)胞的缺血后再輸注不能導(dǎo)致血管化(vascularizatio)的增加，因?yàn)楹苊黠@這些細(xì)胞失去了分化的潛能。我們知道，EPCs細(xì)胞可以從CD133+細(xì)胞、CD34+CD14-細(xì)胞和CD14+CD34-細(xì)胞中獲得，雖然后者是否真的具有干細(xì)胞的潛能還不確定。而且，外周血和骨髓中的內(nèi)皮祖細(xì)胞的真實(shí)數(shù)目仍有待商榷。這些細(xì)胞對(duì)于由缺血、病理因素或外傷所導(dǎo)致的組織損傷的重建具有潛在的重要意義，因此，人們對(duì)這個(gè)領(lǐng)域的深入研究有著極大興趣。同樣已知在最近一個(gè)叫做NANOG的基因被報(bào)道，其顯示出在胚胎干細(xì)胞多能性的更新和維持中所起的關(guān)鍵作用，NANOG在成體干細(xì)胞中的表達(dá)還鮮有研究。圖1顯示出NANOG在具有干細(xì)胞潛力的成體細(xì)胞中和來(lái)源于其它組織的細(xì)胞中的不同表達(dá)。圖2顯示出NANOG在培養(yǎng)的EPCs細(xì)胞中的表達(dá)。圖3顯示出培養(yǎng)的EPCs細(xì)胞的各種標(biāo)記物在mRNA水平上的表達(dá)狀況。圖4表明培養(yǎng)的EPCs細(xì)胞為CD14+CD34+。圖5(A)顯示從CD14+循環(huán)細(xì)胞中分離的CD14+CD34-細(xì)胞和CD14+CD34+細(xì)胞。圖5(B)顯示出NANOG在三種截然不同的細(xì)胞群—CD14+CD34+、CD14+CD34-和CD14+群中的表達(dá)狀況。圖6顯示出CD14+CD34+、CD14+CD34-和CD14-CD34-細(xì)胞分化成內(nèi)皮細(xì)胞以及表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞特異性標(biāo)記物的不同能力。具體實(shí)施例方式本發(fā)明使得涉及可應(yīng)用于組織重建治療的新的干細(xì)胞群的用途、以及如何識(shí)別和恢復(fù)上述細(xì)胞。而且，利用該發(fā)明還涉及實(shí)現(xiàn)用于評(píng)估具有干細(xì)胞潛能的循環(huán)細(xì)胞的百分比(及其絕對(duì)數(shù)目)的診斷試劑盒，以及用于治療目的的提純上述細(xì)胞的試劑盒。事實(shí)上，令人驚訝地發(fā)現(xiàn)因?yàn)镹ANOG基因在來(lái)源于臍帶、外周血或CD34+細(xì)胞的CD133+細(xì)胞中表達(dá)，所以NANOG基因已成為識(shí)別成體干細(xì)胞的一個(gè)有用的標(biāo)記物。眾所周知這些細(xì)胞是具有干細(xì)胞能力的細(xì)胞。相反的，NANOG基因在原代培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞，以及淋巴細(xì)胞或其它終末分化的細(xì)胞類型中都不表達(dá)(圖1)。另外，在為了獲取EPCs細(xì)胞而培養(yǎng)的單核循環(huán)細(xì)胞(MNC)中，NANOG有高水平的表達(dá);然而，當(dāng)這些細(xì)胞具有終末分化細(xì)胞的表征特征以及成熟的內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物(如VonWillebrand因子、KDR和Tie-2)時(shí)，NANOG基因的表達(dá)就消失了(圖2)。實(shí)時(shí)定量RT-PCR實(shí)驗(yàn)顯示，EPCs細(xì)胞中有高水平的NANOG、CD14+、CD34+和CD105+的表達(dá)(圖3)。利用細(xì)胞熒光表面分析，上述細(xì)胞也表現(xiàn)為CD14+、CD105+、CDllc+、CD31+、CD86+、HLA-DR+，但是使用常用的細(xì)胞熒光技術(shù)卻檢測(cè)不到細(xì)胞表面的CD34+標(biāo)記(表1)。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>為了確定CD34是否也在上述細(xì)胞的表面表達(dá)，我們使用了一種更加靈敏的方法，即檢測(cè)的相應(yīng)mRNA的高水平表達(dá)。特別是，為了這一目的在細(xì)胞熒光技術(shù)中還使用了抗體(Ab)偶聯(lián)的磁性熒光脂質(zhì)體(Ab-CMFL)，該項(xiàng)技術(shù)可以使熒光信號(hào)增強(qiáng)大約100-1000倍。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，幾乎所有培養(yǎng)的細(xì)胞都是CD14+CD34+的(圖4)。如前所述，本發(fā)明中涉及的細(xì)胞群的表面同時(shí)含有CD14和CD34標(biāo)記物，這使得將外周血中的該群細(xì)胞與其它單核細(xì)胞分離成為可能。如前所述，除了循環(huán)血以外，該發(fā)明中的細(xì)胞分離方法也可以在躋帶血、骨髓、胎盤或成體組織中進(jìn)行類似的操作。為了鑒定培養(yǎng)的CD14+CD34+EPCs細(xì)胞群是否起源于外周血中預(yù)先存在的細(xì)胞群，我們利用一種密度梯度的方法(密度為1.077克/升)將單核細(xì)胞與血液中存在的其它細(xì)胞成分分離。CD14+細(xì)胞則通過一種陽(yáng)性分選(positiveseparation)磁性柱的方法從外周血的單核細(xì)胞群中被提純出來(lái)。一旦確定了細(xì)胞的數(shù)量，這些細(xì)胞便被孵育在含有偶聯(lián)了超順磁微球(superparamagneticmicrospheres)的抗CD14抗體的緩沖液中，然后被置于一個(gè)磁場(chǎng)中的柱子里。將柱子移離磁場(chǎng)后，CD14+細(xì)胞組分可以通過洗脫的方式恢復(fù)。被提純的CD14+細(xì)胞組分(同源度〉95n/。)分別依次用下列抗體孵育偶聯(lián)了熒光素的抗CD34抗體，偶聯(lián)了異羥基洋地黃甙(digoxigenin)的抗熒光素抗體，偶聯(lián)了生物素(biotin)的抗異羥基洋地黃甙抗體，最后是預(yù)先偶聯(lián)了抗生物素抗體的熒光脂質(zhì)體(Ab-CMFL)(圖5(A))。經(jīng)過上述處理后，通過分選細(xì)胞熒光計(jì)的分析并且CD14+CD34+細(xì)胞群被分離出來(lái)(純度>98%)。利用Ab-CMFL技術(shù)，我們測(cè)量出10個(gè)年齡在24-40歲之間的健康個(gè)體中同時(shí)表達(dá)CD14+和CD34+的細(xì)胞的百分比。CD14+CD34+細(xì)胞的百分比占所有白細(xì)胞的1.2%-7.5%。為了證實(shí)CD14+CD34+循環(huán)細(xì)胞是EPCs細(xì)胞的最初的來(lái)源，我們使用Ab-CMFL技術(shù)將CD14+細(xì)胞從單核細(xì)胞群中提純出來(lái)，并分成CD34+和CD34-兩個(gè)細(xì)胞亞群。殘余的CD14-CD34-細(xì)胞群用作后面檢測(cè)中的對(duì)照。然后，我們用定量RT-PCR的方法檢測(cè)上述三組細(xì)胞群中NANOG基因的表達(dá)情況。與未分離的CD14+細(xì)胞比較，NANOG基因在CD14+CD34+細(xì)胞中表現(xiàn)出極高的表達(dá)，而在CD14+CD34-細(xì)胞中表達(dá)量極低，(圖5(B))。我們檢測(cè)在上述條件且VEGF存在下培養(yǎng)的CD14+CD34+、CD14+CD34-和CD14-CD34-細(xì)胞亞群在第12天時(shí)典型內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物(如KDR和vWf)的表達(dá)狀況。結(jié)果顯示，KDR禾BvWf的mRNA的表達(dá)在CD14+CD34-和CD14-CD34-兩個(gè)細(xì)胞群中第O天時(shí)沒有表達(dá)或者表達(dá)量極低；而CD14+CD34+細(xì)胞亞群中的上述標(biāo)記物的表達(dá)隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加而增多，第12天時(shí)到達(dá)最高值，CD14+CD34-和CD14-CD34-細(xì)胞亞群的上述標(biāo)記物的表達(dá)則在整個(gè)培養(yǎng)時(shí)期中沒有明顯變化。利用流式細(xì)胞檢測(cè)方法檢測(cè)細(xì)胞表面KDR和Tie-2的表達(dá)，結(jié)果證實(shí)CD14+CD34+細(xì)胞群的所有細(xì)胞基本上都表達(dá)KDR和Tie-2，而來(lái)源于CD14+CD34-和CD14-CD34-細(xì)胞群的細(xì)胞中卻檢測(cè)不到上述的標(biāo)記物(圖6)。表達(dá)NANOG的EPC細(xì)胞都是CD14+CD34+陽(yáng)性的，這些細(xì)胞起源于表達(dá)NANOG的事先存在在外周血中的CD14+CD34+循環(huán)細(xì)胞。很明顯，以NANOG的表達(dá)為特征的CD14+CD34+細(xì)胞群是EPCs細(xì)胞的主要來(lái)源。因此，表達(dá)NANOG的CD14+CD34+細(xì)胞從血液中的恢復(fù)以及應(yīng)用對(duì)于血管損傷的治療有很重要的意義。另外，檢測(cè)NANOG的表達(dá)可以成為檢測(cè)成人細(xì)胞的干細(xì)胞潛能的一種有效的方法。NANOG的表達(dá)是干細(xì)胞多能性的一個(gè)特征，表明上述干細(xì)胞群可能對(duì)于治療其他類型的器官或組織導(dǎo)致的損傷有積極的作用。本發(fā)明也可以用于藥品成分的研制，可能對(duì)于下列疾病的細(xì)胞治療具有一定的積極作用，如局部缺血、神經(jīng)退行性疾病或腦血管疾病，器官損傷(如心臟、腎臟、肺、肝臟或胰腺的衰竭，以及泌尿生殖器官、視覺器官、聽覺器官、嗅覺器官、皮膚和/或粘膜、骨骼和/或軟骨等器官和組織的重建)，血液疾病和免疫缺陷等。而且，基于病人有足夠多的細(xì)胞數(shù)的表達(dá)或缺失，確定病人血液中所含有的細(xì)胞數(shù)目的能力展現(xiàn)出用于評(píng)估治療上述疾病的適合的細(xì)胞治療方案的有益方法。實(shí)驗(yàn)例CD14+細(xì)胞或HMVEC細(xì)胞(8乂106個(gè)細(xì)胞/毫升，細(xì)胞密度為2.5x106個(gè)細(xì)胞/cm"孵育在預(yù)先鋪有人纖粘連蛋白的培養(yǎng)板上，基礎(chǔ)內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基中富含EGMSingleQuotes、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)(100納摩/毫升)和20%小牛血清(FCS)。從上述細(xì)胞中提取的總RNA用脫氧核糖核酸酶I(DnaseI)處理，從而去除掉可能混雜的基因組DNA污染物。Taq-ManRT-PCR實(shí)驗(yàn)按照LasagniL等人描述的方法進(jìn)行操作(參照"AnalternativesplicedvariantofCXCR3mediatesIP-10,MigeI-TACinduced-inhibitionofendothelialcellgrowthandactsasfunctionalreceptorforPF-4."J.Exp.Med,2003;197:1537-1549)通過使用Taq-Man分析商業(yè)試劑盒(產(chǎn)自AppliedBiosystems，Warrington,UK)確定Tie-2、KDR以及CDla的定量。標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)自于從HMVEC細(xì)胞獲得的mRNA的一系列稀釋產(chǎn)物。為了特異性定量檢測(cè)在不同的人類組織和培養(yǎng)物中的NANOG的mRNA的表達(dá)，我們準(zhǔn)備了可以識(shí)別鼠科NANOG基因的人類同源物(定位于染色體的12p13.31)的不同的寡核苷酸對(duì)。為了確保特異性，由上述寡核苷酸擴(kuò)增而來(lái)的全序列要使用NCBI中的tBLASTn軟件在整個(gè)人類基因組中進(jìn)行搜索。具有特異性的寡核苷酸對(duì)用于定量Taq-manRT-PCR實(shí)驗(yàn)，以及VIC標(biāo)記的熒光探針。上述寡核苷酸的特異性和最佳擴(kuò)增效率用一個(gè)含有NANOGcDNA序列的質(zhì)粒來(lái)檢驗(yàn)。引物及探針序列分別如下VIC探針5'-TCCATCCTTGCAAATGTCTTCTGCTGAGAT-3';正向引物5'GATTTGTGGGCCTGAAGAAAACT-3';反向引物5'-AGGAGAGACAGTCTCCGTGTGAG-3'。mRNA水平的定量來(lái)自與標(biāo)準(zhǔn)曲線中實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的比較，而標(biāo)準(zhǔn)曲線是通過同樣含量的質(zhì)粒DNA的一系列稀釋產(chǎn)物得到的。流式細(xì)胞技術(shù)在Ab-CMFL實(shí)驗(yàn)之后進(jìn)行，用來(lái)檢測(cè)細(xì)胞表面的分子，該技術(shù)的操作步驟參照前面提及的文獻(xiàn)(參照ScheffoldA.等人發(fā)表的"Highsensitivityimmunofluorescencefordetectionofthepro-andanti-inflammatorycytokinesgammainterferonandinterleukin-10onthesurfaceofcytokine-secretingcells"Nat.Med.2000;6:107-110.)。該方法與常規(guī)方法相比，能夠增強(qiáng)熒光信號(hào)強(qiáng)度100-1000倍。貼壁細(xì)胞在鋪有多聚L-賴氨酸的基質(zhì)上37°C孵育30分鐘，再與acLDL雙標(biāo)記的探針孵育一個(gè)小時(shí)。樣品被固定后，與FITC偶聯(lián)的荊豆凝集素I(UlexeuropeusagglutininI)—起孵育。使用防淬滅劑封片，并用常規(guī)的共聚焦顯微技術(shù)檢查。權(quán)利要求1.識(shí)別具有干細(xì)胞能力的成人細(xì)胞的方法，其中轉(zhuǎn)錄因子NANOG的RNA和/或蛋白的表達(dá)被測(cè)量。2.干細(xì)胞群，其特征在于在細(xì)胞表面同時(shí)表達(dá)CD14+和CD34+。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的CD14+CD34+干細(xì)胞群從外周血恢復(fù)的方法，其中檢測(cè)細(xì)胞表面CD14和CD34標(biāo)記物的同時(shí)表達(dá)被用來(lái)將上述細(xì)胞群與外周血中殘余單核細(xì)胞中分離開來(lái)。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的恢復(fù)方法，其中所述的恢復(fù)是從循環(huán)血、臍帶血、骨髓、胎盤或成體組織中實(shí)施恢復(fù)。5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的CD14+CD34+細(xì)胞的提純過程，其中-利用密度梯度分離的方法將單核細(xì)胞與血液中其它的細(xì)胞組分分離(密度^.077g/l);-利用免疫磁性分離的方法提純外周血單核細(xì)胞群中的CD14+細(xì)胞；-CD14+CD34+細(xì)胞的恢復(fù)是通過將€014+細(xì)胞依次與熒光素偶聯(lián)的抗CD34抗體、異羥基洋地黃甙偶聯(lián)的抗熒光素抗體、生物素偶聯(lián)的抗異羥基洋地黃甙抗體以及預(yù)先用抗生物素抗體偶聯(lián)的熒光脂質(zhì)體(Ab-CMFL)孵育。6.如權(quán)利要求2所述的細(xì)胞用于制備用于治療局部缺血、神經(jīng)退行性或腦血管疾病，以及心、腎、肺、肝或胰腺衰竭損傷，泌尿生殖器、視覺、聽覺、嗅覺、皮膚及粘膜、骨及軟骨器官和組織的重建，血液病和免疫缺陷的治療的藥物組分的用途(細(xì)胞治療)。7.包括一系列用于如權(quán)利要求2和5所述的細(xì)胞群的特異性標(biāo)記物的試劑盒，其可以用來(lái)識(shí)別和/或恢復(fù)如權(quán)利要求2所述的干細(xì)胞群。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的試劑盒，其中所述試劑為特異性識(shí)別CD14和CD34標(biāo)記物的抗體或探針，其與抗體(Ab)偶聯(lián)的磁性熒光脂質(zhì)體或其它能夠檢測(cè)權(quán)利要求2中所述的細(xì)胞群表面的低水平表達(dá)的分子的次級(jí)試劑關(guān)聯(lián)。9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的試劑盒，其中所述的試劑、抗體或探針針對(duì)以下標(biāo)記物是特異性的NANOG、CDllc、CD16eCD105、CD31、CD86eHLA-DR，它們可能與其它次級(jí)試劑一起用于檢測(cè)和/或恢復(fù)權(quán)利要求2中所述的細(xì)胞群。10.治療局部缺血，神經(jīng)退行性疾病或腦血管疾病，器官損傷(如心臟、腎臟、肺、肝臟或胰腺的衰竭，以及泌尿生殖器官、視覺器官、聽覺器官、嗅覺器官、皮膚和/或粘膜、骨骼和/或軟骨等器官和組織的重建)，血液疾病和免疫缺陷等疾病的方法，包括給病人輸注數(shù)量在1x106至100"06的權(quán)利要求2中所述的干細(xì)胞群。11.根據(jù)權(quán)利要求IO所述治療方法，其中在輸注之前，用干細(xì)胞生長(zhǎng)因子和/或促進(jìn)組織特異性分化的因子處理權(quán)利要求2所述的干細(xì)胞并使之?dāng)U增和/或活化。12.對(duì)權(quán)利要求9中所述的疾病采取細(xì)胞治療的適當(dāng)程度的評(píng)估方法，其中病人細(xì)胞的數(shù)目根據(jù)權(quán)利要求2中所述的方法測(cè)定。全文摘要這里描述一種新的循環(huán)CD14+細(xì)胞群，其右地密度表面CD34表達(dá)病情具有干細(xì)胞能力，及其提純喝識(shí)別方法，以及其治療用途。文檔編號(hào)A61K35/00GK101133327SQ200580039047公開日2008年2月27日申請(qǐng)日期2005年11月14日優(yōu)先權(quán)日2004年11月15日發(fā)明者保羅·洛馬戛納尼,塞吉奧·洛馬戛納尼,弗朗西斯科·阿努扎托,恩里克·馬吉申請(qǐng)人:阿茲恩達(dá)奧斯潘的里雷拉大學(xué)卡雷吉校區(qū)