專利名稱：新霉素的清潔發(fā)酵工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，更具體涉及一種新霉素的清潔發(fā)酵工藝。
技術(shù)背景近年來(lái)，新霉素被作為一種飼料添加劑廣泛應(yīng)用。由于國(guó)內(nèi)外飼料添加劑的使用量大，應(yīng) 用范圍廣，所以展示了很好的前景。近幾年國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)對(duì)新霉素的需求有大幅度增長(zhǎng)的趨勢(shì)。 開(kāi)發(fā)新霉素，提高生產(chǎn)水平，具有廣闊的市場(chǎng)前景和顯著的經(jīng)濟(jì)效益。目前，國(guó)內(nèi)企業(yè)生產(chǎn)新霉素的發(fā)酵水平(120小時(shí)周期)約8000單位/mL，提取率約70%;國(guó)外新霉素的發(fā)酵水 平(120小時(shí)周期)可達(dá)11000單位/mL，提取率達(dá)85%左右。這表明，國(guó)內(nèi)新霉素的生產(chǎn)與 國(guó)際水平還具一定的距離。同時(shí)由于國(guó)內(nèi)外新霉素發(fā)酵主要追求發(fā)酵水平的提高，而不考慮 發(fā)酵過(guò)程糖類物質(zhì)的單耗和放罐時(shí)殘?zhí)菨舛鹊目刂?，從而造成了新霉素發(fā)酵過(guò)程帶來(lái)的污染 物排放的居高不下，其中放罐殘?zhí)菨舛扔袝r(shí)可達(dá)到3%-3.5%以上。這類生產(chǎn)工藝的是一個(gè)粗 放的、基質(zhì)濃度大幅度變化的工藝，導(dǎo)致發(fā)酵過(guò)程營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不能實(shí)施按需供給，擾亂了微生 物的正常代謝，造成了生產(chǎn)效率的低下(產(chǎn)物新霉素濃度低)和原材料的浪費(fèi)(初始配方和 補(bǔ)料液組成不合理，補(bǔ)料過(guò)多，放罐殘?zhí)菨舛冗^(guò)高)。這不僅增加了生產(chǎn)成本，降低了產(chǎn)率， 而且造成了排放物對(duì)環(huán)境的污染。傳統(tǒng)工藝中，整個(gè)新霉素發(fā)酵過(guò)程pH波動(dòng)較大，總糖濃度偏高，放罐殘?zhí)菨舛葹?2.5~3.0%，有時(shí)達(dá)到3.0%以上。高濃度的總糖和間歇補(bǔ)料的沖擊造成了菌體生長(zhǎng)的不正常， 同時(shí)由于氨氮濃度的粗放控制，影響了產(chǎn)物的生成，產(chǎn)抗期的產(chǎn)物濃度增長(zhǎng)速率較低，最終 產(chǎn)物濃度低。同時(shí)由于對(duì)總糖、還原糖濃度和氨氮濃度的粗放控制以及間歇補(bǔ)料導(dǎo)致菌體生長(zhǎng)受 到?jīng)_擊，其外在表現(xiàn)為菌體的比生長(zhǎng)速率無(wú)序變化，造成了新霉素產(chǎn)生菌的生長(zhǎng)和代謝 的紊亂，使新霉素的比生成速率在代謝的最關(guān)鍵時(shí)期(30~105h)僅為1.0g'g+h"左右。傳統(tǒng)工藝十分強(qiáng)調(diào)大量補(bǔ)糖的必要性。盲目的大量補(bǔ)加淀粉水解糖液，導(dǎo)致在產(chǎn)物 合成期，仍存在多次菌體大量增殖的過(guò)程，降低了產(chǎn)物合成速率。同時(shí)，由于微生物不 能利用多糖，生物反應(yīng)器中累積了大量微生物不可利用的多糖，該部分多糖隨廢水排放， 造成環(huán)境的污染和資源的浪費(fèi)。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種新霉素的清潔發(fā)酵工藝，該工藝科學(xué)合理，不僅能夠提高發(fā)酵 產(chǎn)物的濃度，同時(shí)還能降低放罐殘?zhí)菨舛?，?shí)現(xiàn)可使單位新霉素產(chǎn)量的淀粉單耗顯著下降， 同時(shí)排放COD污染量減少近50%，達(dá)到了清潔生產(chǎn)的目的。本發(fā)明的新霉素的清潔發(fā)酵工藝，其特征在于所述新霉素的清潔發(fā)酵工藝為以弗氏 鏈霉菌為生產(chǎn)菌株，在傳統(tǒng)的微生物發(fā)酵生產(chǎn)新霉素的工藝基礎(chǔ)上，對(duì)補(bǔ)糖液組成、補(bǔ)料速 率控制以及發(fā)酵過(guò)程對(duì)其它參數(shù)的修正改進(jìn)。 本發(fā)明的顯著特點(diǎn)如下(1) 對(duì)于大多數(shù)工業(yè)微生物發(fā)酵過(guò)程，淀粉等多糖類底物是菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)物合成 的最主要碳源。發(fā)酵培養(yǎng)基中的淀粉經(jīng)過(guò)加熱糊化和a—淀粉水解酶的水解 處理，轉(zhuǎn)變?yōu)橐缘途厶菫橹鞯奶穷惖孜锘旌衔铩Ｔ谛旅顾氐陌l(fā)酵過(guò)程中，由于微生物分泌的胞外淀粉酶的水解作用，淀粉經(jīng)過(guò)加熱糊化和a —淀粉水解酶的水解處理形成的低聚糖有可能進(jìn)一步降解為單糖和二糖為微生物所利 用。(2) 本發(fā)明的新霉素發(fā)酵新工藝，可用高DE值淀粉糖化液或采用葡萄糖作為補(bǔ) 料介質(zhì)，在發(fā)酵過(guò)程中根據(jù)菌體對(duì)可發(fā)酵性糖的需求進(jìn)行連續(xù)補(bǔ)料。應(yīng)用該 方案后， 一方面使發(fā)酵過(guò)程糖的利用率得以提高，另一方面還使殘?zhí)菨舛却?大降低。(3) 從新霉素發(fā)酵過(guò)程碳源、氮源的累積消耗來(lái)看，除發(fā)酵初期較短的一段時(shí)間 夕卜，整個(gè)發(fā)酵過(guò)程碳源的消耗基本上呈線性增長(zhǎng)，即使在發(fā)酵后期，碳源的 消耗仍然維持在比較高的水平。這與新工藝中使用葡萄糖作為補(bǔ)料介質(zhì)從而 能夠維持比較勻速的碳源消耗也是有關(guān)的。而氮源的消耗在發(fā)酵前80小時(shí) 維持在相對(duì)比較恒定的速率，在此之后快速下降，但在這一階段的消耗速率 的下降先于產(chǎn)物合成速率的下降。(4) 根據(jù)以上對(duì)新霉素發(fā)酵過(guò)程特性、淀粉酶活力變化規(guī)律分析以及發(fā)酵動(dòng)力學(xué)的 研究結(jié)果，建立了新霉素發(fā)酵新工藝，并對(duì)發(fā)酵過(guò)程進(jìn)行了優(yōu)化控制。新工藝 實(shí)施后新霉素發(fā)酵過(guò)程取得了明顯效果。(5) 本發(fā)明建立了補(bǔ)糖、補(bǔ)氮、補(bǔ)水、pH程序機(jī)制的控制系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)了新霉素發(fā)酵 過(guò)程的連續(xù)補(bǔ)料操作，使生物反應(yīng)器中的可發(fā)酵性糖濃度控制在預(yù)定的最佳的
濃度范圍，保證了微生物新霉素合成速率保持在較優(yōu)的水平。發(fā)酵120h，放罐 效價(jià)從原有的8000unnr1提高到llOOOuTnl"以上。(6) 本發(fā)明抓住發(fā)酵穩(wěn)定期發(fā)酵液中淀粉酶活力極低，而補(bǔ)糖液DE值過(guò)低，微生物 無(wú)法利用的矛盾，改用高DE值糖液進(jìn)行補(bǔ)料，提高了微生物對(duì)糖利用效率，大 幅度降低了發(fā)酵液殘?zhí)菨舛?，使之從原有?.5~3.0%下降為1.3 1.5%。發(fā)酵液 殘?zhí)窍陆捣冗_(dá)到了預(yù)定指標(biāo)。該指標(biāo)的實(shí)現(xiàn)可使單位新霉素產(chǎn)量的淀粉單耗 顯著下降，同時(shí)排放COD污染量減少近50。/。，達(dá)到了清潔生產(chǎn)的目的。


圖1是以還原糖表征的酶活力的變化示意圖。其中，縱坐標(biāo)表示的是酶活力 (Enzymatic Activity),單位是g. L人h"，橫坐標(biāo)表示時(shí)間(Time),單位是小時(shí)(h)。
具體實(shí)施方式
對(duì)補(bǔ)糖液組成的改進(jìn)為將原來(lái)的補(bǔ)充低DE值淀粉水解液改進(jìn)為用高DE值淀粉糖 化液或采用葡萄糖作為補(bǔ)料介質(zhì)。補(bǔ)料速率控制為對(duì)發(fā)酵過(guò)程的溫度、pH、溶氧濃度、總糖、還原糖濃度、氨氮濃度參 數(shù)進(jìn)行全程監(jiān)控，16h起之后每隔8h取樣測(cè)定以上各參數(shù)，考慮蒸發(fā)導(dǎo)致的發(fā)酵液損失，在 30h以后以流加形式持續(xù)補(bǔ)水，補(bǔ)加速率以抵消蒸發(fā)體積為準(zhǔn)，整個(gè)發(fā)酵周期為120h左右。所述發(fā)酵過(guò)程對(duì)其它參數(shù)的修正改進(jìn)為(1) 溫度發(fā)酵溫度0 105h為36±0.5°C， 105~115h為36~38°C ， 115h至放罐為38。C的 溫度程序控制；(2) pH:發(fā)酵過(guò)程0~80h將pH控制在6.8 6.9之間。80 105h將pH控制在7.0以內(nèi)， 105~120h將pH控制在6.8~7.0;(3) 溶氧濃度在對(duì)數(shù)期逐漸加大通氣量和提高攪拌轉(zhuǎn)速直至設(shè)備滿負(fù)載運(yùn)行；(4) 總糖、還原糖濃度因此發(fā)酵過(guò)程對(duì)總糖不進(jìn)行控制，僅控制最終的放罐殘?zhí)橇浚贿€原糖的控制策略為80h以前為1.5~2.2%之間；80~105h為0.8~1.5%; 105h以后不補(bǔ)加糖，從而降低120h時(shí)的放罐殘?zhí)橇浚?5) 氨氮濃度將氨氮的控制范圍定為130 140mg'100m1—1。新霉素的清潔發(fā)酵工藝的發(fā)酵罐為5~10噸罐。
發(fā)酵液中微生物可利用糖(單糖和二糖)的濃度主要取決于發(fā)酵培養(yǎng)基得淀粉水解 酶預(yù)處理程度，以及發(fā)酵過(guò)程中微生物分泌的胞外淀粉酶表觀活性以及菌體對(duì)可發(fā)酵性 糖的消耗速率。用還原糖滴定法測(cè)酶活力的結(jié)果如圖1所示?？梢钥闯?，在0 5h，酶 活力較低，為0.05g'L"'h"以下，此時(shí)菌體生長(zhǎng)處于遲滯期；在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，5 30h，酶 活力迅速?gòu)?.05 g丄"七"增加到0.32 g丄"七人30h后菌體生長(zhǎng)穩(wěn)定，維持在最大菌體濃 度，酶活力也趨于穩(wěn)定，維持在0.11g'L"'h"左右。到90h后，菌體開(kāi)始出現(xiàn)部分自溶， 菌體濃度下降，酶活力降低，到106h時(shí)，酶活力只有0.06 g'L+h-1,以后持續(xù)下降。縱 觀整個(gè)發(fā)酵過(guò)程的酶活力變化，在菌體生長(zhǎng)過(guò)程中，酶活力隨菌體濃度的增大而增大， 在產(chǎn)物合成階段，酶活力穩(wěn)定在0.11g丄"七"左右，轉(zhuǎn)化總糖為還原糖的能力較為穩(wěn)定。根據(jù)發(fā)酵過(guò)程酶活力的測(cè)定結(jié)果，可以明顯看出(1)相對(duì)于新霉素合成過(guò)程中糖 的消耗速率(1.0-1.5 g丄"'h—1)，整個(gè)新霉素發(fā)酵過(guò)程的胞外淀粉酶的活力是很低的，最 高僅達(dá)到0.32 g丄—、h—1，不足于完成對(duì)以淀粉為補(bǔ)料介質(zhì)的水解工作；(2)新霉素產(chǎn)生菌 的胞外水解酶活力極低，難以將補(bǔ)料液中非可發(fā)酵性糖的其它淀粉質(zhì)充分降解為微生物 可利用的單糖和二糖，這導(dǎo)致新霉素傳統(tǒng)發(fā)酵工藝中非還原糖的大量積累，使放罐殘?zhí)?過(guò)高。所以在新霉素發(fā)酵新工藝中，可用高DE值淀粉糖化液或采用葡萄糖作為補(bǔ)料介 質(zhì)，在發(fā)酵過(guò)程中根據(jù)菌體對(duì)可發(fā)酵性糖的需求進(jìn)行連續(xù)補(bǔ)料。應(yīng)用該方案后， 一方面 使發(fā)酵過(guò)程糖的利用率得以提高，另一方面還使殘?zhí)菨舛却蟠蠼档?。針?duì)新霉素傳統(tǒng)生產(chǎn)工藝低產(chǎn)、高成本、高污染物排放的缺陷，確定了新霉素新型生產(chǎn) 工藝，并進(jìn)行了小試實(shí)驗(yàn)。新工藝包括對(duì)培養(yǎng)基配方的調(diào)整、補(bǔ)糖策略和補(bǔ)硫酸銨策略的優(yōu) 化，以及發(fā)酵過(guò)程其它參數(shù)的修正。測(cè)定了發(fā)酵全過(guò)程的發(fā)酵液中胞外淀粉酶活力，定性并定量地分析了新霉素發(fā)酵過(guò)程中 可發(fā)酵性糖生成的速率。找出原有工藝中大量補(bǔ)加低DE值淀粉水解液的失誤的根源，為新 霉素發(fā)酵新工藝的建立提供了優(yōu)化的依據(jù)。本發(fā)明參照下面的實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明，但不限于此。 實(shí)施例在60000 L發(fā)酵罐中新霉素發(fā)酵過(guò)程的新工藝的應(yīng)用對(duì)發(fā)酵過(guò)程的溫度、pH、溶氧等參數(shù)進(jìn)行全程監(jiān)控。16h起之后每隔8h取樣測(cè)定以上各 參數(shù)?？紤]蒸發(fā)導(dǎo)致的發(fā)酵液損失，在30h以后以流加形式持續(xù)補(bǔ)水，補(bǔ)加速率以抵消蒸發(fā) 體積為準(zhǔn)。整個(gè)發(fā)酵周期為120h左右。新工藝對(duì)補(bǔ)糖液組成、補(bǔ)料速率控制、pH程序控制 等工藝條件進(jìn)行了改進(jìn)。建立了以補(bǔ)糖控制、補(bǔ)硫酸銨控制和pH控制系統(tǒng)。確定了較為完 善的控制模式。以60000 L發(fā)酵罐的新霉素發(fā)酵為根據(jù)，對(duì)新霉素發(fā)酵過(guò)程各參數(shù)進(jìn)行控制，以及對(duì)新霉素發(fā)酵工藝進(jìn)行最終確定如下1、 溫度發(fā)酵溫度0~105h為36土0.5。C， 105 115h為36~38°C， 115h至放罐為38。C的溫度程序控制。2、 pH根據(jù)新霉素小試發(fā)酵的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，當(dāng)pH較低菌體的呼吸強(qiáng)度受抑制，對(duì)數(shù)期最為明顯， 當(dāng)pH低于6.5時(shí)溶氧濃度迅速上升;pH高于7.5時(shí)新霉素生成速率下降。因此發(fā)酵過(guò)程0 80h 將pH控制在6.8~6.9之間。80~105h將pH控制在7.0以內(nèi)，105~120h將pH控制在6.8-7.0。3、 溶氧濃度對(duì)新霉素發(fā)酵，該菌株是強(qiáng)需氧型的放線菌，細(xì)胞的生長(zhǎng)、維持和抗生素生物合成等 代謝活動(dòng)均需要氧的參與。在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期和產(chǎn)物合成期，即使在現(xiàn)有設(shè)備滿負(fù)載運(yùn)行條件 下(通氣速率達(dá)l.OVVM，攪拌轉(zhuǎn)速150rmin")，溶氧濃度仍處于一個(gè)較低的水平。因 此，對(duì)60000L發(fā)酵罐，采用的策略為在對(duì)數(shù)期逐漸加大通氣量和提高攪拌轉(zhuǎn)速直至設(shè)備 滿負(fù)載運(yùn)行。4、 總糖、還原糖濃度根據(jù)新霉素發(fā)酵結(jié)果，還原糖濃度在0.8~3.0%范圍內(nèi)不會(huì)明顯影響新霉素的生成， 而當(dāng)還原糖濃度低于0.4%時(shí)新霉素的生成停止。總糖在延滯期消耗緩慢，在對(duì)數(shù)期和產(chǎn) 物合成期總糖以較為恒定的速率消耗，因此發(fā)酵過(guò)程對(duì)總糖不進(jìn)行控制，僅控制最終的 放罐殘?zhí)橇?；還原糖的控制策略為80h以前為1.5~2.2%之間；80~105h為0.8~1.5%; 105h以后不補(bǔ)加糖，從而降低120h時(shí)的放罐殘?zhí)橇俊?、 氨氮濃度根據(jù)新霉素發(fā)酵結(jié)果，氨氮濃度在100 160mg'100ml"范圍內(nèi)對(duì)新霉素的合成無(wú)明顯 的影響，氨氮濃度低于10mg時(shí)會(huì)出現(xiàn)停止合成新霉素。考慮到氨氮的消耗速率較快， 將氨氮的控制范圍定為130-140 mg，100mr1。實(shí)施新工藝后，菌體的生長(zhǎng)期和產(chǎn)物的合成期可以嚴(yán)格分開(kāi)，在30h前菌體高速生 長(zhǎng)后菌體濃度維持在比較穩(wěn)定的水平，同時(shí)從30h開(kāi)始，產(chǎn)物的合成一直維持在一個(gè)比 較高的速率(2.25g'g"'h")，大大高于原有工藝的l.Og'g"'h人從新霉素發(fā)酵過(guò)程碳源、氮源的累積消耗來(lái)看，除發(fā)酵初期較短的一段時(shí)間外，整 個(gè)發(fā)酵過(guò)程碳源的消耗基本上呈線性增長(zhǎng)，即使在發(fā)酵后期，碳源的消耗仍然維持在比 較高的水平。這與新工藝中使用葡萄糖作為補(bǔ)料介質(zhì)從而能夠維持比較勻速的碳源消耗 也是有關(guān)的。而氮源的消耗在發(fā)酵前80小時(shí)維持在相對(duì)比較恒定的速率，在此之后快速 下降，但在這一階段的消耗速率的下降先于產(chǎn)物合成速率的下降。根據(jù)以上對(duì)新霉素發(fā)酵過(guò)程特性、淀粉酶活力變化規(guī)律分析以及發(fā)酵動(dòng)力學(xué)的研究結(jié)果， 建立了新霉素發(fā)酵新工藝，并對(duì)發(fā)酵過(guò)程進(jìn)行了優(yōu)化控制。新工藝實(shí)施后新霉素發(fā)酵過(guò)程取 得了明顯效果。
權(quán)利要求
1.一種新霉素的清潔發(fā)酵工藝，其特征在于所述新霉素的清潔發(fā)酵工藝為以弗氏鏈霉菌為生產(chǎn)菌株，在傳統(tǒng)的微生物發(fā)酵生產(chǎn)新霉素的工藝基礎(chǔ)上，對(duì)補(bǔ)糖液組成、補(bǔ)料速率控制以及發(fā)酵過(guò)程對(duì)其它參數(shù)的修正改進(jìn)。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的新霉素的清潔發(fā)酵工藝，其特征在于所述對(duì)補(bǔ)糖液組成的改進(jìn) 為將原來(lái)的補(bǔ)充低DE值淀粉水解液改進(jìn)為用高DE值淀粉糖化液或采用葡萄糖作為補(bǔ) 料介質(zhì)。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的新霉素的清潔發(fā)酵工藝，其特征在于所述補(bǔ)料速率控制為對(duì) 發(fā)酵過(guò)程的溫度、pH、溶氧濃度、總糖、還原糖濃度、氨氮濃度參數(shù)進(jìn)行全程監(jiān)控，16h起之后每隔8h取樣測(cè)定以上各參數(shù)，考慮蒸發(fā)導(dǎo)致的發(fā)酵液損失，在30h以后以流加形 式持續(xù)補(bǔ)水，補(bǔ)加速率以抵消蒸發(fā)體積為準(zhǔn)，整個(gè)發(fā)酵周期為120h左右。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的新霉素的清潔發(fā)酵工藝，其特征在于所述發(fā)酵過(guò)程對(duì)其它參數(shù) 的修正改進(jìn)為(1) 溫度發(fā)酵溫度0 105h為36±0.5°C， 105~115h為36~38°C ， 115h至放罐為38。C的 溫度程序控制；(2) pH:發(fā)酵過(guò)程0~80h將pH控制在6.8~6.9之間；80~105h將pH控制在7.0以內(nèi)， 105~120h將pH控制在6.8~7.0;(3) 溶氧濃度在對(duì)數(shù)期逐漸加大通氣量和提高攪拌轉(zhuǎn)速直至設(shè)備滿負(fù)載運(yùn)行；(4) 總糖、還原糖濃度因此發(fā)酵過(guò)程對(duì)總糖不進(jìn)行控制，僅控制最終的放罐殘?zhí)橇?；還原糖的控制策略為80h以前為1.5~2.2%之間；80~105h為0.8~1.5%; 105h以后不補(bǔ)加糖，從而降低120h時(shí)的放罐殘?zhí)橇浚?5) 氨氮濃度將氨氮的控制范圍定為130 140mg'100mr1。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的新霉素的清潔發(fā)酵工藝，其特征在于所述新霉素的清潔發(fā)酵工 藝的發(fā)酵罐為5~10噸罐。
全文摘要
本發(fā)明提供一種新霉素的清潔發(fā)酵工藝，所述新霉素的清潔發(fā)酵工藝為以弗氏鏈霉菌為生產(chǎn)菌株，在傳統(tǒng)的微生物發(fā)酵生產(chǎn)新霉素的工藝基礎(chǔ)上，對(duì)補(bǔ)糖液組成、補(bǔ)料速率控制以及發(fā)酵過(guò)程對(duì)其它參數(shù)的修正改進(jìn)。本發(fā)明的工藝科學(xué)合理，不僅能夠提高發(fā)酵產(chǎn)物的濃度，同時(shí)還能降低放罐殘?zhí)菨舛龋瑢?shí)現(xiàn)可使單位新霉素產(chǎn)量的淀粉單耗顯著下降，同時(shí)排放COD污染量減少近50％，達(dá)到了清潔生產(chǎn)的目的。
文檔編號(hào)C12P19/52GK101210260SQ200710144099
公開(kāi)日2008年7月2日 申請(qǐng)日期2007年12月25日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月25日
發(fā)明者石賢愛(ài), 華 蔣, 郭養(yǎng)浩, 黃啟鵬 申請(qǐng)人:福州大學(xué)