專利名稱：野豬α-干擾素的基因合成和載體構(gòu)建及產(chǎn)物的生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種野豬a-干擾素的基因合成和載體構(gòu)建及產(chǎn)物的生產(chǎn)方法。
背景技術(shù)：
干擾素作為生物體內(nèi)的第一病毒防御系統(tǒng)， 一直是各種生物體內(nèi)重要的細(xì) 胞因子之一。利用干擾素來(lái)防治家畜的病毒性疾病，也是一種非常有效的手段。 野豬(X-干擾素是一種誘生蛋白，正常情況下動(dòng)物機(jī)體是不產(chǎn)生的。目前，國(guó)內(nèi) 主要是體外培養(yǎng)豬白細(xì)胞并誘導(dǎo)生產(chǎn)干擾素，然后從培養(yǎng)上清中提取干擾素。 這種方法生產(chǎn)的干擾素生物活性低，成本高，且豬血有各種病毒污染，也會(huì)給 產(chǎn)品的安全帶來(lái)問(wèn)題。通過(guò)基因工程技術(shù)，可以在體外大規(guī)模生產(chǎn)重組干擾素 蛋白。干擾素的非糖基化形式也具有生物活性，因而可以使用原核表達(dá)系統(tǒng)表 達(dá)該種蛋白。目前國(guó)內(nèi)雖已開展了相關(guān)的研究，但是，還是沒有一條完整的可 供生產(chǎn)的下游工藝，國(guó)內(nèi)重組菌株的或者是表達(dá)量不高，或者是產(chǎn)物是以融合 狀態(tài)表達(dá)，或者是產(chǎn)物帶有純化標(biāo)簽，或者是沒有高密度發(fā)酵工藝，存在諸多 問(wèn)題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種野豬a-干擾素基因的合成序列、表達(dá)載體構(gòu)建及 產(chǎn)物的制法，為在工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)野豬Ol-干擾素提供一條高效、安全、經(jīng)濟(jì)、 穩(wěn)定的生產(chǎn)工藝。
上述的目的通過(guò)以下的技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)
野豬a-干擾素的基因合成和載體構(gòu)建及產(chǎn)物的生產(chǎn)方法，其組成包括用 大腸桿菌偏愛密碼子以及密碼子對(duì)合成了野豬a -干擾素基因，構(gòu)建高效表達(dá)載 體并轉(zhuǎn)化高效表達(dá)菌株，工程菌高密度發(fā)酵、包涵體的分離純化、目的蛋白的 變性、復(fù)性和純化以及表達(dá)產(chǎn)物的生物活性測(cè)定方法，所述的人工合成的編碼 野豬a -干擾素的基因含有如下核苷酸序列ATG TGT GAT CTG CCG CAA ACC CAT AGC CTG GCG CAC ACC CGT GCG CTG CGT CTG CTG GCG CAG ATG CGT CGC ATC AGC CCG TTT AGC TGC CTG GAT CAC CGT CGC GAT TTT GGT TTC CCG CAG GM GCG CTG
GGC GGC AAC CAG GTG CAG AAA GCG CAA GCC ATG GCG CTG GTG CAT GAG ATG CTG CAG CAG ACC TTC CAG CTG TTC AGC ACC GAA GGC AGC GCG GCG GCC TGG GAT GAG AGC CTG CTG CAC CAG TTC TAT ACC GGT CTG GAT CAG CAG CTG CGC GAT CTG GM GCG TGC GTG ATG CAG GAG GCG GGC CTG GAA GGC ACC CCG CTG CTG GAG GAG GAT AGC ATT CTG GCG GTG CGT AAA TAT TTC CAT CGT CTG ACG CTG TAT CTG CM GM AAA AGC TAC AGC CCG TGT GCG TGG GAA ATT GTG CGT GCG GM GTG ATG CGC GCG TTC AGC AGC AGC ACC AAC CTG CAA GAT CGT CTG CGT, MA MA GM TAA，將含 有所述的核苷酸序列的野豬(x-干擾素的基因插入到帶有PL、 pR啟動(dòng)子、Cits 溫控阻遏蛋白基因的表達(dá)載體pWL中，構(gòu)建成野豬a-干擾素的基因的表達(dá)質(zhì)粒 pWL-poIFN-a，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH-5a后，野豬a-干擾素獲得高效表達(dá)。
所述的野豬a -干擾素的基因合成和載體構(gòu)建及產(chǎn)物的生產(chǎn)方法，對(duì)所述的 工程菌進(jìn)行30'C培養(yǎng)過(guò)夜，以10%接種量接種至發(fā)酵罐中，誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)機(jī)為0D6。。 達(dá)到4 10時(shí)，42。C誘導(dǎo)發(fā)酵培養(yǎng)2. 5 5. 5小時(shí)，包涵體粗提液為50毫摩tris、 1毫摩乙二胺四乙酸、0.1毫克/亳升溶菌酶、0. l 0.4%TritonX-100，包涵 體精提液為50毫摩tris、 l毫摩乙二胺四乙酸、0.5 2摩爾脲，蛋白變性液 為8 10摩爾脲、50亳摩tris、 l毫摩乙二胺四乙酸、10毫摩二硫蘇糖醇， 蛋白復(fù)性液為50毫摩tris、 1毫摩乙二胺四乙酸、5毫摩還原型谷胱甘肽、1 亳摩氧化型谷胱甘肽、10毫摩NaCl，分離純化采用S印hacry S-200和 DEAE-S印harose FF層析柱純化。
所述的野豬a -干擾素的基因合成和載體構(gòu)建及產(chǎn)物的生產(chǎn)方法，所述的核 苷酸序列的5'端ATG TGT GAT CTG CCG CAA ACC CAT AGC CTG GCG以及3'端 CTG CAA GAT CGT CTG CGT AAA MA GAA TAA為經(jīng)過(guò)自由能和mRNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)優(yōu) 化的序列。
所述的野豬a-干擾素的基因合成和載體構(gòu)建及產(chǎn)物的生產(chǎn)方法，所述的 高效表達(dá)載體是含有核苷酸序列的野豬a -干擾素的表達(dá)載體使用了質(zhì)粒載體 pWL，它含有pL、 pR啟動(dòng)子、Cits溫控阻遏蛋白基因，以及特定的SD序列和起 始密碼子ATG之間的序列為GAATTCAAA，以及野豬a-干擾素基因構(gòu)建的載體， 所述的核苷酸序列的5'端起始密碼子前面的核苷酸序列為GAATTCAAA。
所述的野豬a -干擾素的基因合成和載體構(gòu)建及產(chǎn)物的生產(chǎn)方法，所述的 野豬a-干擾素的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化為大腸桿菌DH-5a，表達(dá)蛋白占菌體總蛋白的 25% 33%。
所述的野豬a -干擾素的基因合成和載體構(gòu)建及產(chǎn)物的生產(chǎn)方法,生產(chǎn)的重 組野豬a-干擾素分子量為19kD ，且在體外有效保護(hù)Wish細(xì)胞和胎豬體細(xì)胞 免受水泡性口炎病毒的攻擊。
這個(gè)技術(shù)方案有以下有益效果
1. 本發(fā)明利用生物學(xué)軟件改變了野豬a-干擾素基因中稀有密碼子，使之變 成大腸桿菌的偏愛密碼子，并且優(yōu)化了 5'端起始密碼子區(qū)域和3'端終止密碼子 區(qū)域30個(gè)堿基的自由能和摩爾RNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)。5'端起始密碼子前面的核苷酸 序列為GAATTCAAA,含有￡",R I酶切位點(diǎn)；3'端的終止密碼子后加上了 I 酶切位點(diǎn)。該基因雖然改變了稀有密碼子，但是氨基酸序列并無(wú)改變，表達(dá)水 平有很大提高。
2. 本發(fā)明所生產(chǎn)的重組野豬a-干擾素，其分子量為19kD，且在體外有效 保護(hù)Wish細(xì)胞和胎豬體細(xì)胞免受水泡性口炎病毒的攻擊。
3. 本發(fā)明利用生物信息學(xué)，對(duì)野豬a-干擾素進(jìn)行了全基因組掃描。優(yōu)化設(shè) 計(jì)并合成了野豬a-干擾素基因，帶有該基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主大腸桿菌 DH-5a，獲得高效表達(dá)，表達(dá)蛋白占菌體總蛋白的25% 33%。本發(fā)明也提供了 一套完整的下游生產(chǎn)工藝，包括高密度發(fā)酵、包涵體的分離純化、目的蛋白的 變性、復(fù)性和純化以及表達(dá)產(chǎn)物的生物活性測(cè)定方法。是一條可大規(guī)模工業(yè)化 生產(chǎn)重組野豬a -干擾素的方法。
4. 本發(fā)明提供了一整套工程菌高密度發(fā)酵、包涵體分離和純化、蛋白復(fù)性 和純化工藝。野豬a-干擾素具有高效抗病毒和功能，可用于豬病毒性傳染病的 預(yù)防和治療。并且由于存在交叉活性，該干擾素可用于牛、羊等動(dòng)物的病毒性 疾病的治療。
5. 本發(fā)明能夠生產(chǎn)高活性、低成本的野豬a-干擾素，可以工業(yè)化大量生產(chǎn) 重組野豬a-干擾素。


附圖1是本發(fā)明實(shí)施例野豬a-干擾素的成熟肽的核苷酸序列與其氨基酸 序列比對(duì)圖。
附圖2是本發(fā)明實(shí)施例天然野豬a-干擾素的成熟肽的核苷酸序列及其氨 基酸序列比對(duì)圖。
附圖3是本發(fā)明實(shí)施例野豬a -干擾素的序列的測(cè)定圖譜。測(cè)定結(jié)果可見5' 端ATG之前引入了 EcoR I酶切位點(diǎn)，3'TAA之后引入了 Sal I酶切位點(diǎn)。
附圖4是本發(fā)明實(shí)施例野豬a-千擾素的酶切鑒定圖譜。
附圖5是本發(fā)明實(shí)施例優(yōu)化工程菌高密度發(fā)酵表達(dá)條件鑒定圖譜。1為標(biāo)準(zhǔn) 分子量蛋白、2為未誘導(dǎo)的菌體、3為高密度發(fā)酵誘導(dǎo)條件表達(dá)的菌體。
附圖6是本發(fā)明實(shí)施例工程菌表達(dá)野豬a-干擾素在大腸桿菌中存在形式 的鑒定圖譜。
附圖7是本發(fā)明實(shí)施例分離純化的重組野豬a -干擾素SDS-PAGE電泳檢定 圖譜。
附圖8是本發(fā)明實(shí)施例分離純化的重組野豬a -干擾素HPLC的檢測(cè)結(jié)果。
本發(fā)明的
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例l:
野豬a-干擾素的基因合成和載體構(gòu)建及產(chǎn)物的生產(chǎn)方法，其組成包括用 大腸桿菌偏愛密碼子以及密碼子對(duì)合成了野豬a -干擾素基因，構(gòu)建高效表達(dá)載 體并轉(zhuǎn)化高效表達(dá)菌株，工程菌高密度發(fā)酵、包涵體的分離純化、目的蛋白的 變性、復(fù)性和純化以及表達(dá)產(chǎn)物的生物活性測(cè)定方法，所述的人工合成的編碼 野豬a -干擾素的基因含有如下核苷酸序列ATG TGT GAT CTG CCG CAA ACC CAT AGC CTG GCG CAC ACC CGT GCG CTG CGT CTG CTG GCG CAG ATG CGT CGC ATC AGC CCG TTT AGC TGC CTG GAT CAC CGT CGC GAT TTT GGT TTC CCG CAG GAA GCG CTG GGC GGC AAC CAG GTG CAG AAA GCG CAA GCC ATG GCG CTG GTG CAT GAG ATG CTG CAG CAG ACC TTC CAG CTG TTC AGC ACC GAA GGC AGC GCG GCG GCC TGG GAT GAG AGC CTG CTG CAC CAG TTC TAT ACC GGT CTG GAT CAG CAG CTG CGC GAT CTG GAA GCG TGC GTG ATG CAG GAG GCG GGC CTG GAA GGC ACC CCG CTG CTG GAG GAG GAT AGC ATT CTG GCG GTG CGT AAA TAT TTC CAT CGT CTG ACG CTG TAT CTG CAA GAA
AAA AGC TAC AGC CCG TGT GCG TGG GAA ATT GTG CGT GCG GAA GTG ATG CGC GCG TTC AGC AGC AGC ACC AAC CTG CAA GAT CGT CTG CGT AAA AAA GAA TM，將含 有所述的核苷酸序列的野豬oi-干擾素的基因插入到帶有pL、 pR啟動(dòng)子、Cits 溫控阻遏蛋白基因的表達(dá)載體pWL中，構(gòu)建成野豬(x-干擾素的基因的表達(dá)質(zhì)粒 pWL-poIFN- a ，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH-5 a后，野豬a-干擾素獲得高效表達(dá)。
所述的野豬a -干擾素的基因合成和載體構(gòu)建及產(chǎn)物的生產(chǎn)方法，對(duì)所述的 工程菌進(jìn)行3(TC培養(yǎng)過(guò)夜，以10%接種量接種至發(fā)酵罐中，誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)機(jī)為0D600 達(dá)到4 10時(shí)，42°C誘導(dǎo)發(fā)酵培養(yǎng)2. 5 5. 5小時(shí)，包涵體粗提液為50亳摩tris、 1毫摩乙二胺四乙酸、0.1毫克/毫升溶菌酶、0. l 0.4%TritonX-100，包涵 體精提液為50毫摩tris、 l亳摩乙二胺四乙酸、0.5 2摩爾脲，蛋白變性液 為8 10摩爾脲、50毫摩tris、 l毫摩乙二胺四乙酸、10毫摩二硫蘇糖醇， 蛋白復(fù)性液為50毫摩tris、 l毫摩乙二胺四乙酸、5毫摩還原型谷胱甘肽、1 毫摩氧化型谷胱甘肽、10毫摩NaCl，分離純化采用S印hacryS-200和DEAE-FF 層析柱純化。
所述的野豬a -干擾素的基因合成和載體構(gòu)建及產(chǎn)物的生產(chǎn)方法，所述的核 苷酸序列的5'端ATG TGT GAT CTG CCG CAA ACC CAT AGC CTG GCG以及3'端 CTG CAA GAT CGT CTG CGT AAA AAA GAA TM為經(jīng)過(guò)自由能和mRNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)優(yōu) 化的序列。
所述的野豬a-干擾素的基因合成和載體構(gòu)建及產(chǎn)物的生產(chǎn)方法，所述的 高效表達(dá)載體是含有核苷酸序列的野豬a -干擾素的表達(dá)載體使用了質(zhì)粒載體 pWL，它含有pL、 pR啟動(dòng)子、Cits溫控阻遏蛋白基因，以及特定的SD序列和起 始密碼子ATG之間的序列為GAATTCAAA，以及野豬a -干擾素基因構(gòu)建的載體， 所述的核苷酸序列的5'端起始密碼子前面的核苷酸序列為GAATTCAAA。
所述的野豬a-干擾素的基因合成和載體構(gòu)建及產(chǎn)物的生產(chǎn)方法，所述的 野豬a-干擾素的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化為大腸桿菌DH-5a，表達(dá)蛋白占菌體總蛋白的 25% 33%。
所述的野豬a -干擾素的基因合成和載體構(gòu)建及產(chǎn)物的生產(chǎn)方法，生產(chǎn)的重 組野豬a-干擾素分子量為19kD ，且在體外有效保護(hù)Wish細(xì)胞和胎豬體細(xì)胞
免受水泡性口炎病毒的攻擊。
本發(fā)明中，利用生物學(xué)軟件改變了野豬a-干擾素基因中稀有密碼子，使之 變成大腸桿菌的偏愛密碼子，并且優(yōu)化了 5'端起始密碼子區(qū)域和3'端終止密碼 子區(qū)域內(nèi)30個(gè)堿基的自由能和mRNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)，使之適合轉(zhuǎn)錄的起始。該序 列的5'端起始密碼子前面的核苷酸序列為GAATTCAAA，含有五"RI酶切位點(diǎn)； 3'端的終止密碼子后加上了6WI酶切位點(diǎn)。克隆至載體pWL之中，得到表達(dá)質(zhì) 粒pWL-poIFN-a 。圖1和圖2分別顯示了野豬a -干擾素的成熟肽的核苷酸序 列與氨基酸序列比對(duì)圖和天然野豬a -干擾素的成熟肽的核苷酸序列及其氨基 酸序列比對(duì)圖。
參考附圖3，本發(fā)明實(shí)施例野豬a-干擾素的序列的測(cè)定圖譜。測(cè)定結(jié)果可 見5'端ATG之前引入了 EcoR I酶切位點(diǎn)，3TAA之后引入了 Sal I酶切位點(diǎn)。 參考附圖4，本發(fā)明實(shí)施例將表達(dá)質(zhì)粒pWL-poIFN-a轉(zhuǎn)化大腸桿菌。采用
氯化釣轉(zhuǎn)化法，宿主菌為大腸桿菌DH-5ci。重組菌種的篩選隨機(jī)挑取8-10 個(gè)單菌落分別接種于含10(Hig/ml氨芐青霉素鈉的5m LB液體培養(yǎng)基之中，30 。C 220 r/min過(guò)夜培養(yǎng)。次日，收集菌體，微量堿變性方法提取質(zhì)粒，質(zhì)粒經(jīng) 過(guò)酶切鑒定片斷大小與設(shè)計(jì)結(jié)果一致。其中l(wèi)為單酶切，2為EcoRl和Sal1 雙酶切，3為標(biāo)準(zhǔn)分子量
參考附圖5，本發(fā)明實(shí)施例將野豬a -干擾素工程菌接種于含100jig/ml氨 芐青霉素鈉的液體LB培養(yǎng)基之中，30°C 220 r/min培養(yǎng)15 h，至00600約1.5， 次日按10%的接種量接種發(fā)酵罐中，發(fā)酵罐內(nèi)含有4 L已滅菌的分批培養(yǎng)的基 礎(chǔ)培養(yǎng)基(蛋白胨10 g，丙三醇20ml，酵母粉5 g， Na2HP04 '12H;jO 8g， KH2P04 4g， MgS047H20 0.25 g， CaCl2 0.1 g，微量元素(微量元素儲(chǔ)備液FeS04.7 H20 lg， MnS04.H20 1g， ZnS047H20 2.78 g， CoCl2.6H20 2g， Na2Mo04 2 H20 2 g， CuS045H20 1.85 g， H3B03 0. 5 g，定容至lL)4ml〕、 2ml消泡劑和4g 氨芐青霉素。初始發(fā)酵參數(shù)設(shè)置溫度30'C , pH值7.2， DO值(溶氧濃度)100 %;起始攪拌速度230 r/min 。當(dāng)DO值在3 min之內(nèi)下降至60%以下，則開 始進(jìn)行補(bǔ)料發(fā)酵，流加補(bǔ)料培養(yǎng)基(蛋白胨8 g，丙三醇3ml，酵母粉8 g， MgS04 7H20 0.25 g，定容至1 L)。當(dāng)0D,達(dá)到4 5時(shí)，在5 min內(nèi)將發(fā)酵
罐升溫至42-C，進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。誘導(dǎo)表達(dá)5小時(shí)的時(shí)候終止發(fā)酵。圖5中，1:
標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白2:未誘導(dǎo)的菌體3:本實(shí)施例高密度發(fā)酵誘導(dǎo)條件表達(dá)的菌體。
參考附圖6，本發(fā)明實(shí)施例用離心法收集發(fā)酵的菌體，經(jīng)生理鹽水洗滌后超 聲波破碎菌體，離心后上清和沉淀作SDS-PAGE電泳鑒定。未誘導(dǎo)的菌作為空白 對(duì)照。結(jié)果表明表達(dá)野豬a-干擾素以包涵體的形式存在。
本發(fā)明實(shí)施例重組野豬a-干擾素的提取和變性離心收集發(fā)酵菌體，將細(xì) 菌溶于以下溶液TE(50mM tris、 1 mM EDTA)、 O.lmg /ml溶菌酶、0.1 0.4%TritonX-100，室溫?cái)嚢柽^(guò)夜。次日，在冰浴中進(jìn)行超聲破碎。離心棄上清。 沉淀用TE+0.5M的尿素?cái)嚢枨逑?。離心棄上清。沉淀TE清洗，離心棄上清。 最后沉淀用Tris清洗，離心。得到初步純化的包涵體，加入蛋白變性液(8 10 M脲、50mM tris、 1 mM EDTA、 10 mM DTT)，攪拌過(guò)夜后，12000r/min，離心， 20min，取上清，棄沉淀。圖6中，1:標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白，2:包涵體。
參考附圖7，本發(fā)明實(shí)施例重組野豬a-干擾素的復(fù)性和純化以含6M尿 素和lOmM DT T的TE溶液作為流動(dòng)相經(jīng)過(guò)Sephacryl S-200凝膠層析，收集 第二個(gè)出樣峰。將Sephacryl S-200凝膠層析收集的第二個(gè)樣品峰，緩緩稀釋到 4。C預(yù)冷的復(fù)性液之中。復(fù)性液中含有1mM GSSG，IO mM DTT以及TE(pH8.5) 緩沖液，并補(bǔ)充尿素使其終濃度為0.5M。4"C，過(guò)夜。復(fù)性的樣品上樣至DEAE-FF 柱上，用150 mM NaCl2的50 mM tris緩沖液洗下樣品峰。SDS—PAGE電泳 鑒定純化的重組野豬ot-干擾素(參考附圖7)其純度大于95%。圖7中，1為 標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白，2為純化蛋白還原電泳，3為純化蛋白的非還原電泳。
本發(fā)明實(shí)施例重組野豬a-干擾素的活性檢定用微量細(xì)胞病變抑制法，以 Wish細(xì)胞/VSV為基本檢測(cè)系統(tǒng)。將抑制50%細(xì)胞病變(CPE)的干擾素的 最高稀釋度定義為1個(gè)干擾素單位(U)。活性檢測(cè)結(jié)果表明，野豬d干擾素的 生物學(xué)活性為4.45xl06UI/mg。
參考附圖8， HPLC檢測(cè)重組野豬ci-干擾素純化蛋白的結(jié)果，純度在98% 以上。
權(quán)利要求
1. 一種野豬α-干擾素的基因合成和載體構(gòu)建及產(chǎn)物的生產(chǎn)方法，其組成包括用大腸桿菌偏愛密碼子以及密碼子對(duì)合成了野豬α-干擾素基因，構(gòu)建高效表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化高效表達(dá)菌株，工程菌高密度發(fā)酵、包涵體的分離純化、目的蛋白的變性、復(fù)性和純化以及表達(dá)產(chǎn)物的生物活性測(cè)定方法，其特征是所述的人工合成的編碼野豬α-干擾素的基因含有如下核苷酸序列ATG TGT GATCTG CCG CAA ACC CAT AGC CTG GCG CAC ACC CGT GCG CTG CGT CTG CTG GCG CAGATG CGT CGC ATC AGC CCG TTT AGC TGC CTG GAT CAC CGT CGC GAT TTT GGT TTCCCG CAG GAA GCG CTG GGC GGC AAC CAG GTG CAG AAA GCG CAA GCC ATG GCG CTGGTG CAT GAG ATG CTG CAG CAG ACC TTC CAG CTG TTC AGC ACC GAA GGC AGC GCGGCG GCC TGG GAT GAG AGC CTG CTG CAC CAG TTC TAT ACC GGT CTG GAT CAG CAGCTG CGC GAT CTG GAA GCG TGC GTG ATG CAG GAG GCG GGC CTG GAA GGC ACC CCGCTG CTG GAG GAG GAT AGC ATT CTG GCG GTG CGT AAA TAT TTC CAT CGT CTG ACGCTG TAT CTG CAA GAA AAA AGC TAC AGC CCG TGT GCG TGG GAA ATT GTG CGT GCGGAA GTG ATG CGC GCG TTC AGC AGC AGC ACC AAC CTG CAA GAT CGT CTG CGT AAAAAA GAA TAA，將含有所述的核苷酸序列的野豬α-干擾素的基因插入到帶有pL、pR啟動(dòng)子、Cits溫控阻遏蛋白基因的表達(dá)載體pWL中，構(gòu)建成野豬α-干擾素的基因的表達(dá)質(zhì)粒pWL-poIFN-α，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH-5α后，野豬α-干擾素獲得高效表達(dá)。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的野豬a-干擾素的基因合成和載體構(gòu)建及產(chǎn)物的 生產(chǎn)方法，其特征是對(duì)所述的工程菌進(jìn)行3(TC培養(yǎng)過(guò)夜，以10%接種量接種 至發(fā)酵罐中，誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)機(jī)為0De。。達(dá)到4 10時(shí)，42"C誘導(dǎo)發(fā)酵培養(yǎng)2.5 5.5 小時(shí)，包涵體粗提液為50毫摩tris、 1毫摩乙二胺四乙酸、0. 1毫克/毫升溶 菌酶、0. 1 0. 4%TritonX-100,包涵體精提液為50毫摩tris、 1毫摩乙二胺 四乙酸、0. 5 2摩爾脲，蛋白變性液為8 10摩爾脲、50毫摩tris、 1毫摩 乙二胺四乙酸、10毫摩二硫蘇糖醇，蛋白復(fù)性液為50毫摩tris、 l毫摩乙二 胺四乙酸、5毫摩還原型谷胱甘肽、l毫摩氧化型谷胱甘肽、10毫摩NaCl，分 離純化采用S印hacry S-200和DEAE-S印harose FF層析柱純化。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的野豬a -干擾素的基因合成和載體構(gòu)建及產(chǎn) 物的生產(chǎn)方法，其特征是所述的核苷酸序列的5'端ATG TGT GAT CTG CCG CM ACC CAT AGC CTG GCG以及3'端CTG CAA GAT CGT CTG CGT MA AAA GM TM 為經(jīng)過(guò)自由能和mRNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)優(yōu)化的序列。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的野豬ci-干擾素的基因合成和載體構(gòu)建及產(chǎn) 物的生產(chǎn)方法，其特征是所述的髙效表達(dá)載體是含有核苷酸序列的野豬a-干擾素的表達(dá)載體使用了質(zhì)粒載體pWL，它含有pL、 pR啟動(dòng)子、Cits溫控阻遏 蛋白基因，以及特定的SD序列和起始密碼子ATG之間的序列為GAATTCAAA，以 及野豬a-干擾素基因構(gòu)建的載體，所述的核苷酸序列的5'端起始密碼子前面 的核苷酸序列為GAATTCAAA。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的野豬a -干擾素的基因合成和載體構(gòu)建及產(chǎn) 物的生產(chǎn)方法，其特征是所述的野豬a -干擾素的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化為大腸桿菌 DH-5a，表達(dá)蛋白占菌體總蛋白的25% 33%。
6.根據(jù)權(quán)利要求l或2所述的野豬a -干擾素的基因合成和載體構(gòu)建及產(chǎn)物 的生產(chǎn)方法，其特征是生產(chǎn)的重組野豬a-干擾素分子量為19kD，且在體外 有效保護(hù)Wish細(xì)胞和胎豬體細(xì)胞免受水泡性口炎病毒的攻擊。
全文摘要
野豬α-干擾素的基因合成和載體構(gòu)建及產(chǎn)物的生產(chǎn)方法，國(guó)內(nèi)重組菌株或者是表達(dá)量不高，或者是產(chǎn)物是以融合狀態(tài)表達(dá)，或者是產(chǎn)物帶有純化標(biāo)簽，或者是沒有高密度發(fā)酵工藝，存在諸多問(wèn)題。本發(fā)明組成包括用大腸桿菌偏愛密碼子以及密碼子對(duì)合成了野豬α-干擾素基因，構(gòu)建高效表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化高效表達(dá)菌株，工程菌高密度發(fā)酵、包涵體的分離純化、目的蛋白的變性、復(fù)性和純化以及表達(dá)產(chǎn)物的生物活性測(cè)定方法。本發(fā)明屬于生物制藥中的基因工程生產(chǎn)多肽藥物技術(shù)領(lǐng)域。
文檔編號(hào)C12N15/21GK101392256SQ20071014434
公開日2009年3月25日 申請(qǐng)日期2007年9月21日 優(yōu)先權(quán)日2007年9月21日
發(fā)明者娣 劉, 李文輝, 王君偉 申請(qǐng)人:黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究中心;東北農(nóng)業(yè)大學(xué)