專利名稱：輪狀病毒p[2]g3株和p[8]g1株在kmb17細(xì)胞上適應(yīng)培養(yǎng)方法和免疫原性的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于病毒培養(yǎng)方法，特別涉及輪狀病毒在人細(xì)胞上的培養(yǎng)。
背景技術(shù)：
任何一種疫苗的安全性和有效性都是其最重要的基本要素，在研制疫苗時(shí)最大限 度考慮安全性非常重要。影響疫苗安全性的因素很多，其中用于制備疫苗的細(xì)胞基質(zhì)是重 要因素之一。細(xì)胞基質(zhì)作為制備疫苗的原材料，其質(zhì)量的優(yōu)劣，直接影響疫苗的質(zhì)量和產(chǎn) 量，尤其是疫苗的安全性。輪狀病毒(Rotavirus，RV)疫苗在預(yù)防RV感染中發(fā)揮了重要作 用，但截至目前，國(guó)內(nèi)外RV疫苗主要是在動(dòng)物源性的細(xì)胞中制備的。由于動(dòng)物源性的原代 細(xì)胞可能攜帶潛在病毒和其他可傳播因子，對(duì)人用疫苗存在極大的安全隱患；其次非人源 性傳代細(xì)胞的殘余DNA具有使其他細(xì)胞生長(zhǎng)失控和致腫瘤性的潛在風(fēng)險(xiǎn)。而人二倍體細(xì)胞 與之相比，攜帶潛在病毒和致腫瘤的潛在危險(xiǎn)性較小。因此，使用人源性細(xì)胞取代非人源性 細(xì)胞制備人體疫苗是今后發(fā)展的方向。人二倍體細(xì)胞KMB17已成功用于甲型肝炎生產(chǎn)多 年，是一株安全、可靠的人源性細(xì)胞，基于這一思路，在前期研究中，我們選用輪狀病毒P [2] G3株在人胚肺二倍體細(xì)胞KMB17上進(jìn)行了病毒的適應(yīng)性培養(yǎng)和適應(yīng)毒株生物學(xué)性質(zhì)及其 免疫原性研究，但僅限于輪狀病毒P[2]G3株，未建立和研究P[8]G1株的免疫原性，而且所 獲得的輪狀病毒感染性滴度較低(105_ 5PFU/mL)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是選用輪狀病毒P [2] G3株和P [8] Gl株在人胚肺二倍體細(xì)胞KMB17上 進(jìn)行病毒的適應(yīng)性培養(yǎng)方法，進(jìn)一步提高病毒滴度，并通過毒株生物學(xué)性質(zhì)測(cè)試和參數(shù)確 定培養(yǎng)物所具有的免疫原性。本發(fā)明的目的通過以下方式實(shí)現(xiàn)輪狀病毒P [2]G3株和P [8]Gl株在KMB17細(xì)胞上的適應(yīng)性培養(yǎng)方法用含10%新生牛血清的MEM培養(yǎng)基在轉(zhuǎn)瓶中培養(yǎng)KMB17細(xì)胞，待細(xì)胞長(zhǎng)成致密單 層后，按0. 05M0I接種激活的輪狀病毒P [2] G3株和P [8] Gl株，待CPE達(dá)+++ ++++時(shí)，收 獲病毒液，以此方法，將病毒連續(xù)傳代10代。所述培養(yǎng)方法是用20ug/ml乙?；让?、600ug/ml的CaCl2 37°C水浴60min以激 活輪狀病毒P [2]G3株和P [8]Gl株，接種病毒后于37°C吸附90min，棄去未吸附的病毒液， 加入含終濃度為0. 5ug/ml乙?；让傅腗EM維持液，在37°C恒溫室中旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)備用。輪狀病毒P [2]G3株和P [8]Gl株在KMB17細(xì)胞上的適應(yīng)性培養(yǎng)的免疫原性病毒液的感染性滴度隨代次遞增，P[2]G3株峰10代的病毒滴度為7.75CCID5(1/ml， P [8] Gl 株峰 10 病毒滴度為 7. 33CCID50/ml。所述病毒在傳代過程中核酸帶型一致，呈典型的4 2 3 2型。所述該病毒分別用以下兩組引物擴(kuò)增
3
P[2]G3株VP7全長(zhǎng)基因特異性引物為Beg9，End9。序列如下Beg9 :5， -GAGAGAATTTCCGTTTGG-3，End9 :5’ -GGTCACATCATACAATTCTAACC-TAAG-3，；P[8]G1株VP7基因特異性引物為9conl，9con2(37-941bp)。序列如下9conl :5，-TAGCTCCTTTTAATGTATGG-3，，9con2 5，-GTATAAAATACTTGCCACCA-3，。回收PCR產(chǎn)物測(cè)序P[2]G3P[8]G1株第1代和第10代均擴(kuò)增出長(zhǎng)度1062bp的VP7特異性產(chǎn)物，P [8] Gl株第1代和第10代均擴(kuò)增出長(zhǎng)度905bp的VP7特異性產(chǎn)物，且核苷酸序列穩(wěn)定。所述P[2]G3株免疫小鼠抗血清產(chǎn)生的抗體效價(jià)為1 16384，P[8]G1株免疫小鼠 抗血清產(chǎn)生的抗體效價(jià)為1 8192。以上人胚肺二倍體細(xì)胞KMB17是一株用于人用疫苗生產(chǎn)的細(xì)胞株，由中國(guó)醫(yī)學(xué)科 學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所分子生物室保存，并能以商品出售和購(gòu)買的細(xì)胞株。輪狀病毒P[2]G3和P[8]G1株通過本發(fā)明在KMB17細(xì)胞上適應(yīng)性培養(yǎng)證明在傳 代過程中，病毒感染性滴度能夠穩(wěn)定在較高水平上，病毒能夠保持一致的核酸帶型及高度 的遺傳穩(wěn)定性，并且，用復(fù)制的病毒經(jīng)兩種途徑免疫小鼠均產(chǎn)生了較好的免疫效果。本發(fā)明具有的積極效果是本發(fā)明適應(yīng)性培養(yǎng)的輪狀病毒P[2]G3株和P[8]G1株可在KMB17細(xì)胞中穩(wěn)定復(fù) 制，所產(chǎn)生的病毒保持了親本毒株的基本生物學(xué)特性，并且有較好的免疫原性，由于KMB17 細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)，更適宜于輪狀病毒的生長(zhǎng)特性，另一方面，CaCl2有助于輪狀病毒在細(xì) 胞中的復(fù)制，經(jīng)CaCl2處理的輪狀病毒株，使得所獲得的病毒感染性滴度顯著高于之前的實(shí) 驗(yàn)結(jié)果，從而，能夠以人源性KMB17細(xì)胞作為輪狀病毒增殖的一種理想和安全的細(xì)胞基質(zhì)， 為制備安全的人體輪狀病毒疫苗奠定了重要基礎(chǔ)。


圖1是輪狀病毒感染KMB17細(xì)胞后的CPE及免疫熒光檢測(cè)結(jié)果。其中，A 正常 KMB17細(xì)胞；B 輪狀病毒感染KMB17細(xì)胞后的CPE ；C 陰性KMB17細(xì)胞對(duì)照D 接種輪狀病 毒后的陽(yáng)性細(xì)胞圖2是輪狀病毒P [2]G3株和P [8]Gl株1_10代病毒的感染性滴度曲線。圖3是兩株病毒1-10代基因組核酸帶型。圖中，M =DNA markerDL2000 ；A,B :1_10 P[2]G3株1-10代病毒基因組核酸帶型；C，D :P[8]G1株1_10代病毒基因組核酸帶型。圖4是兩株病毒擴(kuò)增的VP7基因片段。其中，A :P[2]G3株第1代和第10代VP7 全長(zhǎng)基因；B :P[8]G1株第1代和第10代VP7基因片段(37_941bp)。以下結(jié)合具體實(shí)施方式
對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說明，具體實(shí)施方式
包括但不限于實(shí)施 例內(nèi)容。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例所使用的材料包括猴輪狀病毒P [2] G3株(第18代，Vero細(xì)胞上增殖)，
4
人輪狀病毒P [8] Gl株(第10代，Vero細(xì)胞上增殖)。( 一 )輪狀病毒在KMB17細(xì)胞上的適應(yīng)性培養(yǎng)用含10%新生牛血清的MEM培養(yǎng)基在轉(zhuǎn)瓶中培養(yǎng)KMB17細(xì)胞，待細(xì)胞長(zhǎng)成致密單 層后，按0. 05M0I接種P[2]G3和P [8] Gl株病毒，觀察病變情況，待CPE達(dá)+++-++++時(shí)，收 獲病毒液。以此方法，將病毒連續(xù)傳代10代。病毒接種前可用20ug/ml的乙?；让浮?00ug/ml的CaCl2在37°C水浴60min激 活，接種病毒后于37°C吸附90min，棄去未吸附的病毒液，加入含終濃度為0. 5ug/ml乙?；?胰酶的MEM維持液中旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)。對(duì)照為等體積，培養(yǎng)條件相同的KMB17細(xì)胞。1(1^17細(xì)胞接種？[2]63( [8]61)株病毒后，可見細(xì)胞出現(xiàn)明顯的病變效應(yīng)(CPE)。 隨著病毒傳代代次的增高，細(xì)胞病變逐漸增快，收毒時(shí)間逐漸提前，在P[2]G3株第3代， P[8]Gl株第5代穩(wěn)定在種毒后48h以內(nèi)。( 二 )病毒感染細(xì)胞免疫熒光試驗(yàn)病毒感染細(xì)胞后24h，進(jìn)行免疫熒光試驗(yàn)。先用甲醇4°C固定lOmin，再用3%的 BSA37°C封閉30min，然后依次加入一抗、二抗，分別在37°C，5% CO2孵箱中孵育90min，熒光 顯微鏡下觀察結(jié)果。一抗分別為經(jīng)純化的輪狀病毒P[2]G3株全病毒顆粒免疫豚鼠的多克 隆血清；經(jīng)純化的輪狀病毒P[8]G1株全病毒顆粒免疫豚鼠的多克隆血清；二抗為FITC標(biāo) 記的兔抗豚鼠IgG。免疫熒光試驗(yàn)顯示輪狀病毒的復(fù)制是在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)完成的，接種的兩株病毒細(xì)胞 質(zhì)內(nèi)均出現(xiàn)明亮的綠色熒光，胞核黯淡，表明兩株病毒在KMB17細(xì)胞中確有增殖。(三)微量滴定結(jié)合熒光灶的方法測(cè)定病毒感染性滴度將MA104細(xì)胞按1. 5 X IO4/孔細(xì)胞數(shù)接種96孔板，待細(xì)胞長(zhǎng)成致密單層后，將病 毒用維持液做10倍等比稀釋，從KT1-IiT,每個(gè)稀釋度設(shè)10孔，每孔接種稀釋后的病毒 lOOul，并設(shè)細(xì)胞對(duì)照和未稀釋的病毒對(duì)照。于37°C 5% CO2孵箱培養(yǎng)15小時(shí)，進(jìn)行免疫熒 光實(shí)驗(yàn)。具體操作方法同(2)。分別測(cè)定兩株病毒各代病毒液的感染性滴度，結(jié)果顯示兩株病毒在傳代過程中， 滴度隨傳代代次的增加成逐漸遞增的趨勢(shì)，并穩(wěn)定在較高水平，即P[2]G3株峰10代的病毒 滴度 7. 75CCID50/ml, P [8] Gl 株峰 10 病毒滴度 7. 33CCID50/ml。(四)病毒基因組檢測(cè)采用小量病毒RNA/DNA抽提試劑盒提取兩株病毒1_10代收獲液基因組RNA，進(jìn)行 聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。分離膠濃度為10%，壓縮膠濃度為3. 5%。90V，電泳8 小時(shí)，硝酸銀染色。結(jié)果顯示，兩株病毒在傳代過程中保持了 一致的核酸帶型，呈典型的 4:2:3: 2型，具有良好的遺傳穩(wěn)定性。(五)RT-PCR擴(kuò)增VP7基因及測(cè)序P[2]G3株VP7全長(zhǎng)基因特異性引物為Beg9，End9。序列如下Beg9 :5， -GAGAGAATTTCCGTTTGG-3，End9 :5’ -GGTCACATCATACAATTCTAACC-TAAG-3，；P[8]G1株VP7基因特異性引物為9conl，9con2(37-941bp)。序列如下
9conl :5，-TAGCTCCTTTTAATGTATGG-3，，9con2 :5， -GTATAAAATACTTGCCACCA-3，。分別以以上兩組引物擴(kuò)增SAll株第1代和第10代，Wa株第1代和第10代。PCR
產(chǎn)物經(jīng)回收純化后測(cè)序。RT-PCR反應(yīng)得到的產(chǎn)物電泳結(jié)果顯示P[2]G3株第1代和第10代均擴(kuò)增出了 VP7 特異性產(chǎn)物，大小為1062bp。P[8]G1株第1代和第10代也擴(kuò)增出了大小為905bp的VP7 特異性產(chǎn)物。測(cè)序結(jié)果表明，P[2]G3株第10代和第1代病毒相比，基因序列未發(fā)生任何改 變。P[8]G1株第10代和第1代病毒相比，僅有一處基因發(fā)生了突變，即第421位核苷酸序 列C —G。表明兩株病毒在傳代過程中保持了高度的遺傳穩(wěn)定性。(六)動(dòng)物免疫試驗(yàn)和ELISA檢測(cè)血清抗體效價(jià)小鼠免疫分皮下注射和口服兩種途徑，每組6只小鼠。免疫原為經(jīng)氯仿抽提初步 純化后的P[8]G1株病毒液。皮下注射組0. Iml/只，分兩點(diǎn)皮下注射；口服組0. 2ml/只，灌 胃。對(duì)照組分別皮下注射0. Iml PBS和口服0.2ml PBS。免疫接種后2周和4周再分別加 強(qiáng)免疫一次，第5周尾靜脈采血。將經(jīng)凝膠過濾純化的P[8]G1株病毒作為抗原，稀釋至終濃度為lug/ml，取0. Iml 以碳酸鈉/碳酸氫鈉緩沖液4°C包被過夜，用3%的BSA37°C封閉lh。將制備的抗血清按最 低稀釋度1 4起倍比稀釋，取0. Iml加入酶標(biāo)板，每個(gè)稀釋度設(shè)2孔。37°C孵育Ih后，加 入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗小鼠IgG，37°C孵育lh，用OPD避光顯色20min，2mol/L硫酸 終止反應(yīng)，測(cè)定D49tl值。輪狀病毒特異抗體的陽(yáng)性判定標(biāo)準(zhǔn)為同稀釋度P[2]G3或P[8]G1株免疫組OD49tl 值彡2. 1倍PBS免疫組，且OD49tl絕對(duì)值> 0. 2。通過ELISA檢測(cè)三次免疫后的小鼠血清結(jié) 果表明，在KMB17細(xì)胞上擴(kuò)增的P [2]G3和P [8]Gl株病毒經(jīng)皮下注射和口服免疫兩種途徑 均能有效刺激小鼠產(chǎn)生針對(duì)兩株病毒的特異性抗體，兩種免疫效果無(wú)明顯差別，免疫P[2] G3株產(chǎn)生的抗體效價(jià)達(dá)到1 16384，免疫P[8]G1株產(chǎn)生的抗體效價(jià)達(dá)到1 8192。
權(quán)利要求
輪狀病毒P[2]G3株和P[8]G1株在KMB17細(xì)胞上適應(yīng)培養(yǎng)方法，其特征是用含10％新生牛血清的MEM培養(yǎng)基分別在轉(zhuǎn)瓶中培養(yǎng)KMB17細(xì)胞，待細(xì)胞長(zhǎng)成致密單層后，按0.05MOI接種激活的輪狀病毒P[2]G3株和P[8]G1株，待CPE達(dá)+++～++++時(shí)，收獲病毒液，以此方法，將病毒連續(xù)傳代10代。
2.如權(quán)利要求1所述的適應(yīng)培養(yǎng)方法，其特征是用20ug/ml乙酰化胰酶、600ug/ml的 CaCl2 37°C水浴60min以激活輪狀病毒P[2]G3株和P[8]G1株，接種病毒后于37°C吸附 90min,棄去未吸附的病毒液，加入含終濃度為0. 5ug/ml乙?；让傅腗EM維持液，在37°C 恒溫室中旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)備用。
3.輪狀病毒P[2]G3株和P [8]Gl株在KMB17細(xì)胞上適應(yīng)培養(yǎng)的免疫原性，其特征是該 病毒液的感染性滴度隨代次遞增，P[2]G3株峰10代的病毒滴度7. 75CCID50/ml, P[8]G1株 峰10代的病毒滴度7. 33CCID50/mlo
4.如權(quán)利要求3所述的免疫原性，其特征是該病毒在傳代過程中核酸帶型一致，呈典 型的4 2 3 2型。
5.如權(quán)利要求3所述的免疫原性，其特征是該病毒分別用以下兩組引物擴(kuò)增P[2]G3株VP7全長(zhǎng)基因特異性引物為Beg9，End9，序列如下Beg9 :5’ -GAGAGAATTTCCGTTTGG-3’End9 :5’ -GGTCACATCATACAATTCTAACC-TAAG-3，；P [8]Gl株VP7基因特異性引物為9conl，9con2(37-941bp)，序列如下9conl :5，-TAGCTCCTTTTAATGTATGG-3，，9con2 :5’ -GTATAAAATACTTGCCACCA-3’ ；回收PCR產(chǎn)物測(cè)序P[2]G3株第1代和第10代均擴(kuò)增出長(zhǎng)度1062bp的VP7特異性產(chǎn)物，P [8] Gl株第1代 和第10代均擴(kuò)增出長(zhǎng)度905bp的VP7特異性產(chǎn)物，且核苷酸序列穩(wěn)定。
6.如權(quán)利要求3所述的免疫原性，其特征是P[2]G3株免疫小鼠抗血清產(chǎn)生的抗體效價(jià) 為1 16384，P[8]G1株免疫小鼠抗血清產(chǎn)生的抗體效價(jià)為1 8192。
全文摘要
輪狀病毒P[2]G3株和P[8]G1株在KMB17細(xì)胞上適應(yīng)性培養(yǎng)和免疫原性，屬于病毒培養(yǎng)方法。本發(fā)明將兩株輪狀病毒在KMB17細(xì)胞上連續(xù)10代適應(yīng)培養(yǎng)，使細(xì)胞病變隨病毒代次逐漸增快，感染性滴度遞增并穩(wěn)定在較高水平。病毒滴度分別達(dá)到7.75CCID50/ml及7.33CCID50/ml。病毒適應(yīng)KMB17細(xì)胞且基因組穩(wěn)定，用復(fù)制的病毒免疫小鼠其血清中和抗體效價(jià)分別為1∶16384及1∶8192。本發(fā)明適應(yīng)性培養(yǎng)輪狀病毒P[2]G3株株和P[8]G1株可在KMB17細(xì)胞中穩(wěn)定復(fù)制，所產(chǎn)生病毒保持了親本毒株的基本生物學(xué)特性，且有較好免疫原性。
文檔編號(hào)C12N7/08GK101899422SQ201010179190
公開日2010年12月1日 申請(qǐng)日期2010年5月21日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月21日
發(fā)明者吳晉元, 孫茂盛, 張光明, 易山, 李鴻鈞, 馬應(yīng)霞 申請(qǐng)人:中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所