專利名稱：：一種木糖還原酶基因及其編碼的氨基酸序列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種還原酶基因及其編碼的氨基酸序列。
背景技術(shù)：
：木糖是木質(zhì)纖維素水解產(chǎn)物中含量?jī)H次于葡萄糖的一種單糖，天然半纖維素如木聚糖水解產(chǎn)物的85%90%是木糖。木糖經(jīng)木質(zhì)纖維素生物可以轉(zhuǎn)化產(chǎn)生乙醇，在自然界中由木糖轉(zhuǎn)化為乙醇的代謝途徑有兩條其中之一是木糖經(jīng)木糖還原酶(xylosereductase,XR)催化生成木糖醇(某些絲狀真菌中存在此種木糖還原酶)，再由木糖醇脫氫酶(xylitoldehydrogenase,XDH)作用生成木酮糖，木酮糖再經(jīng)木酮糖激酶(xylulokinase,XK)磷酸化生成5-磷酸木酮糖，進(jìn)而進(jìn)入磷酸戊糖途徑(pentosephosphatepathway,PPP，依次生成乙酰磷酸一乙酸一乙醛—乙醇)。由于目前所使用的木糖還原酶(XR)絕大多只能利用或偏向依賴于還原型輔酶II(NADPH)，導(dǎo)致還原型輔酶I(NADH)在工程菌宿主體內(nèi)大量積累，從而引起輔酶不平衡，致使工程菌生理活性降低，乙醇產(chǎn)量下降。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是為了解決目前所使用的木糖還原酶(XR)絕大多只能利用還原型輔酶II(NADPH)，導(dǎo)致還原型輔酶I(NADH)在工程菌宿主體內(nèi)大量積累，從而引起輔酶不平衡，致使工程菌生理活性降低，乙醇產(chǎn)量下降的問(wèn)題，而提供的一種木糖還原酶基因及其編碼的氨基酸序列。本發(fā)明木糖還原酶基因序列如SEQIDNO:l所示。本發(fā)明木糖還原酶基因序全長(zhǎng)1061bp，其中A、G、C、T分別為335bp(31.57%)、219bp(20.64%)、180bp(16.97%)、327bp(30.82%);62bp處有起始密碼子ATG，1013bp處有終止密碼子TAG，有954bp完整的開(kāi)放閱讀框。本發(fā)明上述木糖還原酶基因編碼的氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。本發(fā)明木糖還原酶基因編碼的氨基酸序列有317個(gè)氨基酸，氨基酸序列的分子量為35.95KD，等電點(diǎn)pi為5.93。本發(fā)明木糖還原酶基因是以O(shè)wc^apara/^7a^TotalRNA為模板，使用RACE(RapidAmplificationofcDNAEnds)技術(shù)獲得的一個(gè)具有表達(dá)功能的基因。通過(guò)GenBank序列比對(duì)分析，本發(fā)明木糖還原酶基因與已注冊(cè)Caw/Waa/Wcara的木糖還原酶基因(XM_715658)的最高同源性為80%。將本發(fā)明木糖還原酶基因克隆入工程菌宿主巴斯德畢赤酵母，并對(duì)經(jīng)過(guò)基因重組的工程菌進(jìn)行酶活分析，在以NADH為輔酶的實(shí)驗(yàn)條件下本發(fā)明木糖還原酶基因所生成的木糖還原酶與木糖底物反應(yīng)的酶活為3.25U，在以NADPH為輔酶的條件下本發(fā)明木糖還原酶基因所生成的木糖還原酶與木糖底物反應(yīng)的酶活為0.54U，試驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明本發(fā)明木糖還原酶基所產(chǎn)生的木糖還原酶可同時(shí)利用還原型輔酶II(NADPH)和還原型輔酶I(NADH)，具有雙輔酶依賴性，且NADH的依賴性遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于NADPH的依賴性。本發(fā)明擴(kuò)大木糖還原酶基因資源，為構(gòu)建高產(chǎn)燃料乙醇的釀酒酵母工程菌奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。圖i是具體實(shí)施方式四中提取的Cam/^^ara戸//0^TotalRNA凝膠電泳圖；圖2是具體實(shí)施方式四3②中aw^/a/7ara/w//a^cDNA凝膠電泳圖；圖3是具體實(shí)施方式四5④中PCR產(chǎn)物的凝膠電泳圖；圖4是具體實(shí)施方式四6③中PCR產(chǎn)物的凝膠電泳圖；圖5是根據(jù)木糖還原酶基因序列所構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)；圖6是重組載體的質(zhì)粒圖譜；圖7是具體實(shí)施方式四中二.3中陽(yáng)性克隆質(zhì)粒的酶切產(chǎn)物凝膠電泳圖；圖8是具體實(shí)施方式四中三.4中木糖還原酶蛋白考馬斯亮藍(lán)染色及脫色后的凝膠電泳圖；圖9是具體實(shí)施方式四中四.2中PVDF膜掃描圖。具體實(shí)施例方式具體實(shí)施方式一本實(shí)施方式木糖還原酶基因序列如下所示ATAGTAAATATAAAACGG。具體實(shí)施方式二本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式一的不同點(diǎn)是木糖還原酶基因序列62bp處有起始密碼子ATG，1013bp處有終止密碼子TAG。其它與實(shí)施方式一相同。具體實(shí)施方式三本實(shí)施方式木糖還原酶基因編碼的氨基酸序列如下所不,alThrAsnGluThrAlaAlaAspGlnlleTyrAsnAlalleLysValGlyTyrArgLeuPheAspGlyAlaGlnAspTyrGlyAsnGluLysGluValGlyGluGlylleAsnArgAlalleAspGluGlyLeuValSerArLeuAsnLysThrLeuSerAspLeuAsnLeuGluTyrLeuAspLeuPheLeuIleHisPheProIleAlsTyrGluAsnValProLeuLeuAspThrTrpArgAlaLeuGluSerLeuValGlnLysGlyLysIleArgSerlleGlylleSerAsnPheAsnGlyGlyLeuIleTyrAspLeuValArgGlyAlaLysIleLysProAlaValLeuGlnlleGluHisHisProTyrLeuGlnGlnProArgLeuIleGluPheValGlnSerGlnGAspThrProThrLeuPheAspHisGluThrlleLysSerileAlaSerLysHisLysLysSerSerAlaGlnValLeuLeuArgTrpAlaThrGlnArgGlylleAlaVallleProLysSerAsnAsnProAspArgLeAspLysGlyLeuArgPheAsnAspProTrpAspTrpAspHisIleProIlePheVal。本實(shí)施方式木糖還原酶基因編碼的氨基酸序的分子量為35.95KD，等電點(diǎn)PI為5.93。具體實(shí)施方式四本實(shí)施方式按以下步驟獲得木糖還原酶基因序列1、引物設(shè)計(jì)本實(shí)施方式以近平滑假絲酵母(還是近平滑念珠菌？大多數(shù)中文期刊都是翻譯成近平滑假絲酵母)Om^fa;ara戸//0^TotalRNA為模板，采用軟件PrimerPremier5.0設(shè)計(jì)3'RACE(RACE—RapidAmplificationofcDNAEnds)的上游簡(jiǎn)并引物XYL13sitesFl、下游引物XYL13sitesoligodT及接頭引物XYL13sitesAdaptor,引物序列如表1所示。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>2、Ow^(iaparapw7w^細(xì)胞培養(yǎng)及TotalRNA(總RNA)的提取將活化后的Ow^iaparapw7ow's(ACCC20221)細(xì)胞接種于含1%(質(zhì)量)D-木糖的液體YPD培養(yǎng)基中，在200r/min的條件下培養(yǎng)14小時(shí)，然后取lmL培養(yǎng)液離心、并收集沉淀加入lmLTrizol和0.2g直徑為0.2mm的玻璃珠，再置于漩渦振蕩器中高速振蕩2min，之后提取近平滑假絲酵母TotalRNA，提取步驟及參數(shù)參見(jiàn)上海生工生物工程有限公司Trizol使用說(shuō)明書。本實(shí)施方式Camfefo;ara;^7ow;s細(xì)胞活化采用常規(guī)細(xì)胞活化技術(shù)。本實(shí)施方式提取出的TotalRNA經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳，凝膠電泳結(jié)果如圖1所示，本實(shí)施方式電泳結(jié)果中未發(fā)現(xiàn)基因組DNA和蛋白質(zhì)污染，26S核糖體RNA與18S核糖體RNA的帶型清晰，無(wú)拖尾現(xiàn)象，兩條帶的亮度比基本上呈現(xiàn)2:1的關(guān)系，由此說(shuō)明本實(shí)施方式提取的Ca"^/apara/wz7a^TotalRNA完整性好。3、木糖還原酶基因3'端序列①以XYL13sitesoligodT為RT-PCR引物、l|iLOm^V/apflra;w7o;^TotalRNA為模板，并加入l|iLTaKaRa公司AMV反轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行RT-PCR。RT-PCR體系為20|iL，RT-PCR擴(kuò)增程序72。C加熱5min，然后立即放入冰中去除RNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)，再30。C10min，42。C30min，95。C5min;獲得cDNA。②取上述3①中l(wèi)pLcDNA作為模板、以XYL13sitesFl、XYL13sitesAdaptor為引物在50pL反應(yīng)體系中進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件如下；預(yù)變性94。C2min，94。C變性30sec、55。C退火30sec、72。C延伸30sec、循環(huán)30次，72。C延伸10min。取5pLPCR產(chǎn)物進(jìn)行1%的瓊脂糖凝膠電泳，凝膠電泳結(jié)果如圖2所示。③PCR產(chǎn)物克隆及測(cè)序上述3②中的PCR產(chǎn)物用TaKaRa公司的瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收、純化，回收、純化步驟參見(jiàn)試劑盒操作手冊(cè)。將純化的PCR產(chǎn)物與克隆載體pMD18-TVector連接(16'C環(huán)境中過(guò)夜)，并熱轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞T叩10中，取200jiL轉(zhuǎn)化液涂布到含有O.lmg/mLAmp(氮節(jié)青霉素)，0.024mg/mLIPTG，0.04mg/mLX-Gal的固體篩選平板上進(jìn)行篩選，并以M13-47、RV-M引物對(duì)平板上的白色菌落進(jìn)行菌落PCR篩選陽(yáng)性克隆，挑選陽(yáng)性克隆送交TaKaRa公司進(jìn)行序列測(cè)定。4、5'RACE引物設(shè)計(jì)設(shè)計(jì)5，RACE引物XYL15sitesP1、XYL15sitesF1、XYL15sitesRl、XYL15sitesF2和XYL15sitesR2，引物序列如表2所示。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>本實(shí)施方式引物XYL15sitesPl的5'有磷酸化修飾。5、木糖還原酶基因5'端序列①以XYL15sitesPl為RT-PCR引物、Ow^Vfapara/wZ/ow's的TotalRNA為模板，并加入l|iLTaKaRa公司AMV反轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。反轉(zhuǎn)-PCR體系為20pL，反轉(zhuǎn)-PCR擴(kuò)增程序72。C加熱5min，然后立即放入冰中去除RNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)，再30。C10min，42°C30min，95°C5min;獲得cDNA。②HybridRNA的分解向上述5①獲得的cDNA中加入5pL的RNaseH，并在3(TC條件下反應(yīng)lhour，然后加入滅菌水定容至100pL，再加入500^iL濃度為100%的乙醇放置于-80。C環(huán)境中15min，之后取出在4。C、12000r/min條件下離心10min，離心沉淀經(jīng)濃度為70%的乙醇清洗后離心回收，并干燥處理獲得單鏈的cDNA。(D單鏈cDNA環(huán)化在上述5②獲得的單鏈cDNA中加入20pLRNA連接緩沖液和20^iL濃度為40%的PEG#6000，混合均勻后再加入lpLT4RNA連接酶，在16。C條件下反應(yīng)812h。本實(shí)施方式RNA連接緩沖液購(gòu)自于TaKaRa公司。以上述1(iL5③反應(yīng)物為模板、以XYL15sitesFl、XYL15sitesRl為引物進(jìn)行第一次PCR(PCR反應(yīng)體系為20pL，PCR反應(yīng)條件如下預(yù)變性94。C2min，94。C變性30sec、55。C退火30sec、72。C延伸30sec、循環(huán)30次，最后72。C延伸10min);然后取lpL第一次PCR產(chǎn)物作為模板、以XYL15sitesF2、XYL15sitesR2為引物進(jìn)行巢式PCR(PCR反應(yīng)體系為20pL，PCR反應(yīng)條件如下預(yù)變性94。C2min，9(C變性30sec、55。C退火30sec、72。C延伸30sec、循環(huán)30次，最后72。C延伸10min);取5pLPCR產(chǎn)物進(jìn)行1%的瓊脂糖凝膠電泳，凝膠電泳結(jié)果如圖3所示。本實(shí)施方式可獲得更加特異和豐富的目的基因?！騊CR產(chǎn)物克隆及測(cè)序上述5④中的PCR產(chǎn)物用TaKaRa公司的瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收、純化，回收、純化步驟參見(jiàn)試劑盒操作手冊(cè)。將純化的PCR產(chǎn)物與克隆載體pMD18-TVector連接(16。C環(huán)境中過(guò)夜)，并熱轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞T叩IO中，取200|iL轉(zhuǎn)化液涂布到含有O.lmg/mLAmp(氨節(jié)青霉素)，0.024mg/mLIPTG，0.04mg/mLX-Gal的固體篩選平板上進(jìn)行篩選，并以M13-47、RV-M引物對(duì)平板上的白色菌落進(jìn)行菌落PCR篩選陽(yáng)性克隆，挑選陽(yáng)性克隆送交TaKaRa公司進(jìn)行序列測(cè)定。6、基因全序列的獲得及克?、倩蛉蛄幸镌O(shè)計(jì)獲得的木糖還原酶基因的3'端序列和5'端序列有一段相同的重復(fù)序列，使用Sequencher4.2軟件將兩段序列進(jìn)行拼接，獲得木糖還原酶基因的全長(zhǎng)cDNA序列，并設(shè)計(jì)木糖還原酶基因全長(zhǎng)cDNA序列引物XYL1Fl和XYL1Rl，引物序列如表3所示；而且在引物XYL1Fl上引入&oRI限制性酶切位點(diǎn)(劃線部分)，在引物XYL1Rl上引入齒n限制性酶切位點(diǎn)(劃線部分)，并分別加入保護(hù)堿基。表3XYL1Fl5'-GGAATTCATGAGCATTAAGTTAAATTC-3'XYL1Rl5'-ATAGTTTAGCGGCCGCGACAAAGATTGGAATGTGATC-3'②以Ca"c/Wfl;^ra戸Z/a^TotalRNA為模板，XYL1Rl為RT-PCR引物，并加入lpLTaKaRa公司AMV反轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行RT-PCR。RT-PCR體系為20pL，RT-PCR擴(kuò)增程序72'C加熱5min，然后立即放入冰中去除RNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)，再30。C10min，42。C30min，95。C5min;獲得cDNA。③取上述6②中l(wèi)pLcDNA作為模板，以XYL1Fl、XYL1Rl為引物在50pL反應(yīng)體系中進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件如下預(yù)變性94。C2min，94。C變性30sec、55。C退火30sec、72。C延伸30sec、循環(huán)30次，72。C延伸10min。取5pLPCR產(chǎn)物進(jìn)行1%的瓊脂糖凝膠電泳，凝膠電泳結(jié)果如圖4所示。④PCR產(chǎn)物克隆及測(cè)序上述6③中的PCR產(chǎn)物用TaKaRa公司的瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收、純化，回收、純化步驟參見(jiàn)試劑盒操作手冊(cè)。將純化的PCR產(chǎn)物與克隆載體pMD18-TVector連接(16。C環(huán)境中過(guò)夜)，并熱轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞Top10中，取200mL轉(zhuǎn)化液涂布到含有0.1mg/mLAmp(氨節(jié)青霉素)，0.024mg/mLIPTG，0.04mg/mLX-Gal的固體篩選平板上進(jìn)行篩選，并以M13-47、RV-M引物對(duì)平板上的白色菌落進(jìn)行菌落PCR篩選陽(yáng)性克隆，挑選陽(yáng)性克隆送交TaKaRa公司進(jìn)行序列測(cè)定，獲得全長(zhǎng)的木糖還原酶基因，如SEQIDNO:1所示。本實(shí)施方式對(duì)所獲得的木糖還原酶基因進(jìn)行比較分析和實(shí)驗(yàn)一、DNA序列比較分析和系統(tǒng)樹(shù)構(gòu)建將本實(shí)施方式獲得的木糖還原酶基因序列在GenBank核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行同源序列搜索(BLASTsearch),以比較本實(shí)施方式獲得的木糖還原酶基因與己知酵母菌相應(yīng)序列的相似程度。用MEGA3.1軟件搜索結(jié)果進(jìn)行匹配排列(align),然后用Neighbor-Joining分析方法進(jìn)行分子系統(tǒng)學(xué)分析，并進(jìn)行1000次bootstrap統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)，并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，如圖5所示。從進(jìn)化關(guān)系看，本實(shí)施方式獲得的木糖還原酶基因與Ow^Wafl/Wcara的醛糖還原酶(aldosereductaseXM715658)親緣關(guān)系最近，在進(jìn)化樹(shù)的同一分枝上，與唯一己知的近平滑假絲酵母木糖還原酶基因^T丄7(AY193716)在不同的分支上，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，因此說(shuō)明本實(shí)施方式是一條新的木糖還原酶基因。二、選取巴斯德畢赤酵母表達(dá)載體pGAPZaA的&oRI、7VwI兩個(gè)限制性酶切位點(diǎn)將本實(shí)施方式獲得的木糖還原酶基因克隆到表達(dá)載體的a信號(hào)肽下，構(gòu)建木糖還原酶的分泌表達(dá)載體，重組載體的質(zhì)粒圖譜如圖6所示。二.l限制性酶切反應(yīng)a)載體雙酶切按表4比例配置50pL酶切限制性雙酶切體系表4<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>37°。進(jìn)行過(guò)夜酶切，反應(yīng)結(jié)束后加入5piL6xLoadingBuffer,進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳并使用TaKaRa公司凝膠回收試劑盒進(jìn)行切膠回收。(2)插入片段雙酶切按表5比例配置50piL酶切限制性雙酶切體系表5<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>淑I10xHBuffer5nL重蒸餾水upto50|jL37"酶切兩小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束后加入5^L6xLoadingBuffer,進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳并使用TaKaRa公司凝膠回收試劑盒進(jìn)行切膠回收。二.2片段與載體連接在lOjiL連接反應(yīng)體系中加入lpLpGAPZaA-五coRI/M/1作為載體，3^LpMD18-T-xyll-2-￡coRI/M^I為連接片段，加入無(wú)菌水ljxL，Ligationsolution5|iL,低溫水浴中16'C連接4h。二.3大腸桿菌轉(zhuǎn)化與陽(yáng)性克隆篩選Zeocin抗生素在高鹽和低PH條件下對(duì)大腸桿菌的毒性較低難以起到篩選的作用，因此大腸桿菌轉(zhuǎn)化與陽(yáng)性克隆的篩選均在LLB平板上進(jìn)行，使用XYLlFl和XYLlRl兩條引物進(jìn)行陽(yáng)性克隆篩選。提取陽(yáng)性克隆質(zhì)粒后按表6中的體系進(jìn)行雙酶切鑒定表6pGAPZaA-xyll五coRIluL淑IluL10xHBuffer2pL重蒸餾水upto20|oL37'C酶切1小時(shí)，取15(aL酶切產(chǎn)物進(jìn)行進(jìn)行1%的瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖7所示。二.4巴斯德畢赤酵母轉(zhuǎn)化(l)重組質(zhì)粒線形化轉(zhuǎn)化時(shí)將環(huán)狀載體DNA切成線狀，有助于攜帶本實(shí)施方式木糖還原酶基因的載體高效的與基因組染色體進(jìn)行同源重組，使將整個(gè)載體連同外源基因(木糖還原酶基因)整合進(jìn)入宿主染色體，達(dá)到外源基因隨細(xì)胞染色體一起復(fù)制，穩(wěn)定的存在于重組菌中的目的。本實(shí)施方式選取pGAPZaA載體pGAP啟動(dòng)子上的祝"I酶切位點(diǎn)，轉(zhuǎn)入畢赤酵母GS115后木糖還原酶基因?qū)⒄显诨蚪M的pGAP啟動(dòng)子上。重組質(zhì)粒線形化酶切體系如表7所示表7<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>37。C進(jìn)行過(guò)夜酶切，反應(yīng)結(jié)束后加入IO^iL的3MNaOAC(pH值為5.2)，然后加入25(HiL的冰預(yù)冷的無(wú)水乙醇，在-2(TC的環(huán)境中放置3060分鐘，再離心回收沉淀物，并用濃度為70%的冰預(yù)冷的乙醇洗滌沉淀物，真空干燥后加入IO^iL滅菌水溶解DNA。(2)畢赤酵母轉(zhuǎn)化I、將80pL電轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞和520昭線性(用說(shuō)"I酶切成線性)的DNA(DNA溶于5~10|iLTEBuffer中)放入0°C、長(zhǎng)度為0.2cm的電擊槽中。II、將電擊槽置于冰上5min。III、將電擊槽裝入預(yù)冷的沖擊槽中調(diào)整電壓至2.5KV電流脈沖。IV、立即加入lmL預(yù)冷的1M山梨醇，然后將電擊槽中的細(xì)胞液轉(zhuǎn)移至無(wú)菌的15mL轉(zhuǎn)化管中。V、轉(zhuǎn)化管在30。C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12hours(轉(zhuǎn)化管不搖動(dòng))。VI、取200~600pL轉(zhuǎn)化液涂于YPD-Zeocin平板(YPD-Zeocin平板包含100|ig/mLZeocin)。VII、將平板置于3(TC培養(yǎng)箱中培養(yǎng)直至單菌落出現(xiàn)。(培養(yǎng)23天單菌落出現(xiàn))(3)畢赤酵母陽(yáng)性克隆篩選由于酵母的細(xì)胞壁較厚，不能采用常規(guī)大腸桿菌陽(yáng)性克隆的菌落PCR篩選方法，必須將細(xì)胞的基因組DNA釋放出來(lái)。從YPD~Zeocin平板上挑取5個(gè)菌落放于5mL液體YPD培養(yǎng)基中在3CTC、200r/min的條件下培養(yǎng)812h，取lmL培養(yǎng)液進(jìn)行離心收集沉淀物，用北京天根生公司酵母基因組提取試劑盒進(jìn)行基因組DNA的提取，然后分別取lpL做為模板，以XYL1Fl和XYL1Rl為引物進(jìn)行PCR鑒定。三、菌體的培養(yǎng)及重組蛋白表達(dá)三.l菌體培養(yǎng)挑取陽(yáng)性克隆畢赤酵母菌落放入2mL液體YPD培養(yǎng)基中在3(TC、200r/min的條件下培養(yǎng)S12h，作為種子液。取種子培養(yǎng)液lOOpL加入10mL液體YPD培養(yǎng)基中在30。C、200r/min的條件下培養(yǎng)8~12h，然后在5000r/min的條件下離心lOmin收集沉淀物，取10mL新鮮液體YPD培養(yǎng)基重懸沉淀物，置于30°C、200r/min的條件下培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)、96小時(shí)和120小時(shí)取離心后上清液分析(每次取2mL的培養(yǎng)液，在12000r/min的條件下離心lOmin并收集上清液分析)。三.2蛋白質(zhì)沉淀在上步收集的上清液中加入100%的TCA(三氯醋酸)溶液，使TCA終濃度為10%~20%，并且在冰浴中沉淀30分鐘，然后以12000r/min離心IO分鐘去除上清液，向沉淀中加入500)iL丙酮洗去殘留的TCA，再冰浴30分鐘，之后以12000r/min離心10分鐘去除上清液，將沉淀置于室溫條件下30分鐘使丙酮揮發(fā)干凈，再加入20nL的PBS緩沖液溶解蛋白。三.3SDS-PAGE電泳取10pL上述的溶解蛋白的PBS緩沖液再加入lO)iL2xSDS-PAGE上樣緩沖液，置于99'C的環(huán)境中加熱10分鐘使蛋白變性，然后全量上樣于濃度為10%的SDS-PAGE凝膠，以20mA恒流進(jìn)行電泳，待溴酚蘭指示帶離膠板底部約lcm處停止電泳。三.4考馬斯亮藍(lán)染色及脫色使用考馬斯亮藍(lán)染色方法進(jìn)行蛋白質(zhì)染色，然后用去離子水沖洗凝膠一遍，再加入200mL的考馬斯亮藍(lán)R-250染色液，在搖床中緩慢搖動(dòng)1小時(shí)；然后倒凈染色液并用水清洗一次，加入300mL的脫色液搖床中緩慢搖動(dòng)30分鐘，更換脫色液重復(fù)脫色兩次。掃描脫色后的凝膠，如圖8所示。四、重組蛋白的Western印跡本實(shí)施方式重組木糖還原酶末端融合表達(dá)有6個(gè)His標(biāo)簽，可以與一抗His-TaqMab有效的結(jié)合，然后與二抗Anti-MouseIgG結(jié)合，二抗催化5-溴-4-氯-3-吲跺磷酸/氮藍(lán)四唑(BCIP/NBT)在原位轉(zhuǎn)變?yōu)樯钏{(lán)色化合物顯色，檢測(cè)重組蛋白的表達(dá)水平。四.l半干式轉(zhuǎn)移I、凝膠處理，電泳結(jié)束后切割膠條并轉(zhuǎn)膜緩沖液平衡，5minx3次。II、膜處理，將與膠條大小相同的PVDF膜放入甲醇中浸泡15min，然后將膜及裁好的濾紙條浸入轉(zhuǎn)膜緩沖液中15min。III、轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜裝置從下至上依次按陽(yáng)極板、濾紙、PVDF膜、凝膠、濾紙、陰極板，其中濾紙、凝膠、PVDF膜精確對(duì)齊，每一步必須去除氣泡。轉(zhuǎn)膜電流為恒電流lmA/cm2，轉(zhuǎn)移1.5h。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后將膜取出進(jìn)行免疫印跡檢測(cè)。四.2免疫反應(yīng)I、轉(zhuǎn)移后的PVDF膜用去離子水清洗一次，再加入10mL的封閉液緩沖液室溫緩慢搖動(dòng)30min。II、加入lOmL的洗膜緩沖液清洗PVDF膜，5minx3次。III、加入10mL的封閉液，再加入lpL的一抗His-TaqMab振蕩lh，使一抗與木糖還原酶蛋白的組氨酸標(biāo)簽發(fā)生免疫反應(yīng)結(jié)合。IV、加入10mL的洗膜緩沖液清洗，5minx3次。V、加入10mL的封閉液，再加入2pL的二抗Anti-MouseIgG振蕩lh，使二抗與一抗充分結(jié)合。VI、加入10mL的洗膜緩沖液清洗，5minx3次。VH、超純水清洗一次，再加入lmL1.5mLBCIP/NBT和5mL超純水，避光輕搖，逐漸顯色，顯色后膜用超純水洗滌2次，避光自然陰干，再進(jìn)行掃描，掃描圖像如圖9所示。五、木糖還原酶活性的測(cè)定五.l酶液的制備將重組酵母pGAPZaA-xyl1-2-2于液體YPD培養(yǎng)基中在30°C、200r/min的條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)第四天將發(fā)酵產(chǎn)物在12000r/min的條件下離心，取上清液作為粗酶液。五.2蛋白質(zhì)含量測(cè)定采用上海華舜生物工程公司的BCA蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒進(jìn)行蛋白質(zhì)測(cè)定，發(fā)酵液中蛋白質(zhì)含量經(jīng)測(cè)定為1pg/mL。五.3NADH依賴性的測(cè)定木糖還原酶(XR)的酶活測(cè)定，參照Walfridsson等的方法，以lmL反應(yīng)液0.1mol/LpH7.0磷酸鈉緩沖液，0.2mol/L木糖，0.15mol/LNADH及500^iL的酶液，在3(TC條件下使用分光光度計(jì)在340nm下檢測(cè)NADH被氧化的量。木糖還原酶的比活力定義為每mg木糖還原酶蛋白每分鐘轉(zhuǎn)化NADH的^imo1數(shù)。木糖作為底物時(shí)以NADH為輔酶木糖還原酶比活力為3.25U。五.4NADPH依賴性的測(cè)定木糖還原酶(XR)的酶活測(cè)定，參照Walfridsson等的方法，以lmL反應(yīng)液0.1mol/LpH7.0磷酸鈉緩沖液，0.2mol/L木糖，0.15mol/LNADPH及500pL的酶液，在30。C條件下使用分光光度計(jì)在340nm下檢測(cè)NADPH被氧化的量。木糖還原酶的比活力定義為每mg木糖還原酶蛋白每分鐘轉(zhuǎn)化NADPH的pmol數(shù)。木糖作為底物時(shí)以NADPH為輔酶木糖還原酶活力為0.54U。從輔酶依賴性結(jié)果可以看出，本文重組表達(dá)的木糖還原酶具有雙輔酶依賴性，且NADH的依賴性明顯高于NADPH的依賴性，可以用于解決木糖代謝工程菌中輔酶不平衡的問(wèn)題，在進(jìn)一步的研究中將對(duì)燃料乙醇生產(chǎn)的木糖代謝工程菌的構(gòu)建具有重要價(jià)值。序列表<110>哈爾濱工業(yè)大學(xué)<120>—種木糖還原酶基因及其編碼的氨基酸序列<160>12<210>1<211>1061<212>DNA<213>近平滑假絲酵母(Ow(i/c/a/7arapw7a^)<220><221>CDS<222>(62)…(1015)〈400>1acgatttagtacgcggtgccaaattcgcacacagcgcaactacactactactactcccat60tatgagcattaagttaaatteaggacacgaaatgccaattgttggcttt109MetSerlieLysLeuAsnSerGlyHisGluMetProlieValGlyPhe151015ggatgttggaaagtcaccaacgagactgetgccgaccaaatetacaat157GlyCysTrpLysValThrAsnGluThrAlaAlaAspGinlieTyrAsn202530gcaattaaagttggctac卿ttattcgatggtgetcaagattacggc205AlalieLysValGlyTyrArgLeuPheAspGlyAlaGinAspTyrGly354045aatgaaaaagaagttggtgaagga_ateaatcgtgetattgatgaagga253AsnGluLysGluValGlyGluGlylieAsnArgAlalieAspGluGly505560cttgttteacgtgatgaattatttgttgtatec認(rèn)Uatgg獄aac301UuValSerArgAspGluLeuPheValValSerLysLeuTrpAsnAsn65taccatTyrHisgatAspgatttgaatAspLeuAsngcattcAlaPhetgtggtCysGly130acttggThrTrp145attggtlieGlyLys115gatAsp卿ArgElttlieLeuGinGin195ggtGlycctProttgLeu100tttPheLys85gagGlugtcVal70AsntatTyrcccProggtgataaaGlyAspLysggtgccaagGlyAlaLysgetAlatecSerElttlie180ccaProttgLeueiatAsn165aaaLys卿ArgateactlieThr210agtaaaaagSerLysLys225aagtecattgettecgcaAlattgLeugttg333CtValGluThrGlu150ttcPhecctProttgLeucttLeuattlietttPhe135tecSergatAspg犯Glu120catHisttgLeuttaLeu105gagGlutatTyrgtgValaatggtgggAsnGlyGlytattctteaTyrSerSergetAlaattlietUPhe215aca_ThrgttValg肪Glu200ggaGlyttgLeu185UtPhecctProgcaAla90ttcPheaaaLysga^Gluc犯GinttgLeu170c犯Gin75ttaLeuttgLeutatTyr幼tAsn卿Lys1553ttlieliegttcaaValGincaateaGinSer80aacaagaccttgtct349AsnLysThrLeuSer95attcatttccccatt397lieHisPheProlie110ccacctggattttac445ProProGlyPheTyr125gttcctttgttggat493ValProLeuLeuAsp140ggaaaaateagatec541GlyLyslieArgSer160ttagtacgc589LeuValArg175catccatac637HisProTyr190ggaattgcc685GlylieAlagaattgga已733GluLeuGlugatacacc已a(bǔ)ctAspThrProThr230estsag犯attgLeutea18UtPhe235ctgtacgatTyrAspg犯C3CGluHistctcaaSerGin205tttttgPheLeu220gatcatAspHisgaaactate781GluThrlie240getcaagtgttgtta829LysSerlieAlaSerLysHisLysLysSerSerAlaGinVal245250caaagaggtattgccgtgGinArgGlylieAlaVal卿tggArgTrpgetAlacctgatProAsp犯agagLysGlu290aatgacAsnAsp305cgtArg275gatAspcctProactThr260ttgLeuttgLeutggTrpgcgAlagsgGlugatAspc朋GingcaAlatggTrp31033CAsnatelie295AspttgLeu280朋cAsnC8CHisgccAla265AsnaagLysattlieattlieccaaaaProLysgttValttgLeuccaProagtSergatAspatelie315teaSer270gagGluLeu255Asnteuaat877Asngatttcgagttgagt925AspPheGluLeuSer285gggLysGly300tttgtctagaggag1020PheValttgaggttt973LeuArgPhegagectatagtggttaaatagaaatagtaaatataaaacgg1061<210>2<211>317<212>PRT<213>近平滑假絲酵母(Omc^apara/^/a^)〈400〉2MetSerlieLysLeuAsnSerGlyHisGluMetProlieValGlyPhe151015GlyCysTrpLysValThrAsnGluThrAlaAlaA印GinlieTyrAsn202530AlalieLysValGlyTyrArgUuPheAspGlyAlaGinAspTyrGly354045AsnGluLysGluValGlyGluGlylieAsnArgAlalieAspGluGly505560LeuValSerArgAspGluLeuPheValValSerLysLeuTrpAsnAsn65707580TyrHisAspLeuAlaPheCysGly130ThrTrp145lieGlyAspProLysAsnValGluThrAlaLeuAsnLysThrLeuSer859095AsnLys115AspLeuGinlieThr210SerLys225LysSerArgTrpProAspLysGlu290AsnAsp305<210>3Gin195GlyLeu100PheGluTyrLeuAspValProlieGlyAspLysArgAlaLeulieSerGlyAlaLyslie180ProAsn165LysGlu150PhePhe135SerGlu120HisLeu105GluPheLeulieHisLysTyrProTyrGluAsnLeuValGinAsnGlyGlyProAlaValArgLeulieTyrSerSerLysAlaLeulieAlaAlaArg275AspThr260LeuSer245GinAsp230LysPhe215ThrGlu200GlyLeu185PheLeu170GinHisLysLysArgGlylieAlaGinAsnLeuGluAlaProTrpAspTrp310lie295AspLeu280AsnAla265AsnSer250ValLys155lieVal140GlyPro125ProlieGluHisValGinSerProGinSerProThrLeuPhe235SerPhe220AspGin205LeulieProLysValSerAspLysLeuAspHislieProlie315Lys300PhePhe110GlyLysTyrAspLeuHis190GlyAlaGinValPhe285GlyValSer270GluProliePheTyrLeuLeuAsplieArgVal175ProSer160TyrlieAlaGluLeuGluHisGluThrLeu255Asnlie240LeuAsnLeuSerLeuArgPhe<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)Ca"^/"/ara戸//0^TotalRNA設(shè)計(jì)的3'RACE的上游簡(jiǎn)并引物XYL13sitesFl。<220><221>misc—feature<222>(3,12,21)<223>r=g或a，w=a或t，y=t或c<400>3aaractttgtcwgatttgaayttgg25<210>4<211>40<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)Cam/Wa;ara;w//cw"Total脂A設(shè)計(jì)的3'RACE的下游引物XYL13sitesoligodT。<400>4gagcggataacaatttcacacaggtttttttttttttttt40<210>5<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)Om必iapara/w'/ow'sTotalRNA設(shè)計(jì)的3'RACE的接頭引物XYLl3sitesAdaptor。<400>5gagcggataacaatttcacacagg24<210>6<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)C朋fife/aTotalRNA設(shè)計(jì)的5'RACE引物XYLl5sitesPI。<400>6tggcaccgcgtactaaatcgt21<210>7<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)Omc^cfapara/wz7cw/sTotalRNA設(shè)計(jì)的5，RACE引物XYLl5sitesFl。<400>7tgttggatacttgg卿gc19<210>8<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)C朋cMa戸ra;w70^TotalRNA設(shè)計(jì)的5'RACE引物XYLl5sitesRl。<400>8atttatcaccatcaccacagt21<210>9<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)am力V/a/7arapw7a^TotalRNA設(shè)計(jì)的5'RACE引物XYLl5sitesF2。<400>9gggaaaaatcagatccat18<210>10<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)OmoWa/araps"o;^TotalRNA設(shè)計(jì)的5，RACE引物XYLl5sitesR2。<400>10tgcaatggggaaatgaatcaag22<210>11<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)木糖還原酶基因全長(zhǎng)cDNA序列設(shè)計(jì)的全長(zhǎng)cDNA序列引物XYL1Fl。<400>11ggaattcatgagcattaagttaaattc27<210>12<211>37<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)木糖還原酶基因全長(zhǎng)cDNA序列設(shè)計(jì)的全長(zhǎng)cDNA序列引物XYL1Rl。<400>12atagtttagcggccgcgacaa卿ttggaatgtgatc3權(quán)利要求1、一種木糖還原酶基因，其特征在于木糖還原酶基因序列如下所示ACGATTTAGTACGCGGTGCCAAATTCGCACACAGCGCAACTACACTACTACTACTCCCATTATGAGCATTAAGTTAAATTCAGGACACGAAATGCCAATTGTTGGCTTTGGATGTTGGAAAGTCACCAACGAGACTGCTGCCGACCAAATCTACAATGCAATTAAAGTTGGCTACAGATTATTCGATGGTGCTCAAGATTACGGCAATGAAAAAGAAGTTGGTGAAGGAATCAATCGTGCTATTGATGAAGGACTTGTTTCACGTGATGAATTATTTGTTGTATCCAAATTATGGAACAACTACCATGATCCTAAAAATGTTGAAACTGCATTAAACAAGACCTTGTCTGATTTGAATTTGGAGTATCTTGATTTATTCTTGATTCATTTCCCCATTGCATTCAAATTTGTCCCCATTGAAGAGAAATATCCACCTGGATTTTACTGTGGTGATGGTGATAAATTTCATTATGAAAATGTTCCTTTGTTGGATACTTGGAGAGCTTTGGAATCCTTGGTGCAAAAGGGAAAAATCAGATCCATTGGTATTTCCAATTTCAATGGTGGGTTGATTTACGATTTAGTACGCGGTGCCAAGATTAAACCTGCTGTTTTGCAAATTGAACACCATCCATACTTACAACAACCAAGATTGATTGAATTTGTTCAATCTCAAGGAATTGCCATCACTGGTTATTCTTCATTTGGACCTCAATCATTTTTGGAATTGGAAAGTAAAAAGGCATTGGATACACCAACTTTGTTTGATCATGAAACTATCAAGTCCATTGCTTCCAAACATAAGAAATCACTGGCTCAAGTGTTGTTAAGATGGGCTACTCAAAGAGGTATTGCCGTGATTCCAAAATCAAACAATCCTGATCGTTTGGCGCAAAACTTGAATGTTAGTGATTTCGAGTTGAGTAAAGAGGATTTGGAGGCAATCAACAAGTTGGATAAAGGGTTGAGGTTTAATGACCCTTGGGATTGGGATCACATTCCAATCTTTGTCTAGAGGAGGAGCCTATAGTGGTTAAATAGAAATAGTAAATATAAAACGG。2、根據(jù)權(quán)利要求l所述的一種木糖還原酶基因，其特征在于木糖還原酶基因序列62bp處有起始密碼子ATG，1013bp處有終止密碼子TAG。3、如權(quán)利要求1所述的木糖還原酶基因編碼的氨基酸序列，其特征在于木糖還原酶基因編碼的氨基酸序列如下所示MetSerlleLysLeuAsnSerGlyHisGluMetProIleValGlyPheGlyCysTrpLysValThrAsnGluThrAlaAlaAspGlnlleTyrAsnAlalleLysValGlyTyrArgLeuPheAspGlyAlaGlnAspTyrGlyAsnGluLysGluValGlyGluGlylleAsnArgAlalleAspGluGlyLeuValSerArgAspGluLeuPheValValSerLysLeuTrpAsnAsnTyrHisAspProLysAsnValGluThrAlaLeuAsnLysThrLeuSerAspLeuAsnLeuGluTyrLeuAspLeuPheLeuIleHisPheProIleAlaPheLysPheValProIleGluGluLysTyrProProGlyPheTyrCysGlyAspGlyAspLysPheHisTyrGluAsnValProLeuLeuAspThrTrpArgAlaLeuGluSerLeuValGlnLysGlyLysIleArgSerlleGlylleSerAsnPheAsnGlyGlyLeuIleTyrAspLeuValArgGlyAlaLysIleLysProAlaValLeuGlnlleGluHisHisProTyrLeuGlnGlnProArgLeuIleGluPheValGlnSerGlnGlyllalLeuLeuArgTrpAlaThrGlnArgGlylleAlaVallleProLysSerAsnAsnProAspArgLeuApLysGlyLeuArgPheAsnAspProTrpAspTrpAspHisIleProIlePheVal。4、根據(jù)權(quán)利要求3所述的木糖還原酶基因編碼的氨基酸序列，其特征在于氨基酸序列的分子量為35.95KD，等電點(diǎn)PI為5.93。全文摘要一種木糖還原酶基因及其編碼的氨基酸序列，它涉及一種還原酶基因及其編碼的氨基酸序列。它解決了目前所使用的XR絕大多只能利用或偏向依賴于NADPH，導(dǎo)致NADH在工程菌宿主體內(nèi)大量積累，從而引起輔酶不平衡，致使工程菌生理活性降低，乙醇產(chǎn)量下降的問(wèn)題。本發(fā)明木糖還原酶基因序全長(zhǎng)1061bp，其中A、G、C、T分別為335bp、219bp、180bp、327bp，有954bp完整的開(kāi)放閱讀框。本發(fā)明木糖還原酶基因編碼的氨基酸序列有317個(gè)氨基酸，氨基酸序列的分子量為35.95KD，等電點(diǎn)PI為5.93。本發(fā)明木糖還原酶基所產(chǎn)生的木糖還原酶可同時(shí)利用NADPH和NADH，具有雙輔酶依賴性。文檔編號(hào)C12N15/53GK101173291SQ200710144440公開(kāi)日2008年5月7日申請(qǐng)日期2007年10月15日優(yōu)先權(quán)日2007年10月15日發(fā)明者馮玉杰,曲有鵬,李冬梅申請(qǐng)人:哈爾濱工業(yè)大學(xué)