專利名稱：：一種高效誘導(dǎo)提取四種紫杉烷類化合物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種高效誘導(dǎo)提高紅豆杉新鮮枝葉中紫杉醇及其半合成前體物質(zhì)含量的方法。
背景技術(shù)：
：紫杉醇(paclitaxel，圖l)是具有五甲基十五碳烯骨架的二萜類化合物，是最早從太平洋紅豆杉(Taxusbrevifolia)樹(shù)皮中提取出來(lái)的一種天然抗癌藥物(Wanietal.，1971)，能與微管蛋白結(jié)合，并促進(jìn)其聚合、抑制癌細(xì)胞有絲分裂，阻止癌細(xì)胞的增殖(Kellingetal.,2003;佘琨等，2001)1992年被美國(guó)FDA正式批準(zhǔn)為抗癌新藥，紫杉醇對(duì)卵巢癌、乳腺癌、肺癌有較好的作用。近年來(lái)研究表明，紫杉醇對(duì)治療其它疾病也有一定潛力，如惡性黑色素瘤(羅士德等，1994)、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(Oliveretal.,1994)和早老性癡呆(Burkeetal.,1994)等。隨著國(guó)際市場(chǎng)上對(duì)紫杉醇需求量的日益增長(zhǎng)，野生紅豆杉資源遭到了毀滅性的破壞，人工種植紅豆杉已成為解決紫杉醇原料短缺的重要途徑(劉穎和肖艷，2005;黃玉仙，2005;吉前華,2004)，但如果采用傳統(tǒng)方法，從紅豆杉樹(shù)皮中提取紫杉醇，資源耗費(fèi)太大且人工種植周期長(zhǎng)，仍不能解決紫杉醇的原料問(wèn)題。目前供臨床使用的紫杉醇主要從紅豆杉樹(shù)皮中提取。紫杉醇在紅豆杉植物中含量很低,即使當(dāng)前公認(rèn)含量最高的短葉紅豆杉樹(shù)皮中也僅有O.Ol%0.03%。為了解決紫杉醇供需之間的尖銳矛盾，多年來(lái)科學(xué)工作者在尋找及擴(kuò)大紫杉醇藥源途徑方面做了不懈的努力。人們從以下幾個(gè)方面進(jìn)行了研究:紅豆杉細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)、全合成和半合成、產(chǎn)紫杉醇真菌的篩選和發(fā)酵培養(yǎng)，紫杉醇生物合成途徑中關(guān)鍵酶基因的克隆和工程菌的改造等。紫杉醇結(jié)構(gòu)復(fù)雜，化學(xué)合成難度較大。1988年Denis等報(bào)道了以10-去乙?；涂ㄍII為原料半合成紫杉醇。但是由于合成路線比較復(fù)雜,目前尚無(wú)商業(yè)應(yīng)用的價(jià)值。雖然已發(fā)現(xiàn)了一些生產(chǎn)紫杉醇的真菌,但是合成紫杉醇的能力極低，尚無(wú)發(fā)酵生產(chǎn)的價(jià)值，菌種選育、改良工作有待深入進(jìn)行。目前，人工種植的紅豆杉數(shù)量逐漸增加，給紫杉醇的獲得提供了新的來(lái)源，但是紅豆杉生長(zhǎng)緩慢，環(huán)境適應(yīng)性較弱，不能依靠人工種植紅豆杉的樹(shù)皮提取所需的紫杉醇，因此，應(yīng)該利用其可再生部位一一枝葉，對(duì)其新鮮的枝葉進(jìn)行充分的開(kāi)發(fā)利用。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)朋的目的在于提供一種利用紅豆杉新鮮枝葉為原料，通過(guò)加入各種誘導(dǎo)子，對(duì)其進(jìn)行誘導(dǎo)，從而提高體系中紫杉醇及其半合成前體物質(zhì)的含量來(lái)獲得紫杉醇產(chǎn)品的工藝方法。植物體內(nèi)有一套防御系統(tǒng)來(lái)生成一類抗病蛋白抵御外來(lái)病菌、蟲(chóng)害和損傷等不良環(huán)境。這些抗病蛋白可用于增加細(xì)胞壁強(qiáng)度、形成愈傷瘤、作為一種溶菌酶，以及合成植物抗生素等。本發(fā)明充分利用植物抗逆性生理和植物代謝理論，以新鮮的紅豆杉枝葉為原料，充分考慮到了新鮮物料中次生代謝產(chǎn)物形成過(guò)程中酶的活性，利用物料中含有豐富的紫杉醇半合成前體IO—脫乙?；涂ㄍII和巴卡亭III，通過(guò)人工誘導(dǎo)進(jìn)行勻漿體系中紫杉醇的生物半合成和游離態(tài)紫杉烷的轉(zhuǎn)化，以達(dá)到提高活性物質(zhì)含量的目的，進(jìn)一步提高原料的利用度。所述的紅豆杉新鮮枝葉，其特征在于其主要來(lái)源包括東北紅豆杉和南方紅豆杉。按照權(quán)利要求l所述的鮮磨勻漿，其特征在于植物中的大部分生物活性成分存在于細(xì)胞壁內(nèi)，由于細(xì)胞壁的屏障作用，減慢了生物活性成分向提取溶劑中轉(zhuǎn)移的速率。采用純水鮮磨勻漿時(shí)，對(duì)植物枝葉的細(xì)胞壁起到破壁作用，加快了胞內(nèi)物質(zhì)向溶劑中的釋放。按照權(quán)利要求l所述的酶水解，其特征在于所用的酶包括:淀粉酶和纖維素酶。在傳統(tǒng)的溶劑提取方法的基礎(chǔ)上，利用酶反應(yīng)具有高度專一性的特性，根據(jù)植物藥材細(xì)胞壁的構(gòu)成成分，選擇相應(yīng)的酶，將細(xì)胞壁的成分水解或降解，破壞細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，使有效成分充分釋放出來(lái)，溶解、混懸或膠溶于溶劑中，從而達(dá)到提取細(xì)胞內(nèi)有效成分的目的。由于植物提取過(guò)程中的屏障---細(xì)胞壁被破壞，因而酶法提取有利于提高有效成分的提取效率。此外，植物體中成分復(fù)雜，其中包括蛋白質(zhì)、果膠、淀粉等非需要成分，這些成分一方面影響植物細(xì)胞中活性成分的浸出，另一方面也影響液體制劑的澄清度，傳統(tǒng)的提取方法如煎煮，有機(jī)溶劑浸出和醇處理等方法存在著提取溫度過(guò)高，提取率低，成本高，不安全的缺點(diǎn)，而選用恰當(dāng)?shù)拿?，可通過(guò)酶反應(yīng)較溫和地將植物組織分解，加速紫杉烷類有效成分的釋放。按照權(quán)利要求l所述的通氧，其特征在于通氧過(guò)程發(fā)生在加入酶之后，使氧氣連續(xù)通入到酶轉(zhuǎn)化體系中，在充分接觸氧的環(huán)境中保持酶的最大活性，使兩者對(duì)體系中經(jīng)過(guò)鮮磨勻漿的紅豆杉組織團(tuán)塊發(fā)生協(xié)同作用，共同促使體系中其他紫杉烷類物質(zhì)向紫杉醇及其半合成前體物質(zhì)轉(zhuǎn)化。按照權(quán)利要求1所述的紫外照射，其特征在于紫外照射波長(zhǎng)有254nm和365nm兩種，將體系置于紫外線下進(jìn)行充分照射，時(shí)間為7-8小時(shí)。紫外照射的主要作用是可以調(diào)節(jié)代謝過(guò)程中的某些酶活性，并能對(duì)某些關(guān)鍵酶在轉(zhuǎn)錄水平上進(jìn)行調(diào)節(jié)，紫杉醇是二萜類化合物，與植物防衛(wèi)系統(tǒng)對(duì)抗昆蟲(chóng)和病原菌侵襲產(chǎn)生植保素的合成路徑有部分重疊，作為誘導(dǎo)子的紫外照射能夠通過(guò)刺激植物防衛(wèi)系統(tǒng)而促進(jìn)紫杉醇的代謝。所述的液液萃取，其特征在于除石油醚和三氯甲烷溶劑外還包括正己烷和二氯甲垸，萃取所用的溶劑量為體系的1/2，萃取次數(shù)為三次。石油醚或正己垸部分為雜質(zhì)，回收溶劑后殘?jiān)鼦壍?。三氯甲垸或二氯甲垸部分為目?biāo)物。所述的有機(jī)相濃干，乙醇溶解后，傾入水中，其特征在于要用盡可能少的乙醇將濃干物溶解，逐漸將其傾入到大量的水中，析出的固體經(jīng)過(guò)濾得到，水相用三氯甲烷或二氯甲烷萃取(1/2)三次，合并后濃縮至干得固形物。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)1.本發(fā)明以可再生的新鮮紅豆杉枝葉為原料，促使植物資源高效的利用。2.本發(fā)明采用誘導(dǎo)子對(duì)植物組織團(tuán)塊體系進(jìn)行高效誘導(dǎo)，可大大提高紫杉烷產(chǎn)品的得率。3.該方法簡(jiǎn)單易行，可實(shí)現(xiàn)大規(guī)模的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。具體實(shí)施方案本試驗(yàn)選用的是東北紅豆杉和南方紅豆杉的新鮮枝葉，所采枝葉高度為100cm，長(zhǎng)度為10cm，試驗(yàn)時(shí)間為7月，試驗(yàn)設(shè)有對(duì)照組和試驗(yàn)組。具體實(shí)施例如下實(shí)施例1對(duì)照組稱取20g東北紅豆杉新鮮枝葉，加lOOmL水勻漿后，不經(jīng)任何處理，直接過(guò)濾，濾渣加入100mL80。/。乙醇在超聲條件下萃取3次，每次30min,合并三次清夜，減壓濃縮至無(wú)明顯液體流出。將濃縮液依次用正己院、三氯甲烷分別萃取3次(萃取劑與濃縮液體積比為1:2)。將三氯甲垸相濃縮蒸干，所得固形物用lmL無(wú)水乙醇溶解后，加入到20mL水中，靜置片刻后，過(guò)濾得白色沉淀，干燥后稱量為0.026g。其中紫杉醇與三尖杉寧堿的含量分別為3.03%和5.25%。沉淀水相部分用三氯甲烷萃取3次(萃取劑與濃縮液體積比為1:2)，合并三次有機(jī)相，濃縮至干，得固形物0.025g，其中IO-去乙?；涂ㄍII與巴卡亭III含量分別為8.22%和1.23%。試驗(yàn)組稱取20g東北紅豆杉新鮮枝葉，力BlOOmL水勻漿后，加入0.1mg淀粉酶，連續(xù)通入氧氣8h，后置于254nm紫外線下照射8h，過(guò)濾，濾渣加入100mL80。/。乙醇在超聲條件下萃取3次，每次30min，合并三次清夜，減壓濃縮至無(wú)明顯液體流出。將濃縮液依次用正己烷、三氯甲烷分別萃取3次(萃取劑與濃縮液體積比為1:2)。將三氯甲烷相濃縮蒸干，所得固形物用lmL無(wú)水乙醇溶解后，加入到20mL水中，靜置片刻，過(guò)濾得白色沉淀，干燥后稱量為0.03g。其中紫杉醇與三尖杉寧堿的含量分別為3.23%和7.92%。沉淀水相部分用三氯甲烷萃取3次(萃取劑與濃縮液體積比為1:2)，合并三次有機(jī)相，濃縮至干，得固形物0.023g，其中10-去乙?；涂ㄍII與巴卡亭III含量分別為10.46%和1.56%。在實(shí)施例i中，試驗(yàn)組中的io-去乙酰基巴卡亭m、巴卡亭in、三尖杉寧堿及紫杉醇的含量相對(duì)對(duì)照組分別提高了17%,26%，74%，23%。實(shí)施例2對(duì)照組稱取20g南方紅豆杉新鮮枝葉，加入100mL水勻漿后，不經(jīng)任何處理，直接過(guò)濾，濾渣加入100mL80。/。乙醇在超聲條件下萃取3次，每次30min，合并三次清夜，減壓濃縮至無(wú)明顯液體流出。將濃縮液依次用正己烷、三氯甲烷分別萃取3次(萃取劑與濃縮液體積比為1:2)。將三氯甲烷相濃縮蒸干，所得固形物用lmL無(wú)水乙醇溶解后，加入到20mL水中，靜置片刻后，過(guò)濾得白色沉淀，干燥后稱量為0.053g。其中紫杉醇與三尖杉寧堿的含量分別為3.38%和0.72%。沉淀水相部分用三氯甲垸萃取3次(萃取劑與濃縮液體積比為1:2)，合并三次有機(jī)相，濃縮至干，得固形物0.02g，其中IO-去乙?；涂ㄍII與巴卡亭III含量分別為12.54%和1.65%。試驗(yàn)組稱敢20g南方紅豆杉新鮮枝葉，加入100mL水勻漿后，加入0.1mg纖維素酶，連續(xù)通入氧氣8h，后置于254nm紫外線下照射8h，過(guò)濾，濾渣加入100mL80。/。乙醇在超聲條件下萃取3次，每次30min，合并三次清夜，減壓濃縮至無(wú)明顯液體流出。將濃縮液依次用正己垸、三氯甲垸分別萃取3次(萃取劑與濃縮液體積比為1:2)。將三氯甲垸相濃縮蒸干，所得固形物用lmL無(wú)水乙醇溶解后，加入到20mL水中，靜置片刻后，過(guò)濾得白色沉淀，干燥后稱量為0.05g。其中紫杉醇與三尖杉寧堿的含量分別為4.448%和1.347%。沉淀水相部分用三氯甲垸萃取3次(萃取劑與濃縮液體積比為1:2)，合并三次有機(jī)相，濃縮至干，得固形物0.019g，其中10-去乙?；涂ㄍII與巴卡亭III含量分別為15.58%和2.13%。在實(shí)施例2中，試驗(yàn)組中的io-去乙?；涂ㄍi、巴卡亭ni、三尖杉寧堿及紫杉醇的含量相對(duì)對(duì)照組分別提高了18%，23%，76%，24%。本試驗(yàn)中所用到的標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自Sigma公司。結(jié)果定量檢測(cè)分析采用下表?xiàng)l件<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>圖1為紫杉醇的結(jié)構(gòu)式圖2為10-去乙?；涂ㄍII的結(jié)構(gòu)式圖3為巴卡亭III的結(jié)構(gòu)式圖4為三尖杉寧堿的結(jié)構(gòu)式。權(quán)利要求1.一種從紅豆杉新鮮枝葉中高效誘導(dǎo)提取10-去乙酰基巴卡亭III、巴卡亭III、三尖杉寧堿和紫杉醇的方法，其主要特征在于紅豆杉新鮮枝葉經(jīng)過(guò)鮮磨勻漿后，向體系中加入酶，通入氧氣，誘導(dǎo)培養(yǎng)后將體系置于紫外線下照射數(shù)小時(shí)，過(guò)濾后的固形物用80％乙醇超聲提取3次，提取液濃縮后依次經(jīng)石油醚、三氯甲烷萃取，有機(jī)相濃縮至干后，加少許乙醇溶解后，傾入到大量水中，析出白色沉淀，為三尖杉寧堿與紫杉醇的粗品。水相經(jīng)三氯甲烷萃取濃縮至干得10-去乙?；涂ㄍII與巴卡亭III的粗品。2.按照權(quán)利要求1所述的紅豆杉新鮮枝葉，其特征在于紅豆杉新鮮枝葉主要來(lái)源包括東北紅豆杉南方紅豆杉。3.按照權(quán)利要求1所述的鮮磨勻漿，其特征在于植物中的大部分生物活性成分存在于細(xì)胞壁內(nèi)，由于細(xì)胞壁的屏障作用，減慢了生物活性成分向提取溶劑中轉(zhuǎn)移的速率。采用純水鮮磨勻漿時(shí)，對(duì)植物枝葉的細(xì)胞壁起到破壁作用，加快了胞內(nèi)物質(zhì)向溶劑中的釋放。4.按照權(quán)利要求1所述的酶水解，其特征在于所用的酶包括淀粉酶和纖維素酶。在傳統(tǒng)溶劑提取方法的基礎(chǔ)上，利用酶反應(yīng)具有高度專一性的特性，根據(jù)植物藥材細(xì)胞壁的構(gòu)成成分，選擇相應(yīng)的酶，將細(xì)胞壁的成分水解或降解，破壞細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，使有效成分充分釋放出來(lái)，溶解、混懸或膠溶于溶劑中，同時(shí)可使細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)與纖維素、蛋白質(zhì)、果膠和糖類之間結(jié)合的氫鍵斷裂，使細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)由結(jié)合態(tài)向游離態(tài)轉(zhuǎn)化，從而達(dá)到了高效提取細(xì)胞內(nèi)有效成分的目的。5.按照權(quán)利要求1所述的通氧，其特征在于通氧過(guò)程發(fā)生在加入酶之后，使氧氣連續(xù)通入到酶轉(zhuǎn)化體系中，在充分接觸氧的環(huán)境中保持酶的最大活性，使兩者對(duì)體系中經(jīng)過(guò)勻漿鮮磨的紅豆杉組織團(tuán)塊發(fā)生協(xié)同作用，共同促使體系中其他紫杉垸類物質(zhì)向紫杉醇及其半合成前體物質(zhì)轉(zhuǎn)化。6.按照權(quán)利要求1所述的紫外照射，其特征在于紫外照射波長(zhǎng)有254nm和365nm兩種。將體系置于紫外線下進(jìn)行充分照射，時(shí)間為7-8小時(shí)。紫外照射的主要作用是可以調(diào)節(jié)代謝過(guò)程中的某些酶活性,并能對(duì)某些關(guān)鍵酶在轉(zhuǎn)錄水平上進(jìn)行調(diào)節(jié)，紫杉醇是二萜類化合物，與植物防衛(wèi)系統(tǒng)對(duì)抗昆蟲(chóng)和病原菌侵襲產(chǎn)生植保素的合成路徑有部分重疊，作為誘導(dǎo)子的紫外照射能夠通過(guò)剌激植物防衛(wèi)系統(tǒng)而促進(jìn)紫杉醇的代謝。7.按照權(quán)利要求1所述的液液萃取，其特征在于除石油醚和三氯甲垸溶劑外還包括正己垸和二氯甲垸，萃取所用的溶劑量為體系的1/2，萃取次數(shù)為三次。石油醚或正己烷部分為雜質(zhì)，回收溶劑后殘?jiān)鼦壍?。三氯甲垸或二氯甲烷部分為目?biāo)物。8.按照權(quán)利要求1所述的有機(jī)相濃縮至干，乙醇溶解后，傾入水中，其特征在于要用盡可能少的乙醇將濃縮物溶解，逐漸將其傾入到大量的水中，析出的固體經(jīng)過(guò)濾得到，水相用三氯甲烷或二氯甲垸萃取(1/2)三次，合并后濃縮至干得固形物。全文摘要本發(fā)明涉及一種通過(guò)鮮磨勻漿方法，利用酶、紫外照射、以及氧作為誘導(dǎo)子高效生產(chǎn)紅豆杉枝葉中10-去乙?；涂ㄍII、巴卡亭III、三尖杉寧堿及紫杉醇的方法。以紅豆杉新鮮枝葉為原料，進(jìn)行鮮磨勻漿后加入酶，通入氧氣，然后在紫外線下照射，固形物經(jīng)過(guò)80％乙醇超聲提取。通過(guò)以上生物誘導(dǎo)方法，可將紅豆杉枝葉中10-去乙?；涂ㄍII、巴卡亭III、三尖杉寧堿及紫杉醇的含量平均分別提高超過(guò)了17％，23％，74％，23％。本發(fā)明所用原料為可再生的紅豆杉新鮮枝葉，既做到了不破壞生態(tài)資源，又能高效提取得到紅豆杉有效成分及其生物半合成前體物質(zhì)。而且該方法操作簡(jiǎn)單易行，適于工業(yè)應(yīng)用，對(duì)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)具有重要意義。文檔編號(hào)C12P17/02GK101220384SQ20071014453公開(kāi)日2008年7月16日申請(qǐng)日期2007年11月1日優(yōu)先權(quán)日2007年11月1日發(fā)明者付玉杰,蕊孫,然張,張顏濱,李雙明,李慶勇,祖元?jiǎng)?浩駱申請(qǐng)人:東北林業(yè)大學(xué);付玉杰