專利名稱：一種針對(duì)一個(gè)或多個(gè)目標(biāo)基因組區(qū)域進(jìn)行邊擴(kuò)增邊連接的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種針對(duì)一個(gè)或多個(gè)目標(biāo)基因組區(qū)域進(jìn)行邊擴(kuò)增邊 連接的公用接頭設(shè)計(jì)方法。本發(fā)明又涉及一種針對(duì)一個(gè)或多個(gè)目標(biāo)基 因組區(qū)域進(jìn)行邊擴(kuò)增邊連接的方法。本發(fā)明所述方法適用于針對(duì)任意 長(zhǎng)度的目標(biāo)基因組區(qū)域的邊擴(kuò)增邊連接工作，所得到的非特異連接的長(zhǎng)鏈DNA可根據(jù)研究需要應(yīng)用于多種DNA分析平臺(tái)。本發(fā)明還涉及一 種針對(duì)一個(gè)或多個(gè)目標(biāo)基因組區(qū)域序列重測(cè)序工作、建立隨機(jī)DNA文 庫(kù)的方法，所得隨機(jī)DNA文庫(kù)可用于通過(guò)包括Sanger測(cè)序技術(shù)、邊合 成邊測(cè)序技術(shù)在內(nèi)的測(cè)序方法對(duì)所述一個(gè)或多個(gè)目標(biāo)基因組區(qū)域序列 進(jìn)行重測(cè)序。
背景技術(shù)：
自1983年Kary Mull is發(fā)明聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction, PCR)以來(lái)，歷經(jīng)三十多年，PCR技術(shù)已成為生物科學(xué)領(lǐng)域 不可或缺的、運(yùn)用廣泛的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。為不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，在?biāo)準(zhǔn)PCR 基礎(chǔ)上又衍生出RT-PCR (Reverse Transcriptase PCR，逆轉(zhuǎn)錄PCR)、 Inverse PCR (反向PCR), J力PCR (原位PCR) ， Long PCR (長(zhǎng) PCR), Real Time PCR (實(shí)時(shí)PCR), Single Cell PCR (單細(xì)胞PCR), Hot Start PCR (熱啟動(dòng)PCR), Colony PCR (菌落PCR) ， AFLP PCR (Amplified Fragment Length Polymorphism PCR，擴(kuò)增片斷長(zhǎng)度 多態(tài)性PCR)等多項(xiàng)技術(shù)手段?？梢哉f(shuō)，自PCR技術(shù)問(wèn)世以來(lái)，分子生 物學(xué)及之后的基于大規(guī)模測(cè)序反應(yīng)的基因組學(xué)均得到了飛速的發(fā)展。本發(fā)明應(yīng)用堿基互補(bǔ)配對(duì)的基本原理，通過(guò)設(shè)計(jì)含"公用接頭，， 的目標(biāo)基因組區(qū)域的引物，在第一輪多核苷酸擴(kuò)增反應(yīng)后，第二輪多 核苷酸擴(kuò)增反應(yīng)中，將目標(biāo)基因組區(qū)域在擴(kuò)增的基礎(chǔ)上進(jìn)行高效地連 接，即"邊擴(kuò)增邊連接"。連接工作按隨機(jī)順序進(jìn)行，在本發(fā)明的上 下文中這種隨機(jī)順序連接的方式稱為"非特異連接"。經(jīng)過(guò)邊擴(kuò)增邊連接得到由目標(biāo)基因組區(qū)域的DNA片段經(jīng)"非特異連接"而成的長(zhǎng)鏈 DNA，此長(zhǎng)鏈DNA可根據(jù)研究需要應(yīng)用于多種DNA分析平臺(tái)。通過(guò)本發(fā)明提出的"邊擴(kuò)增邊連接"方法獲得長(zhǎng)鏈DNA，并經(jīng)過(guò)DM 隨機(jī)打斷法打斷，可建立用于通過(guò)包括Sanger測(cè)序技術(shù)、邊合成邊測(cè) 序技術(shù)在內(nèi)的測(cè)序方法對(duì)所述一個(gè)或多個(gè)目標(biāo)基因組區(qū)域序列進(jìn)行重 測(cè)序工作的隨機(jī)DNA文庫(kù)。本發(fā)明可運(yùn)用于一個(gè)目標(biāo)基因組區(qū)域的邊擴(kuò)增邊連接和隨機(jī)DM 文庫(kù)建立工作，也可用于兩個(gè)及兩個(gè)以上的多個(gè)目標(biāo)基因組區(qū)域邊擴(kuò) 增邊連接和隨機(jī)DM文庫(kù)建立工作。設(shè)計(jì)目的的不同，使本發(fā)明提出的"邊擴(kuò)增邊連接"反應(yīng)與同樣 使用接頭設(shè)計(jì)的串聯(lián)PCR方法具有本質(zhì)的分別串聯(lián)PCR是根據(jù)具體 研究的需要，進(jìn)行特殊的接頭設(shè)計(jì)，將本屬基因組不同區(qū)域的DNA， 甚至是不同物種基因組的DNA片斷進(jìn)行"特異性"連接，以獲得研究所 需要的"功能性DNA片段"。而本發(fā)明是為了得到特異擴(kuò)增的、"非 特異連接"的長(zhǎng)鏈DNA。在本發(fā)明中，除在目標(biāo)基因組區(qū)域的引物設(shè)計(jì)中在正向引物和反 向引物的5，端和3，端分別加上本發(fā)明提出的一對(duì)反向互補(bǔ)的公用接 頭外，兩輪多核苷酸擴(kuò)增反應(yīng)均無(wú)需特殊處理；非特異連接長(zhǎng)鏈DNA 的生成無(wú)需"連接酶"作用。本發(fā)明獲得的長(zhǎng)鏈DNA可突破在保真要求限制下的長(zhǎng)PCR (Long PCR)方法目的片段長(zhǎng)度的限制，而且可免去使用包含特殊酶物質(zhì)的試 劑盒及設(shè)計(jì)更嚴(yán)格引物的麻煩；與使用同連接區(qū)域特異配對(duì)之接頭的 串聯(lián)PCR (overlap PCR)方法相比，本發(fā)明只需設(shè)計(jì)一對(duì)公用接頭， 在第二輪多核苷酸擴(kuò)增反應(yīng)中利用公用接頭將目標(biāo)基因組區(qū)域原始DNA片段按隨機(jī)順序連接，又免去了設(shè)計(jì)多對(duì)可用于特異串聯(lián)的互補(bǔ) 引物的工序，對(duì)本行業(yè)的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)本發(fā)明所涉及的實(shí)驗(yàn)室工作是 簡(jiǎn)單易行且費(fèi)用很低的。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明基于以下認(rèn)識(shí)在目標(biāo)基因組區(qū)域的每對(duì)引物設(shè)計(jì)中加入 反向互補(bǔ)的同一對(duì)"公用接頭"(Universal Adaptor)，對(duì)目標(biāo)基因 組區(qū)域的原始DNA片斷進(jìn)行特異性多核苷酸擴(kuò)增和非酶法連接，形成 由目標(biāo)基因組區(qū)域DNA片段按隨機(jī)順序連接而成的長(zhǎng)鏈DNA混合物。本發(fā)明獲得的長(zhǎng)鏈DNA可在諸多DNA分析平臺(tái)上進(jìn)行應(yīng)用，對(duì)高 通量重測(cè)序工作尤其具有重要的意義。在經(jīng)過(guò)諸如超聲法、噴霧法、 化學(xué)剪切法、酶剪切法等在內(nèi)的DNA隨機(jī)打斷法打斷后，可重新獲得 含有目標(biāo)基因組區(qū)域片段的DM片段，這些DNA片段可高效地涵蓋整 個(gè)目標(biāo)區(qū)域，將其作為重測(cè)序工作的隨機(jī)DNA文庫(kù)(DNA library),可 有效地進(jìn)行目標(biāo)基因組區(qū)域的高通量重測(cè)序工作。本發(fā)明的一個(gè)方面，涉及一種用于針對(duì)一個(gè)或多個(gè)目標(biāo)基因組區(qū) 域進(jìn)行邊擴(kuò)增邊連接的公用接頭，其為兩條以5， —3，方向和以3， —5，方向堿基互補(bǔ)的寡核苷酸序列，其序列結(jié)構(gòu)特征為l)在多核 苷酸擴(kuò)增反應(yīng)退火溫度下不與目標(biāo)基因組結(jié)合；2)自身不形成發(fā)夾等 二級(jí)結(jié)構(gòu)；3)胞嘧啶和鳥(niǎo)噤呤的含量占四種堿基數(shù)量總和的20%-80%; 且4)序列長(zhǎng)度在7-100個(gè)堿基。具體的，所述一對(duì)公用接頭中的一 個(gè)加在多核苷酸擴(kuò)增反應(yīng)正向引物的5，端，與之互補(bǔ)的另一個(gè)加在 多核苷酸擴(kuò)增反應(yīng)反向引物的5'端。本發(fā)明中，為滿足加在引物兩端而不影響對(duì)目標(biāo)基因組區(qū)域進(jìn)行 擴(kuò)增，同時(shí)為降低成本的要求，所述公用接頭的長(zhǎng)度應(yīng)當(dāng)盡可能選擇 較短的寡核苷酸序列，其長(zhǎng)度適當(dāng)?shù)貫?-50個(gè)堿基，優(yōu)選為9- 4 0個(gè)堿基，更優(yōu)選為10-3 O個(gè)堿基，更優(yōu)選為11-2 5個(gè)堿基，更 優(yōu)選為12-2 O個(gè)堿基，更優(yōu)選為13-18個(gè)堿基，甚至更優(yōu)選為17個(gè)堿基。本發(fā)明又一方面，涉及一種針對(duì)一個(gè)目標(biāo)基因組區(qū)域進(jìn)行邊擴(kuò)增 邊連接的方法，包括步驟1) 針對(duì) 一 個(gè)目標(biāo)基因組區(qū)域，設(shè)計(jì)包含本發(fā)明所述公用接頭的用 于多核苷酸擴(kuò)增反應(yīng)的正向和反向引物，其中正向和反向引物中公用 接頭彼此反向互補(bǔ)；2) 利用步驟1)中所述正向和反向引物，通過(guò)第一輪多核苷酸擴(kuò) 增反應(yīng)，擴(kuò)增目標(biāo)基因組區(qū)域，得到在所述目標(biāo)基因組區(qū)域5，端和3， 端加入本發(fā)明所述公用接頭的可連接性DNA片段；3) 步驟2)獲得的可連接性DM片段，作為第二輪多核苷酸擴(kuò)增 反應(yīng)的模板進(jìn)行邊擴(kuò)增邊連接反應(yīng)；得到由步驟2 )所得可連接性DNA 片段連接而成的長(zhǎng)鏈DNA。在本發(fā)明中，所述目標(biāo)基因組序列區(qū)域可以為任意長(zhǎng)度的目標(biāo)基 因組區(qū)域，包括但不限于長(zhǎng)度在70 - 10000個(gè)堿基的序列，例如，長(zhǎng) 度在100 - 3000個(gè)堿基的序列，長(zhǎng)度在300 - 2000個(gè)堿基的序列，長(zhǎng) 度在700 - 1000個(gè)堿基的序列。在本發(fā)明的又一方面，涉及一種針對(duì)兩個(gè)及兩個(gè)以上的多個(gè)目標(biāo) 基因組區(qū)域進(jìn)行邊擴(kuò)增邊連接的方法，包括步驟1) 針對(duì)多個(gè)目標(biāo)基因組區(qū)域的每個(gè)區(qū)域，分別設(shè)計(jì)包含本發(fā)明所 述公用接頭的用于多核苷酸擴(kuò)增反應(yīng)的正向和反向引物，其中每對(duì)正 向和反向引物所含公用接頭彼此反向互補(bǔ)；2) 利用步驟l)中所述正向和反向引物，通過(guò)第一輪多核苷酸擴(kuò) 增反應(yīng)，分別擴(kuò)增目標(biāo)基因組區(qū)域，得到在各個(gè)目標(biāo)基因組區(qū)域5' 端和3，端加入本發(fā)明所述公用接頭的不同可連接性DM片段；3) 將步驟2)獲得的不同可連接性DNA片段進(jìn)行等量地混合，作 為第二輪多核苷酸擴(kuò)增反應(yīng)的模板進(jìn)行邊擴(kuò)增邊連接反應(yīng)；得到由步 驟2)所得不同的可連接性DNA片段按隨機(jī)連接順序連接而成的長(zhǎng)鏈 DNA。在本發(fā)明上下文中，所述第一輪多核苷酸擴(kuò)增反應(yīng)是指常規(guī)多核苷酸擴(kuò)增反應(yīng)，包括例如在多核苷酸擴(kuò)增反應(yīng)儀中首先升高溫度，使原始DNA的雙鏈解旋、打開(kāi)，隨即降低溫度，使正、反向引物分別與 目標(biāo)基因組序列的5，和3，端序列配對(duì)、結(jié)合，并在多核苷酸聚合酶 的作用下，按照堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，以5， —3，的順序、添加多核苷 酸擴(kuò)增反應(yīng)的反應(yīng)體系中游離的dNTPs，經(jīng)過(guò)多次的"變性-退火-延 伸"過(guò)程，使得所述目標(biāo)基因組區(qū)域原始DNA序列得到高效的擴(kuò)增。 在本發(fā)明的上下文中，第一輪多核苷酸擴(kuò)增反應(yīng)所需擴(kuò)增的目標(biāo)基因 組區(qū)域稱為目標(biāo)基因組區(qū)域原始DNA序列，經(jīng)第一輪多核苷酸擴(kuò)增后 得到5，端和3，端加入本發(fā)明所述公用接頭的目標(biāo)基因組區(qū)域，稱為 "可連接性DNA片段"。在本發(fā)明上下文中，所述第二輪多核苷酸擴(kuò)增反應(yīng)是指將在本發(fā) 明第一輪多核苷酸擴(kuò)增反應(yīng)獲得的"可連接性DNA片段"，作為第二 輪多核苷酸擴(kuò)增反應(yīng)的模板，在DNA雙鏈解旋、打開(kāi)后，在堿基互補(bǔ) 配對(duì)原則的指引下， 一條可連接性DNA片段的單鏈3，端的公用接頭 與另一條可與之互補(bǔ)的可連接性DNA片段的單鏈3，端的公用接頭彼 此配對(duì)，作為第二輪多核苷酸擴(kuò)增反應(yīng)的引物，在無(wú)需另加特殊引物 的條件下，進(jìn)行可連接性DNA片段的連接和多核苷酸擴(kuò)增反應(yīng)。擴(kuò)增 和連接同時(shí)進(jìn)行，因此稱為"邊擴(kuò)增邊連接"反應(yīng)。在第二輪多核苷酸擴(kuò)增反應(yīng)中，無(wú)需連接酶的處理，原始DNA片段在公用接頭的帶領(lǐng)下，可在擴(kuò)增的同時(shí)進(jìn)行隨機(jī)順序的連接，形成 "非特異連接的長(zhǎng)鏈DM"。在本發(fā)明的上下文中，按隨機(jī)順序連接 的方式也稱為"非特異連接"。在本發(fā)明上下文中，在第二輪多核苷酸擴(kuò)增反應(yīng)中依據(jù)第一輪所 得DNA產(chǎn)量大小進(jìn)行等量混合是指，根據(jù)第一輪多核苷酸擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn) 物的等摩爾量混合。具體的，可用例如Hoechst染料H33258或 Picogreen對(duì)第一輪多核苷酸擴(kuò)增反應(yīng)所得產(chǎn)物進(jìn)行準(zhǔn)確定量。也可 通過(guò)對(duì)多核苷酸擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，與已知量的DNA Marker比對(duì) 進(jìn)行粗略定量。在本發(fā)明上下文中，所述針對(duì)多個(gè)目標(biāo)基因組區(qū)域進(jìn)行邊擴(kuò)增邊合成的方法，適于兩個(gè)或兩個(gè)以上的任意多個(gè)目標(biāo)基因組區(qū)域，包括2以及大于2的任意整數(shù)。例如，所述方法可以針對(duì)2 - 10000000個(gè) 目標(biāo)基因組區(qū)域進(jìn)行邊擴(kuò)增邊合成，例如2 - 1000000個(gè)目標(biāo)基因組區(qū) 城，2-IOOOOO個(gè)目標(biāo)基因組區(qū)域，2 - 1000個(gè)目標(biāo)基因組區(qū)域，2-IOO個(gè)目標(biāo)基因組區(qū)域。本發(fā)明又一方面，涉及一種建立針對(duì)一個(gè)目標(biāo)基因組區(qū)域序列重 測(cè)序隨機(jī)DNA文庫(kù)的方法，包括步驟1 )針對(duì)一個(gè)目標(biāo)基因組區(qū)域，設(shè)計(jì)包含本發(fā)明所述公用接頭的用 于多核苷酸擴(kuò)增反應(yīng)的正向和反向引物，其中正向和反向引物中公用 接頭彼此反向互補(bǔ)；2) 利用步驟1)中所述正向和反向引物，通過(guò)第一輪多核苷酸擴(kuò) 增反應(yīng)，擴(kuò)增目標(biāo)基因組區(qū)域，得到在所述目標(biāo)基因組區(qū)域5，端和3， 端加入本發(fā)明所述公用接頭的可連接性DNA片段；3) 步驟2)獲得的可連接性DNA片段作為第二輪多核苷酸擴(kuò)增反 應(yīng)的模板進(jìn)行邊擴(kuò)增邊連接反應(yīng)；得到由步驟2)所得可連接性DNA 片段連接而成的長(zhǎng)鏈DM;4) 將步驟3)所得的長(zhǎng)鏈DNA用DNA隨機(jī)打斷法打斷，得到隨機(jī) DM文庫(kù)。本發(fā)明的再一方面，涉及一種建立針對(duì)兩個(gè)及兩個(gè)以上的多個(gè)目 標(biāo)基因組區(qū)域重測(cè)序隨機(jī)DM文庫(kù)的方法，包括步驟1) 針對(duì)多個(gè)目標(biāo)基因組區(qū)域的每個(gè)區(qū)域，分別設(shè)計(jì)包含本發(fā)明所 述公用接頭的用于多核苷酸擴(kuò)增反應(yīng)的正向和反向引物，其中每對(duì)正 向和反向引物所含公用接頭彼此反向互補(bǔ)；2) 利用步驟l)中所述正向和反向引物，通過(guò)第一輪多核苷酸擴(kuò) 增反應(yīng)，分別擴(kuò)增目標(biāo)基因組區(qū)域，得到在各個(gè)目標(biāo)基因組區(qū)域5' 端和3，端加入公用接頭的不同可連接性DM片段；3) 將步驟2)獲得的不同可連接性DNA片段進(jìn)行等量地混合，作 為第二輪多核苷酸擴(kuò)增反應(yīng)的模板進(jìn)行邊擴(kuò)增邊連接反應(yīng)；得到由步 驟2)所得不同的可連接性DNA片段按隨機(jī)連接順序連接而成的長(zhǎng)鏈DNA;4)將步驟3)所得的長(zhǎng)鏈DNA用DNA隨機(jī)打斷法打斷，得到隨機(jī) DNA文庫(kù)。在本發(fā)明上下文中，所述建立針對(duì)多個(gè)目標(biāo)基因組區(qū)域重測(cè)序隨 機(jī)DM文庫(kù)的方法，適于兩個(gè)或兩個(gè)以上的任意多個(gè)目標(biāo)基因組區(qū)域， 包括2以及大于2的任意整數(shù)。例如，所述方法可以針對(duì)2 - 10000000 個(gè)目標(biāo)基因組區(qū)域進(jìn)行邊擴(kuò)增邊合成，例如2 - 1000000個(gè)目標(biāo)基因組 區(qū)域，2 - 100000個(gè)目標(biāo)基因組區(qū)域，2 - 1000個(gè)目標(biāo)基因組區(qū)域，2 -100個(gè)目標(biāo)基因組區(qū)域。在本發(fā)明上下文中，打斷所得長(zhǎng)鏈DNA序列所述DNA隨機(jī)打斷法 包括超聲法、噴霧法、化學(xué)剪切法、酶剪切法等在內(nèi)的本領(lǐng)域周知的 打斷DM序列的方法。


圖1描述了利用公用接頭進(jìn)行目標(biāo)基因組區(qū)域邊擴(kuò)增邊連接反應(yīng) 的流程。其中圖1A示例了引物設(shè)計(jì)過(guò)程，具體的，(l)顯示為設(shè)計(jì)好的引物， 包含黑色的公用接頭(Universal Adaptor)和花色的目標(biāo)基因組區(qū)域 原始引物兩部分；(2)顯示所設(shè)計(jì)的引物，在第一輪多核普酸擴(kuò)增反應(yīng) 的退火過(guò)程中，可與目標(biāo)基因組區(qū)域進(jìn)行配對(duì)，引導(dǎo)目標(biāo)基因組區(qū)域 原始DNA序列的特異性擴(kuò)增。圖1B示例了第一輪多核苷酸擴(kuò)增反應(yīng)將設(shè)計(jì)好的含有公用接頭 的引物使特定的目標(biāo)基因組區(qū)域擴(kuò)增，得到目標(biāo)基因組區(qū)域原始DNA 序列5，端和3，端加上公用接頭的可連接性DNA片段(4)。其中，一 個(gè)多核苷酸擴(kuò)增反應(yīng)只擴(kuò)增一個(gè)目標(biāo)基因組區(qū)域。若目標(biāo)基因組區(qū)域 數(shù)目大于1,則每個(gè)目標(biāo)基因組區(qū)域的多核苷酸擴(kuò)增反應(yīng)需獨(dú)立進(jìn)行。圖1C示例了笫二輪多核苷酸擴(kuò)增和連接反應(yīng)(邊擴(kuò)增邊連接反 應(yīng))。具體分兩種情況1) 針對(duì)一個(gè)目標(biāo)基因組區(qū)域，以第一輪多核苷酸擴(kuò)增產(chǎn)物為模板、公用接頭為引物進(jìn)行第二輪多核苷酸擴(kuò)增反應(yīng)(未畫(huà)出)；2) 針對(duì)兩個(gè)及兩個(gè)以上的多個(gè)目標(biāo)基因組區(qū)域，將第一輪多核苷酸擴(kuò)增得到的可連接性DNA片段進(jìn)行等量混合，將混合物作為第二輪 多核苷酸擴(kuò)增反應(yīng)模板、公用接頭為引物進(jìn)行第二輪多核苷酸擴(kuò)增反 應(yīng)，如(2) - (3) -.(4)所示；其中，反向互補(bǔ)的公用接頭在多核苷酸擴(kuò)增反應(yīng)退火階段彼此配 對(duì)，作為第二輪多核苷酸擴(kuò)增反應(yīng)的引物，使可連接性DNA片段解旋 后的單鏈在多核苷酸聚合酶的作用下延伸、形成雙鏈DNA，獲得非特 異連接的長(zhǎng)鏈DNA。擴(kuò)增和連接反應(yīng)同時(shí)進(jìn)行，稱為"邊擴(kuò)增邊連接" 反應(yīng)。獲得的長(zhǎng)鏈DNA可運(yùn)用類似全基因組打碎后測(cè)序的策略，通過(guò)(5 ) 用DNA隨機(jī)打斷法將長(zhǎng)鏈DNA打斷、建立隨機(jī)DNA文庫(kù)，再用包含 Sanger測(cè)序4支術(shù)、邊合成邊測(cè)序4支術(shù)在內(nèi)的測(cè)序方法進(jìn)4亍測(cè)序。圖2為實(shí)施例1中經(jīng)過(guò)第一輪多核苷酸擴(kuò)增反應(yīng)，獲得的"可連 接性DNA片段"的凝膠電泳圖，其中9個(gè)可連接性DNA片段為9個(gè)目 標(biāo)基因組區(qū)域C57^W-10 、 C5WA-18 、 "U-1 、 "U-5 、 "D"9 、 2 、iO y^-l、 iX^、和1原始序列的5，端和3'端連接上公用接頭 (各20個(gè)堿基，共計(jì)40個(gè)堿基)后的產(chǎn)物，用C577A-10' ( 483bp)、 C57^7A-18， ( 375bp)、 7^7-1， (524bp) 、 /J"-5 ， (595bp) 、 "J2"9 ， (556bp)、 /^L -12 , (490bp)、 AX45H ， (531bp) 、 /X45M ， (404bp) 和蕭^y-l' (419bp)表示。其中膠圖上；W^y-l，的大小(約500bp) 與理論值(419bp)不符，重測(cè)序結(jié)果證明iVA^-l存在非特異擴(kuò)增。圖3為實(shí)施例1中笫二輪多核苷酸擴(kuò)增和連接反應(yīng)，即邊擴(kuò)增邊 連接反應(yīng)獲得的"非特異連接的長(zhǎng)鏈DM"的凝膠電泳圖；圖4為將邊擴(kuò)增邊連接反應(yīng)得到的非特異連接的長(zhǎng)鏈DNA產(chǎn)物用 超聲法打斷、建庫(kù)、用Sanger測(cè)序技術(shù)測(cè)序，所得到的含有雜合位點(diǎn) 的片段測(cè)序結(jié)果。其中在用超聲法將非特異連接的長(zhǎng)鏈DM產(chǎn)物打斷 后，建立pUC 118 DNA文庫(kù)，并在ABI公司的3730x1測(cè)序儀上用Sanger測(cè)序法進(jìn)行重測(cè)序工作。圖中所示為(^尸M-10重測(cè)序后得到的雜合位點(diǎn)顯示。圖5為實(shí)施例2中所得非特異連接的長(zhǎng)鏈DM之凝膠電泳圖。 圖6為實(shí)施例3中所得凝膠電泳圖，其中選擇人類基因組中與癌 癥相關(guān)的候選基因^ ^2的第IO個(gè)外顯子的一部分(在本實(shí)施例中命 名為10j)作為一個(gè)目標(biāo)基因組區(qū)域，利用公用接頭(各l 7 個(gè)堿基，共3 4個(gè)堿基)，經(jīng)過(guò)兩輪多核苷酸擴(kuò)增反應(yīng)，將一個(gè)目標(biāo) 基因組區(qū)域擴(kuò)增并連接形成長(zhǎng)鏈DNA。圖7為實(shí)施例4中所得酶切反應(yīng)電泳圖。其中選擇人類基因組中 與癌癥相關(guān)的候選基因A (^2的第6個(gè)外顯子(序列長(zhǎng)度446，在5， 至3，方向的第167個(gè)堿基處含一個(gè)化2zw71酶切位點(diǎn))作為一個(gè)目標(biāo) 基因組區(qū)域，利用公用接頭(各17個(gè)堿基，共34個(gè)堿基)，經(jīng)過(guò)兩 輪多核苷酸擴(kuò)增反應(yīng)，將一個(gè)目標(biāo)基因組區(qū)域擴(kuò)增并連接形成的長(zhǎng)鏈 DM,隨后將第一輪多核苷酸擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物和經(jīng)兩輪多核苷酸反應(yīng)擴(kuò) 增、連接得到的長(zhǎng)鏈DNA用異丙醇沉淀法純化，并在相同條件下用As/z^ I酶切。實(shí)施例實(shí)施例1實(shí)施例l選用人類基因組中癌癥相關(guān)的候選基因CSFM基因的第 10、 18個(gè)外顯子、X4A7基因的第1、 5、 9、 12外顯子、/WS基因的 第1、 4外顯子和iVWS基因的笫l個(gè)外顯子作為目標(biāo)基因組區(qū)域，通 過(guò)兩輪多核苷酸反應(yīng)擴(kuò)增、連接，并通過(guò)Sanger測(cè)序技術(shù)測(cè)序驗(yàn)證本 方法的有效性。具體過(guò)程如下1.引物設(shè)計(jì)選擇人類基因組中與癌癥相關(guān)的候選基因C57^A基因的第10、 18個(gè)外顯子、X4U基因的第1、 5、 9、 12外顯子、AX^基因的第1、 4 外顯子和^A^基因的第1個(gè)外顯子作為目標(biāo)基因組區(qū)域原始DNA片 段，用Primer3軟件設(shè)計(jì)9對(duì)引物，在9對(duì)引物中為正向引物加上CGC GGATCC GCGGCCGC TTC序列，在反向引物加上GAA GCGGCCGC GGATCC GCG 序列(均增加在引物序列的5，端)，這兩段寡核苷酸序列反向互補(bǔ)， 為本實(shí)施例的公用接頭，其中GGATCC為HI酶切位點(diǎn)，GCGGCCGC 為^ 纟I酶切位點(diǎn)。設(shè)計(jì)好的引物為(下劃線部分即為公用接頭序列) CW^ -IO(序列長(zhǎng)度443): 正向引物CGCGGATCCGCGGCCGCTTCGAGCACCCACTGTGTTCCAG 反向引物GAAGCGGCCGCGGATCCGCGTGATTAGCACCTGTCTCTCGC (757^ -18 (序列長(zhǎng)度335 ): 正向引物CGCGGATCCGCGGCCGCTTCTCCAACTACATTGTCAAGGGC 反向引物GAAGCGGCCGCGGATCCGCGCATTCCTGCACTCTCACCAAC "D-l (序列長(zhǎng)度484 ):正向引物CGCGGATCCGCGGCCGCTTCTTCTGGGCTCAAGCTATCTGC 反向引物GAAGCGGCCGCGGATCCGCGAACACACACGCCAGCCATAC(序列長(zhǎng)度555 ): 正向引物CGCGGATCCGCGGCCGCTTCCACTTGGCCACTGTGTTGTAA 反向引物GAAGCGGCCGCGGATCCGCGAATGGGAGAAGTGCAATACCA(序列長(zhǎng)度516): 正向引物CGCGGATCCGCGGCCGCTTCGGCACTACATCGGATTCATGG 反向引物GAAGCGGCCGCGGATCCGCGGAACTTCAAGTCACTTCTAGACCACC 12 (序列長(zhǎng)度450 ): 正向引物CGCGGATCCGCGGCCGCTTCGCCTGTTTGACTGGCATTATTC 反向引物GAAGCGGCCGCGGATCCGCGCTGACACCTAGCTGTGATCCTG iTA^-l (序列長(zhǎng)度491):正向引物CGCGGATCCGCGGCCGCTTCTCTTAAGCGTCGATGGAGGAG 反向引物GAAGCGGCCGCGGATCCGCGTTGAAACCCAAGGTACATTTCAGi X^-4 (序列長(zhǎng)度:364 ):正向引物CGCGGATCCGCGGCCGCTTCTCAGTTGCCTGAAGAGAAACATAA 反向引物GAAGCGGCCGCGGATCCGCGTAACAGTCTGCATGGAGCAGGM^9-l (序列長(zhǎng)度379 ):正向引物CGCGGATCCGCGGCCGCTTCCCAAATGGAAGGTCACACTAGG 反向引物GAAGCGGCCGCGGATCCGCGGAACTCAACACTGAGTTTGCAATAG2. 第一輪多核苷酸擴(kuò)增反應(yīng)九個(gè)目標(biāo)基因組區(qū)域原始DNA片斷的擴(kuò)增反應(yīng)獨(dú)立進(jìn)行。 多核苷酸擴(kuò)增體系(10ja 1 ):腿(5ng/m 1): 1 m 1，引物(10jiM):正反向引物各0. 4 m 1 ， Taq DNA聚合酶(5U/ jn 1 ): 1 jli 1, 10 x buffer:5jiil, dNTPs(2.5mM): 0. 8jnl， ddH20: 1.4pl。多核苷酸擴(kuò)增反應(yīng)程序(在GeneAmp 9700多核苷酸擴(kuò)增反應(yīng)儀上反應(yīng))94度/lG分鐘94度/30秒-58度/30秒-72度/1分鐘，40個(gè)循環(huán) 72度/5分鐘。第一輪多核苷酸擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，獲得在兩端連上公用接頭的可 用于"邊擴(kuò)增邊連接"反應(yīng)的CS尸^ -10， C5757W-18， /^7-1， ""-5， /^7-9， X4^ -12， ^ ^y-l， iX4S一和A^ASH共九種可連接性DNA片 段，用dlO' 、 C5^-18' 、 u-r 、 U-5' 、 、 /JU-12' 、 AX^-1' 、 MA^-4'和廁^SK'表示。根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)量， 九種產(chǎn)物以等DNA量的方式進(jìn)行混合，作為第二輪多核苷酸擴(kuò)增和連接反應(yīng)的模板。實(shí)驗(yàn)?zāi)z圖見(jiàn)圖2。3. 第二輪多核苷酸擴(kuò)增和連接反應(yīng)(邊擴(kuò)增邊連接反應(yīng)) 多核苷酸擴(kuò)增體系(20m1):模板8jul， Taq dna聚合酶(5U/pi): 2|jl, 10xbuffer: 2jnl， dNTPs (2. 5mM): 1.6pl， ddH20:6. 4jn 1。其中模板取自笫一輪多核苷酸擴(kuò)增反應(yīng)所得產(chǎn)物的等量混合 物。多核苷酸擴(kuò)增程序(在GeneAmp 9800多核苷酸擴(kuò)增反應(yīng)儀上反 應(yīng))94度/2分鐘94度/15秒-60度/30秒-68度/8分鐘，10個(gè)循環(huán) 94度/15秒-60度/30秒-68度/8分鐘(每輪循環(huán)增加20秒)， 共15個(gè)循環(huán)72度/lQ分鐘。第二輪多核苷酸擴(kuò)增和連接反應(yīng)結(jié)束后，獲得"非特異連接的長(zhǎng) 鏈腿，，。本輪多核苷酸擴(kuò)增反應(yīng)無(wú)需添加引物，連接反應(yīng)無(wú)需添加連接酶。 獲得的非特異連接的長(zhǎng)鏈DNA的電泳檢測(cè)膠圖見(jiàn)圖3。4.建立載體文庫(kù)、使用Sanger測(cè)序技術(shù)測(cè)序運(yùn)用超聲法打斷已獲得的非特異連接的長(zhǎng)鏈DM。取長(zhǎng)度在1. 5~ 2kb的片段建立pUC 118 DNA文庫(kù)，并在ABI公司的3730x1測(cè)序儀上 用Sanger測(cè)序技術(shù)測(cè)序。片段測(cè)序的結(jié)果與原始DNA片段第一輪多核 苷酸擴(kuò)增后的產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，以確定"打斷后DNA片段"的 序列位置，并驗(yàn)證測(cè)序質(zhì)量。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示打斷后DNA片段中含C57^7-l 0片段17條，C57^) -l8 片段21條，/^7-l片段12條，"D-5片段55條，/JU-9片段21 條，/^7-12片段40條，AX45K片段19條，M/^-4片段45條，MM-1 片段36條，共獲有效讀長(zhǎng)7274bp,占總測(cè)序量的63. 89%。在余下的 測(cè)序讀長(zhǎng)中，非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物達(dá)20. 37%，可通過(guò)提高原始DNA片段 的引物質(zhì)量，減少非特異性擴(kuò)增，提高測(cè)序效率。對(duì)獲得有效讀長(zhǎng)的DNA片段的統(tǒng)計(jì)表明，已獲得的DNA片段可完 全覆蓋本實(shí)施例中的九個(gè)目標(biāo)基因組區(qū)域，并可有效檢測(cè)出本實(shí)施例 中九個(gè)目標(biāo)基因組區(qū)域原始DNA片段中所含有的全部雜合位點(diǎn)。圖4顯示了其中一個(gè)來(lái)自"^7-10序列的雜合位點(diǎn)。 實(shí)施例2:本實(shí)施例選用人類基因組中癌癥相關(guān)的候選基因朋CW和朋"2 基因的70個(gè)外顯子作為目標(biāo)基因組區(qū)域，通過(guò)兩輪多核普酸反應(yīng)擴(kuò) 增、連接。具體過(guò)程如下:1.引物設(shè)計(jì)選擇人類基因組中與癌癥相關(guān)的候選基因朋"7和朋基因的 70個(gè)外顯子作為70個(gè)目標(biāo)基因組區(qū)域，用Primer3軟件設(shè)計(jì)70對(duì)引 物，在每對(duì)引物中的一個(gè)加上17個(gè)堿基長(zhǎng)度的GTAAAACGACGGCCAGT 序列，另 一個(gè)加上17個(gè)堿基長(zhǎng)度的ACTGGCCGTCGTTTTAC序列(均增加 在引物序列的5，端)，這兩段寡核苷酸序列反向互補(bǔ)，為本實(shí)驗(yàn)的 公用接頭。以^ a7基因的第1、第IO個(gè)外顯子，和5^^2基因第5、第24 個(gè)外顯子為例，設(shè)計(jì)好的引物為(下劃線部分即為公用接頭序列)MCW-1(序列長(zhǎng)度530):正向引物GTAAAACGACGGCCAGTATTGCGCCATCACACTCTAGC 反向引物ACTGGCCGTCGTTTTACTTTGTGCTCATGGCAGATTTC;朋CW-18(序列長(zhǎng)度548):正向引物GTAAAACGACGGCCAGTGGGTTTCTCTTGGTTTCTTTGA 反向引物ACTGGCCGTCGTTTTACGTTGCCAGAATAAATGAAAATGGT朋tX -5(序列長(zhǎng)度451):正向引物GTAAAACGACGGCCAGTCAATGTACACATGTAACACCACAAA 反向引物ACTGGCCGTCGTTTTACCCAAGACATATCAGGATCCACCT朋0^-24(序列長(zhǎng)度452):正向引物ACTGGCCGTCGTTTTACTCAGCTATTTTGATTTGCTTTTATT 反向引物GTAAAACGACGGCCAGTAGCTATTTCCTTGATACTGGACTG2. 笫一輪多核苷酸擴(kuò)增反應(yīng)多核苷酸擴(kuò)增體系UOpl) : DNA(5ng/iu 1): 1 jal，引物(5ju M):正反向引物各0. 4 p 1 ， Taq DM聚合酶(5U/ p 1 ): 1 /a 1 ， 10 x buffer: ljjl， dNTPs (2.5mM) : 0. 8yl， ddH20: 5.4/j1。多核苷酸擴(kuò)增反應(yīng)程序(在GeneAmp 9700多核苷酸擴(kuò)增反應(yīng)儀上 反應(yīng))94度/5分鐘94度/30秒-62度/35秒-72度/35秒，40個(gè)循環(huán) 72度/10分鐘。第 一輪多核苷酸擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，獲得在7 0個(gè)目標(biāo)基因組區(qū)域原 始序列的5，端和3，端連上公用接頭的可用于"邊擴(kuò)增邊連接"反應(yīng) 的70種產(chǎn)物。根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)量，70種產(chǎn)物以等DNA量的方式進(jìn)行混合， 作為第二輪多核苷酸擴(kuò)增和連接反應(yīng)的模板。3. 第二輪多核苷酸擴(kuò)增和連接反應(yīng)(邊擴(kuò)增邊連接反應(yīng)) 多核苷酸擴(kuò)增體系(20ja 1):模板6jal， Taq DNA聚合酶(5U/Ml) : 2jal， 10 x buffer: 2jli1,證Ps ( 2.5mM) : 1.6jul， ddH20: 8.4ju 1。其中模板取自第一輪多核苷酸擴(kuò)增反應(yīng)所得產(chǎn)物的等量混合 物。多核苷酸擴(kuò)增程序(在GeneAmp 9800多核苷酸擴(kuò)增反應(yīng)儀上反 應(yīng))94度/2分鐘94度/15秒-60度/30秒-68度/8分鐘，10個(gè)循環(huán) 94度/15秒-60度/30秒-68度/8分鐘(每輪循環(huán)增加20秒)， 共15個(gè)循環(huán)72度/lG分鐘。第二輪多核苷酸擴(kuò)增和連接反應(yīng)結(jié)束后，獲得"非特異連接的長(zhǎng) 鏈DNA"。本輪多核苷酸擴(kuò)增反應(yīng)無(wú)需添加引物，連接反應(yīng)無(wú)需添加連接酶。獲得的非特異連接的長(zhǎng)鏈DNA的電泳檢測(cè)膠圖見(jiàn)圖5。4.建立隨機(jī)DNA文庫(kù)、使用邊合成邊測(cè)序測(cè)序技術(shù)進(jìn)行測(cè)序 根據(jù)Illumina Genome Ana Iyer測(cè)序儀工作條件要求，運(yùn)用噴霧 法打斷已獲得的非特異連接的長(zhǎng)鏈DNA，取長(zhǎng)度在100-200bp的片段 建立隨機(jī)DNA文庫(kù)，在Illumina Genome Ana Iyer測(cè)序儀上運(yùn)用邊 合成邊測(cè)序技術(shù)進(jìn)行測(cè)序。片段測(cè)序的結(jié)果與目標(biāo)區(qū)域的堿基序列進(jìn) 行比對(duì)，以確定"打斷后DNA片段"的序列位置，并驗(yàn)證測(cè)序質(zhì)量。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示70個(gè)目標(biāo)基因組區(qū)域全部比對(duì)成功，覆蓋率均達(dá) 100%，平均每個(gè)堿基覆蓋的次數(shù)達(dá)2000次。對(duì)雜合位點(diǎn)的分析顯示使 用本發(fā)明提出的方法合成的目標(biāo)基因組區(qū)域非特異連接的長(zhǎng)鏈DNA、 結(jié)合邊合成邊測(cè)序技術(shù)進(jìn)行測(cè)序，可有效檢測(cè)出所有的雜合位點(diǎn)。與 70個(gè)目標(biāo)基因組區(qū)域的PCR產(chǎn)物用Sanger法重測(cè)序結(jié)果比較，無(wú)假 陽(yáng)性和假陰性。實(shí)施例3:本實(shí)施例選用人類基因組中癌癥相關(guān)的候選基因A W2的第10 個(gè)外顯子的一部分(在本實(shí)施例中命名為A "2-10j)作為目標(biāo)基因 組區(qū)域，通過(guò)兩輪多核普酸反應(yīng)擴(kuò)增、連接。具體過(guò)程如下1.引物設(shè)計(jì)選擇人類基因組中與癌癥相關(guān)的候選基因A "2的第IO個(gè)外顯子 的一部分(在本實(shí)^例中命名為A (X -10j)作為一個(gè)目標(biāo)基因組區(qū) 域，用Primer3軟件設(shè)計(jì)引物，在正向引物中一個(gè)加上17個(gè)堿基長(zhǎng)度 的序列GTAAAACGACGGCCAGT，在反向引物中加上17個(gè)堿基長(zhǎng)度的 ACTGGCCGTCGTTTTAC序列(均增加在引物序列的5，端)，這兩段寡核 苷酸序列反向互補(bǔ)，為本實(shí)驗(yàn)的公用接頭。設(shè)計(jì)好的引物為(下劃線部分即為公用接頭序列)朋"2 -10j(序列長(zhǎng)度478):正向引物GTAAAACGACGGCCAGTAAAGATGAAACGGACTTGCTATT 反向引物ACTGGCCGTCGTTTTACGTTGTCCCTGGAAGGTCACTA。2. 第一輪多核苷酸擴(kuò)增反應(yīng)多核苷酸擴(kuò)增體系(IOjjI) : DNA(5ng/ju 1): 1 m 1，引物(5 p M) 正反向引物各0. 4 ju 1 ， Taq DNA聚合酶(5U/ ju 1 ): 1 ju 1 ， 10 x buffer: ljLil， dNTPs ( 2.5mM ) : 0. 8jul， ddH20: 5. 4jnl。多核苷酸擴(kuò)增反應(yīng)程序(在GeneAmp 9700多核苷酸擴(kuò)增反應(yīng)儀上 反應(yīng))94度/5分鐘94度/30秒-62度/35秒-72度/35秒，40個(gè)循環(huán) 72度/lG分鐘。第一輪多核苷酸擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，獲得在這一個(gè)目標(biāo)基因組區(qū)域 原始序列的5，端和3，端連上公用接頭的可用于進(jìn)一步連接的可連接 性DNA片段朋C^-10j，(序列長(zhǎng)度512)。實(shí)驗(yàn)?zāi)z圖見(jiàn)圖6。3. 第二輪多核苷酸擴(kuò)增和連接反應(yīng)多核苷酸擴(kuò)增體系(20y 1):模板8jil， Taq DNA聚合酶(5U/ y 1) : 2 m 1, 10 x buffer: 2 ja 1， d證s ( 2.5mM) : 1. 6 |a 1， ddH20: 6.4jjl。其中模板取自第一輪多核苷酸擴(kuò)增反應(yīng)所得產(chǎn)物。多核苷酸擴(kuò)增程序(在GeneAinp 9800多核苷酸擴(kuò)增反應(yīng)儀上反 應(yīng))94度/2分鐘94度/15秒-60度/30秒-68度/8分鐘，10個(gè)循環(huán) 94度/15秒-60度/30秒-68度/8分鐘(每輪循環(huán)增加20秒)， 共15個(gè)循環(huán)72度/lG分鐘。第二輪多核苷酸擴(kuò)增和連接反應(yīng)結(jié)束后，獲得"非特異連接的長(zhǎng) 鏈腿"。本輪多核苷酸擴(kuò)增反應(yīng)無(wú)需添加引物，連接反應(yīng)無(wú)需添加連接酶。獲得的非特異連接的長(zhǎng)鏈DM的電泳檢測(cè)膠圖見(jiàn)圖6 。 實(shí)施例4:本實(shí)施例選用人類基因組中癌癥相關(guān)的候選基因A^^2的第6個(gè) 外顯子(序列長(zhǎng)度446 ，在5， —3，方向的第167個(gè)堿基處含一個(gè) Sa/z^I酶切位點(diǎn))作為一個(gè)目標(biāo)基因組區(qū)域，通過(guò)兩輪多核苷酸擴(kuò)增 反應(yīng)擴(kuò)增、連接成長(zhǎng)鏈DM。第一輪多核苷酸擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物和經(jīng)兩輪 多核苷酸反應(yīng)擴(kuò)增、連接得到的長(zhǎng)鏈DM經(jīng)異丙醇沉淀法純化后、在 相同條件下進(jìn)行酶切。具體過(guò)程如下1. 引物設(shè)計(jì)選擇人類基因組中與癌癥相關(guān)的候選基因^ "^的第6個(gè)外顯子 的作為一個(gè)目標(biāo)基因組區(qū)域，用Primer3軟件設(shè)計(jì)引物，在正向引物 中一個(gè)加上17個(gè)堿基長(zhǎng)度的序列GTAAAACGACGGCCAGT，在反向引物中 加上17個(gè)堿基長(zhǎng)度的ACTGGCCGTCGTTTTAC序列(均增加在引物序列的 5，端)，這兩段寡核苷酸序列反向互補(bǔ)，為本實(shí)驗(yàn)的公用接頭。 設(shè)計(jì)好的引物為(下劃線部分即為公用接頭序列) -6(序列長(zhǎng)度:446): 正向引物GTAAAACGACGGCCAGTTTCTGCCTCATACAGGCAATTC 反向引物ACTGGCCGTCGTTTTACCATAATGCTTGACACCACTGGAC。2. 第一輪多核苷酸擴(kuò)增反應(yīng)多核苷酸擴(kuò)增體系U0m 1) : DNA(5ng/ja 1): 1 m 1，引物(5 u M):正反向引物各0. 4 ia 1 ， Taq ■聚合酶(5U/ |i 1 ): 1 n 1,10 x buf f er: dNTPs ( 2.5mM) : 0.8|al， ddH20: 5.4pl。多核苷酸擴(kuò)增反應(yīng)程序(在GeneAmp 9700多核苷酸擴(kuò)增反應(yīng)儀上 反應(yīng))94度/5分鐘94度/30妙-58度/35秒-72度/35秒，40個(gè)循環(huán) 72度/10分鐘。第一輪多核苷酸擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，獲得在這一個(gè)目標(biāo)基因組區(qū)域 原始序列的5，端和3，端連上公用接頭的可用于進(jìn)一步連接的可連接 性DNA片段A C42-6'(序列長(zhǎng)度480 )。實(shí)驗(yàn)?zāi)z圖見(jiàn)圖7。3. 第二輪多核苷酸擴(kuò)增和連接反應(yīng)多核苷酸擴(kuò)增體系(20jul):模板8yl， Taq DNA聚合酶(5U/ jli1): 2jal， 10 x buffer: 2jal， dNTPs ( 2.5mM) : 1.6)al, d歸 6.4pl。其中模板取自第一輪多核苷酸擴(kuò)增反應(yīng)所得產(chǎn)物。多核苷酸擴(kuò)增程序(在GeneAmp 9800多核苷酸擴(kuò)增反應(yīng)儀上反 應(yīng))94度/1分鐘94度/10秒-68度/15分鐘，14個(gè)循環(huán) 94度/10秒-68度/15分鐘(每輪循環(huán)增加15秒)，共16個(gè) 循環(huán)72度/lQ分鐘。第二輪多核苷酸擴(kuò)增和連接反應(yīng)結(jié)束后，獲得"非特異連接的長(zhǎng) 鏈DNA"。本輪多核苷酸擴(kuò)增反應(yīng)無(wú)需添加引物，連接反應(yīng)無(wú)需添加連接酶。 獲得的非特異連接的長(zhǎng)鏈DNA的電泳檢測(cè)膠圖見(jiàn)圖7。4. 細(xì)〃1酶切首先將笫一輪多核苷酸擴(kuò)增反應(yīng)獲得的產(chǎn)物、和經(jīng)兩輪多核苷酸 反應(yīng)擴(kuò)增、連接獲得的長(zhǎng)鏈DNA，用異丙醇沉淀法進(jìn)行純化。具體過(guò)程如下取第一輪多核苷酸擴(kuò)增反應(yīng)擴(kuò)增產(chǎn)物100 ju 1，加入100 ia 1異丙 醇，10p lNaCl2 ( 6mM) ，-80lC冷凍1小時(shí)后在4'C溫度條件下、 13， OOOrpm轉(zhuǎn)速離心30分鐘，棄去上清液后加入500 p 1 80%乙醇，4 X:溫度條件下、13， OOOrpm轉(zhuǎn)速離心IO分鐘，棄去上清液，室溫晾干， 加入100p 1 ddH20 ,混合均勻。用NanoDrop核酸蛋白測(cè)定4義ND-1000 測(cè)得純化后產(chǎn)物濃度為37.9ng/yl;取經(jīng)兩輪多核苷酸反應(yīng)擴(kuò)增、連接獲得的長(zhǎng)鏈dna產(chǎn)物30m1 ， 加入30u 1異丙醇，3ja INaCh ( 6mM) ，-80X:冷凍1小時(shí)后在4X:溫度 條件下、13， 000rpm轉(zhuǎn)速離心30分鐘，棄去上清液后加入500 ju 1 80% 乙醇，4t:溫度條件下、13， OOOrpm轉(zhuǎn)速離心10分鐘，棄去上清液， 室溫晾干，加入100p lddH20 ，混合均勻。用NanoDrop核酸蛋白測(cè)定 儀冊(cè)-1000測(cè)得純化后產(chǎn)物濃度為35.0 ng/jjl。將純化后的產(chǎn)物在相同條件下進(jìn)行^/z^I酶切。具體過(guò)程如下 酶切反應(yīng)體系(20 m 1 ):純化后產(chǎn)物6 |a 1， Sa/z^I酶(15U/ m 1 ): 1.5jil, 10 xk buffer: 2pl， 0. 1%BSA: 2jil， ddH20: 8. 5yl。 反應(yīng)條件37t:水浴2小時(shí)，酶切實(shí)驗(yàn)的膠圖見(jiàn)圖7。 圖7顯示經(jīng)純化處理過(guò)的可連接性DNA片段(S^7^ -6，)經(jīng) &邁#1酶切后得到兩條特異性片段，而經(jīng)純化處理過(guò)的經(jīng)本發(fā)明提出 的實(shí)驗(yàn)方法擴(kuò)增、連接得到的長(zhǎng)鏈DNA經(jīng)A邁VI酶切后得到片段長(zhǎng)度 與可連接性DNA片段長(zhǎng)度一致的產(chǎn)物。酶切實(shí)驗(yàn)的結(jié)果證實(shí)了本發(fā)明 提出的針對(duì)貝標(biāo)基因組區(qū)域進(jìn)行的邊擴(kuò)增邊連接方法的有效性。
權(quán)利要求
1. 一種對(duì)一個(gè)和多個(gè)目標(biāo)基因組區(qū)域進(jìn)行邊擴(kuò)增邊連接的公用接頭，其包括兩條以5’→3’方向和以3’→5’方向堿基互補(bǔ)的寡核苷酸序列，所述寡核苷酸序列的結(jié)構(gòu)特征為1)在多核苷酸擴(kuò)增和連接退火溫度下不與目標(biāo)基因組結(jié)合；2)自身不形成發(fā)夾等二級(jí)結(jié)構(gòu)；3)胞嘧啶和鳥(niǎo)嘌呤的含量占四種堿基數(shù)量總和的20％-80％；且4)序列長(zhǎng)度在7-100堿基。
2. —種針對(duì)一個(gè)目標(biāo)基因組區(qū)域進(jìn)行邊擴(kuò)增邊連接的方法，包 括步驟1) 針對(duì)一個(gè)目標(biāo)基因組區(qū)域，設(shè)計(jì)包含權(quán)利要求1所述公用接 頭的用于多核苷酸擴(kuò)增反應(yīng)的正向和反向引物，其中正向和反向引物 中公用接頭彼此反向互補(bǔ)；2) 利用步驟1)中所述正向和反向引物，通過(guò)第一輪多核苷酸 擴(kuò)增反應(yīng)，擴(kuò)增目標(biāo)基因組區(qū)域，得到在所述目標(biāo)基因組區(qū)域5，端 和3，端加入權(quán)利要求1所述公用接頭的可連接性DNA片段；3) 步驟2)獲得的可連接性DNA片段，作為第二輪多核苷酸擴(kuò) 增反應(yīng)的模板進(jìn)行邊擴(kuò)增邊連接反應(yīng)；得到由步驟2)所得可連接性 DNA片段連接而成的長(zhǎng)鏈DNA。
3. —種針對(duì)兩個(gè)及兩個(gè)以上的多個(gè)目標(biāo)基因組區(qū)域進(jìn)行邊擴(kuò)增 邊連接的方法，包括步驟1) 針對(duì)多個(gè)目標(biāo)基因組區(qū)域的每個(gè)區(qū)域，分別設(shè)計(jì)包含權(quán)利要 求1所述公用接頭的用于多核苷酸擴(kuò)增反應(yīng)的正向和反向引物，其中 每對(duì)正向和反向引物中公用接頭彼此反向互補(bǔ)；2) 利用步驟1)中所述正向和反向引物，通過(guò)第一輪多核苷酸 擴(kuò)增反應(yīng)，分別擴(kuò)增目標(biāo)基因組區(qū)域，得到在各個(gè)目標(biāo)基因組區(qū)域5， 端和3，端加入權(quán)利要求1所述公用接頭的不同可連接性DNA片段；3)將步驟2)獲得的不同可連接性DM片段進(jìn)行等量地混合，作 為第二輪多核苷酸擴(kuò)增反應(yīng)的模板進(jìn)行邊擴(kuò)增邊連接反應(yīng)；得到由步 驟2)所得不同的可連接性DNA片段按隨機(jī)連接順序連接而成的長(zhǎng)鏈 腿。
4. 一種建立針對(duì)一個(gè)目標(biāo)基因組區(qū)域序列重測(cè)序隨機(jī)DNA文庫(kù) 的方法，包括步驟1) 針對(duì)一個(gè)目標(biāo)基因組區(qū)域，設(shè)計(jì)包含權(quán)利要求1所述公用接 頭的用于多核苷酸擴(kuò)增反應(yīng)的正向和反向引物，其中正向和反向引物 中公用接頭彼此反向互補(bǔ)；2) 利用步驟1)中所述正向和反向引物，通過(guò)第一輪多核苷酸 擴(kuò)增反應(yīng)，擴(kuò)增目標(biāo)基因組區(qū)域，得到在所述目標(biāo)基因組區(qū)域5，端 和3，端加入權(quán)利要求1所述公用接頭的可連接性DNA片段；3) 步驟2)獲得的可連接性DNA片段作為第二輪多核苷酸擴(kuò)增 反應(yīng)的模板進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)；得到由步驟2)所得可連接性DNA片段連 接而成的長(zhǎng)鏈DNA;4) 將步驟3)所得的長(zhǎng)鏈DNA用DNA隨機(jī)打斷法打斷，得到隨 機(jī)薩文庫(kù)。
5. —種建立針對(duì)兩個(gè)及兩個(gè)以上的多個(gè)目標(biāo)基因組區(qū)域重測(cè)序 隨機(jī)DNA文庫(kù)的方法，包括步驟1) 針對(duì)多個(gè)目標(biāo)基因組區(qū)域的每個(gè)區(qū)域，分別設(shè)計(jì)包含權(quán)利要 求1所述公用接頭的用于多核苷酸擴(kuò)增反應(yīng)的正向和反向引物，其中 每對(duì)正向和反向引物中公用接頭彼此反向互補(bǔ)；2) 利用步驟1)中所述正向和反向引物，通過(guò)第一輪多核苷酸 擴(kuò)增反應(yīng)，分別擴(kuò)增目標(biāo)基因組區(qū)域，得到在各個(gè)目標(biāo)基因組區(qū)域5， 端和3'端加入公用接頭的不同可連接性DNA片段；3) 將步驟2)獲得的不同可連接性DM片段進(jìn)行等量地混合， 作為第二輪多核苷酸擴(kuò)增反應(yīng)的模板進(jìn)行邊擴(kuò)增邊連接反應(yīng)；得到由步驟2)所得不同的可連接性DNA片段按隨機(jī)連接順序連接而成的長(zhǎng) 鏈DNA;4)將步驟3)所得的長(zhǎng)鏈DNA用DNA隨機(jī)打斷法打斷，得到隨 機(jī)DNA文庫(kù)。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的方法，其中步驟4)中打斷所得 長(zhǎng)鏈DNA序列的方法為包括超聲法、噴霧法、化學(xué)剪切法、酶剪切法 等在內(nèi)的DNA隨機(jī)打斷方法。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種針對(duì)一個(gè)或多個(gè)目標(biāo)基因組區(qū)域進(jìn)行邊擴(kuò)增邊連接的公用接頭設(shè)計(jì)方法。本發(fā)明又涉及一種針對(duì)一個(gè)或多個(gè)目標(biāo)基因組區(qū)域進(jìn)行邊擴(kuò)增邊連接的方法。本發(fā)明所述方法適用于針對(duì)任意長(zhǎng)度的目標(biāo)基因組區(qū)域的邊擴(kuò)增邊連接工作，所得到的非特異連接的長(zhǎng)鏈DNA可根據(jù)研究需要應(yīng)用于多種DNA分析平臺(tái)。本發(fā)明還涉及一種針對(duì)一個(gè)或多個(gè)目標(biāo)基因組區(qū)域序列重測(cè)序工作、建立隨機(jī)DNA文庫(kù)的方法，所得隨機(jī)DNA文庫(kù)可用于通過(guò)包括Sanger測(cè)序技術(shù)、邊合成邊測(cè)序技術(shù)在內(nèi)的測(cè)序方法對(duì)所述一個(gè)或多個(gè)目標(biāo)基因組區(qū)域序列進(jìn)行重測(cè)序。
文檔編號(hào)C12N15/09GK101265471SQ20071014362
公開(kāi)日2008年9月17日 申請(qǐng)日期2007年8月15日 優(yōu)先權(quán)日2007年4月29日
發(fā)明者張秀清, 楊煥明, 琳 林, 建 汪, 蘇夜陽(yáng) 申請(qǐng)人:北京華大基因研究中心