專利名稱：：一種白內(nèi)障基因檢測試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種基因檢測試劑盒。
背景技術(shù)：
：白內(nèi)障指人眼晶體的混濁，是世界范圍致盲的最常見的原因，至少2千5百萬盲人和1億1千萬視力障礙是因?yàn)榘變?nèi)障引起的。盡管通過手術(shù)可以使白內(nèi)障患者重見光明，但由于白內(nèi)障數(shù)量眾多，目前僅依靠外科手術(shù)是難以解決的。盡管現(xiàn)已證明環(huán)境因素對老年性白內(nèi)障有一定的影響，但導(dǎo)致白內(nèi)障發(fā)生的主要因素仍然是遺傳和基因突變(由于環(huán)境污染嚴(yán)重，因此基因突變的概率也大幅提高)；而目前撿測病人是否患有白內(nèi)障的常規(guī)手段主要采用視力檢査、眼部裂隙燈顯微鏡檢查和散瞳眼底檢查，只能在患者眼部出現(xiàn)病變后作出診斷，延誤了治療的時(shí)機(jī)，尤其是先天性白內(nèi)障患者的治療(先天性白內(nèi)障兒童，約占世界兒童盲的1/10)。晶狀體中90%的蛋白質(zhì)是水溶性的晶體蛋白，晶體蛋白又分為a、(3、Y晶體蛋白。晶體蛋白是非常穩(wěn)定的蛋白質(zhì)，對維持晶體透明性起重要作用，因此晶體蛋白的變性是導(dǎo)致白內(nèi)障的根本原因。雖然始于20世紀(jì)90年代的"人類基因組計(jì)劃"已經(jīng)獲得成功，經(jīng)過研究人員的努力許多白內(nèi)障致病基因己經(jīng)被定位；但是因?yàn)閷δ芤鹁w蛋白變性的致病基因、調(diào)控基因和致病機(jī)理等'相對知之甚少(白內(nèi)障臨床表型多樣，分類繁多，如前極白內(nèi)障、后極性白內(nèi)障、核性白內(nèi)障、板層白內(nèi)障、粉塵狀白內(nèi)障、皮刺狀白內(nèi)障、藍(lán)點(diǎn)狀白內(nèi)障、全白內(nèi)障、皮質(zhì)性白內(nèi)障、多態(tài)性白內(nèi)障和縫合狀白內(nèi)障等)，所以目前采用基因檢測白內(nèi)障的漏檢率高。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是為了解決目前白內(nèi)障常規(guī)檢測手段只能在白內(nèi)障發(fā)病后作出診斷，延誤治療時(shí)機(jī)以及目前的白內(nèi)障基因檢測漏檢率高的缺陷，而提供的一種白內(nèi)障基因檢測試劑盒。本發(fā)明白內(nèi)障基因檢測試劑盒主要由白內(nèi)障PCR擴(kuò)增檢測試劑和PCR產(chǎn)物純化試劑組成；白內(nèi)障PCR擴(kuò)增檢測試劑由10.0pL雙蒸餾水、5.0』5xQsolution、3.0pL25mMMgCl2、2.5(iL10xbuffer、2.5|iL2mMdNTP、0.4|iL20pM雙向特異性引物和0.2pLTaq酶組成；其中正向特異性引物序列為CATGCCACAACCTACCAAGTT，反向特異性引物序列為TGACAAGGAGCATTTAAAGGTG;PCR產(chǎn)物純化試劑由北極蝦堿性磷酸酶、核酸外切酶Exo和10XPCR緩沖液組成。本發(fā)明白內(nèi)障基因檢測試劑盒是以一個(gè)新發(fā)現(xiàn)的先天性核性白內(nèi)障家系(ADCC-4)致病基因?yàn)闄z測對象進(jìn)行基因檢測。本發(fā)明白內(nèi)障基因檢測試劑盒檢測ADCC-4家系致病基因準(zhǔn)確率高達(dá)99.9%，為臨床診斷先天性核性白內(nèi)障奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。本發(fā)明白內(nèi)障基因檢測試劑盒可以在新生兒早期(白內(nèi)障病變未出現(xiàn)前)作出診斷，為及早治療，把握治療時(shí)機(jī)提供了物質(zhì)保障。本發(fā)明白內(nèi)障基因檢測試劑盒在與現(xiàn)有的白內(nèi)障基因檢測方法相結(jié)合，可以有效的降低白內(nèi)障基因檢測漏檢率。圖1是先天性核性白內(nèi)障患者眼部裂隙燈顯微鏡照片；圖2是先天性核性白內(nèi)障家系A(chǔ)DCC-4進(jìn)行單體型分析結(jié)果圖，圖2中方形圖標(biāo)表示男性，圓形圖標(biāo)表示女性，空白表示正常人，黑色填充表示患者，打斜線表示已經(jīng)去世；圖3是具體實(shí)施方式四中陽性新生兒正向測序圖；圖4是具體實(shí)施方式四中陽性新生兒反向測序圖；圖5是具體實(shí)施方式四中陰性新生兒正向測序圖；圖6是具體實(shí)施方式四中陰性新生兒反向測序圖。具體實(shí)施例方式具體實(shí)施方式一:本實(shí)施方式白內(nèi)障基因檢測試劑盒由白內(nèi)障PCR擴(kuò)增檢測試劑和pcr產(chǎn)物純化試劑組成；白內(nèi)障pcr擴(kuò)增檢測試劑由10.0mL雙蒸餾水、5.0|iL5xQsolution、3.0jiL25mMMgCl2、2.5{iL10xbuffer、2.5^L2mMdNTP、0.4pL^nM雙向特異性引物和0.2iJLTaq酶組成；其中正向特異性引物序列為CATGCCACAACCTACCAAGTT，反向特異性引物序列為TGACAAGGAGCATTTAAAGGTG;PCR產(chǎn)物純化試劑由北極蟲下堿性磷酸酶(SAP)、核酸外切酶Exo和10XPCR緩沖液組成。本實(shí)施方式針對先天性核性白內(nèi)障家系(ADCC-4)致病基因進(jìn)行基因檢測。先天性核性白內(nèi)障在ADCC-4家系世代間連續(xù)傳遞，系譜分析ADCC-4家系符合常染色體顯性遺傳的特征。先天性核性白內(nèi)障家系(ADCC-4)患者表現(xiàn)為雙眼發(fā)病，晶體混濁形態(tài)基本相同，均為雙側(cè)晶體核混濁，晶體皮質(zhì)部分混濁；并都伴有小角膜，角膜直徑約910mm，先天性核性白內(nèi)障患者眼部裂隙燈顯微鏡照片如圖1所示。利用基因掃描與連鎖分析對致病基因進(jìn)行染色體初步定位，在排除了大部分先天性白內(nèi)障相關(guān)染色體區(qū)域后(陰性數(shù)據(jù)未列出)，在2號染色體的微衛(wèi)皇標(biāo)記處發(fā)現(xiàn)陽性LOD值。在D2S325處發(fā)現(xiàn)陽性LOD值，Z-2.29(0=0.00)，提示ADCC-4家系的致病基因與該區(qū)域連鎖，在標(biāo)記物附近選取多個(gè)高密度熒光標(biāo)記物進(jìn)行精細(xì)定位，精細(xì)定位結(jié)果在D2S2321、D2S1385、D2S1242這3個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記處發(fā)現(xiàn)連續(xù)陽性LOD值，并且都大于1。在D2S325處獲得最大LOD值，Zmax=2.29(0=0.00)，數(shù)據(jù)見表l。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>為確定致病基因所在染色體區(qū)域，對先天性核性白內(nèi)障家系A(chǔ)DCC-4進(jìn)行單體型分析，分析結(jié)果如圖2所示。多個(gè)個(gè)體發(fā)生重組，將致病區(qū)域確定在D2S117和D2S128之間，位于2號染色體2q32.3-q34，根據(jù)Marshfield圖譜獲知上述兩個(gè)遺傳標(biāo)記之間的遺傳距離約為15.98厘摩(cM)。對CRYG基因簇中的基因CRYGA、CRYGB、CRYGC和CRYGD進(jìn)行雙向測序發(fā)現(xiàn)CRYGC基因第3外顯子第470堿基，有一個(gè)G》A的點(diǎn)突變，導(dǎo)致編碼第157個(gè)色氨酸的遺傳密碼子變成了終止密碼子(TGG->TAG)，形成了截短了的多肽鏈(W157X)。ADCC-4家系所有白內(nèi)障患者都具有相同的點(diǎn)突變，而家系內(nèi)其余正常個(gè)體和IOO名正常對照都沒有此突變，從而排除了它是罕見的單個(gè)核苷酸多態(tài)性(SNP)的可能性，確定CRYGC基因突變是先天性核性白內(nèi)障家系A(chǔ)DCC-4的致病基因突變。具體實(shí)施方式二本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式一的不同點(diǎn)是每微升PCR產(chǎn)物純化試劑中含北極蝦堿性磷酸酶和核酸外切酶Exo各0.5單位。其它與實(shí)施方式一相同。本實(shí)施方式中用北極蝦堿性磷酸酶(SAP)降解殘余dNTP，用核酸外切'酶Exo降解殘余引物，以去除降解殘余dNTP和引物對后續(xù)測序反應(yīng)的不良影響。具體實(shí)施方式三本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式一的不同點(diǎn)是白內(nèi)障基因檢測試劑盒還包括測序純化液，測序純化液由濃度為3M的醋酸鈉和濃度為100%的乙醇按1:25的體積比組成。其它與實(shí)施方式一相同。具體實(shí)施方式四本實(shí)施方式用白內(nèi)障基因檢測試劑盒檢測20000名新生兒(一)選用QIAGEN公司QIAampDNABloodMiniKit試劑盒提取20000名新生兒基因組DNA1、配試劑1)QIAGENProtease:MiniKit(250)，加5.5mlproteasesolvent(4度保存)，，2)緩沖液AL:使用之前要搖勻(室溫保存)，3)緩沖液AW1:MiniKit(250)，加125ml乙醇(室溫保存)，4)緩沖夜AW2:MiniKit(250)，力口160ml乙醇(室溫保存)；2、加20pLQIAGENProtease到1.5ml離心管中；3、加20(HiL血樣，輕輕搖勻；4、加200pL緩沖液AL，充分振蕩，至少15秒；5、56度水浴，至少IO分鐘；6、離心，保證蓋子上沒有沾染液體；7、加200jxL乙醇，充分振蕩，至少15秒；8、離心，保證蓋子上沒有沾染液體；9、將所有液體(620pL)移到濾膜柱中，注意不要弄臟，蓋上蓋子，8000轉(zhuǎn)/分鐘(6000g)，離心1分鐘，將濾膜柱轉(zhuǎn)移到另一干凈的2ml離心管中；10、加500pL緩沖液AWl，8000轉(zhuǎn)/分鐘(6000g)，離心1分鐘，將濾膜柱轉(zhuǎn)移到另一干凈的2ml離心管中；11、加500(iL緩沖液AW2，14000轉(zhuǎn)/分鐘(2000g)，離心4分鐘(如果濾出液碰到濾膜柱，則需要換一個(gè)離心管，重新離心)，離心機(jī)最大速度離心1分鐘；12、將濾膜柱轉(zhuǎn)移到另一干凈的1.5ml離心管中，加200|oL緩沖液AE至濾膜上，室溫放置1分鐘，然后8000轉(zhuǎn)/分鐘(6000g)離心1分鐘，即得到新生兒基因組DNA。(二)白內(nèi)障PCR擴(kuò)增檢測取1.0pL新生兒基因組DNA為DNA模板，加入白內(nèi)障PCR擴(kuò)增檢測試劑，白內(nèi)障PCR擴(kuò)增檢測體系為25.0^iL。PCR反應(yīng)程序如表2。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>PCR反應(yīng)結(jié)束后取2pL反應(yīng)產(chǎn)物加入2^L的2XLoadingBuffer,4000r/min離心30秒。上樣在丄5%的瓊脂糖凝膠(5g瓊脂糖、100mL1XTBE、1.5pLfOmg/mLEB)中，100V電壓下電泳15min，凝膠攝像儀拍攝檢測。(三)PCR產(chǎn)物純化用PCR產(chǎn)物純化試劑降解殘余dNTP和殘余引物。每微升PCR產(chǎn)物純化試劑中含北極蝦堿性磷酸酶和核酸外切酶Exo各0.5單位。取1.52nLPCR產(chǎn)物加入1.5|iLPCR產(chǎn)物純化試劑然后在37'C條件下處理40分鐘，再置于85。C環(huán)境中20分鐘(酶滅活)，之后4。C保溫。(四)PCR產(chǎn)物測序測序反應(yīng)體系為5jiL:向純化后的？01產(chǎn)物中加入3.211101單向特異性引物(正向特異性引物序列為CATGCCACAACCTACCAAGTT，反向特異性引物序列為TGACAAGGAGCATTTAAAGGTG，正向測序加的是正向特異性引物，反向測序加的是反向特異性引物)、O單BDT(BigDyeTerminator3.1，AppliedBiosystems)和余量的ddH20(雙蒸餾水)。測序反應(yīng)程序如表3。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>(五)測序產(chǎn)物純化1)測序反應(yīng)的96孔板中每孔加25^iL測序純化液(測序純化液由濃度為3M的醋酸鈉和濃度為100%的乙醇按1:25的體積比組成)，然后在4°C、4000r/min的條件下離心45分鐘，再倒置在600r/min的條件下離心1分鐘甩干；2)加入50^iL濃度為70。/。的乙醇溶液在4。C、4000r/min的條件下離心10分鐘，再倒置在600r/min的條件下離心1分鐘甩干，并重復(fù)操作本步驟一次；3)室溫靜置半小時(shí)自然干燥。在測序以前先要使DNA樣品變性。變性的方法是在純化后的樣品中加入1(HiLHiDi(去離子甲酰胺)，在PCR儀上95。C保持5分鐘使之完全變性。變性后即刻放入冰中至少2分鐘防止其復(fù)性。(六)測序DNA樣品變性在上一步(五)純化后的樣品中加入10pLHiDi(去離子甲酰胺)，在PCR儀上95。C保持5分鐘使之完全變性，然后立即放入冰中至少2分鐘防止其復(fù)性；測序上樣至ABIPRISM3100測序儀/分型儀(AppliedBiosystems)進(jìn)行測序。(七)測序結(jié)果分析應(yīng)用SEQUENCEANALYSIS軟件對測序結(jié)果進(jìn)行分析。CRYGC基因第3外顯子第470堿基有G->A點(diǎn)突變的判斷為陽性(堿基標(biāo)注為N)。20000名新生兒中有5名測序結(jié)果呈陽性，陽性新生兒正向測序圖如圖3所示，陽性新生兒反向測序圖如圖4所示，陰性新生兒正向測序圖如圖5所示，陰性新生兒反向測序圖如圖6所示。5名陽性新生兒基因檢測1年后跟蹤復(fù)查都出現(xiàn)核性白內(nèi)障癥狀，準(zhǔn)確率達(dá)100%;而采用現(xiàn)有其它白內(nèi)障基因檢測方法此5名陽性新生兒均呈陰性，被漏檢。序列表<110>哈爾濱醫(yī)科大學(xué)<120>—種白內(nèi)障基因檢測試劑盒<160>2<210>1<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)檢測的白內(nèi)障致病基因設(shè)計(jì)的正向特異性引物序列<400>1catgccacaacctaccaagtt21<210〉2<211〉22〈212>腿〈213〉人工序列〈220〉<223>根據(jù)檢測的白內(nèi)障致病基因設(shè)計(jì)的反向特異性引物序列<400>2tgacaaggagcatttaaaggtg2權(quán)利要求1、一種白內(nèi)障基因檢測試劑盒，其特征在于白內(nèi)障基因檢測試劑盒主要由白內(nèi)障PCR擴(kuò)增檢測試劑和PCR產(chǎn)物純化試劑組成；白內(nèi)障PCR擴(kuò)增檢測試劑由10.0μL雙蒸餾水、5.0μL5×Qsolution、3.0μL25mMMgCl2、2.5μL10×buffer、2.5μL2mMdNTP、0.4μL20μM雙向特異性引物和0.2μLTaq酶組成；其中正向特異性引物序列為CATGCCACAACCTACCAAGTT，反向特異性引物序列為TGACAAGGAGCATTTAAAGGTG；PCR產(chǎn)物純化試劑由北極蝦堿性磷酸酶、核酸外切酶Exo和10×PCR緩沖液組成。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種白內(nèi)障基因檢測試劑盒，其特征在于每微升PCR產(chǎn)物純化試劑中含北極蝦堿性磷酸酶和核酸外切酶Exo各0.5單位。3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種白內(nèi)障基因檢測試劑盒，其特征在于白內(nèi)障基因檢測試劑盒還包括測序純化液，測序純化液由濃度為3M的醋酸鈉和濃度為100%的乙醇按1:25的體積比組成。全文摘要一種白內(nèi)障基因檢測試劑盒，它涉及一種基因檢測試劑盒。它解決了目前白內(nèi)障常規(guī)檢測手段只能在白內(nèi)障發(fā)病后作出診斷，延誤治療時(shí)機(jī)以及目前的白內(nèi)障基因檢測漏檢率高的缺陷。白內(nèi)障基因檢測試劑盒主要由白內(nèi)障PCR擴(kuò)增檢測試劑和PCR產(chǎn)物純化試劑組成。本發(fā)明白內(nèi)障基因檢測試劑盒檢測ADCC-4家系致病基因準(zhǔn)確率高達(dá)99.9％，為臨床診斷先天性核性白內(nèi)障奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。本發(fā)明白內(nèi)障基因檢測試劑盒可以在新生兒早期(白內(nèi)障病變未出現(xiàn)前)作出診斷，為及早治療，把握治療時(shí)機(jī)提供了物質(zhì)保障。本發(fā)明白內(nèi)障基因檢測試劑盒在與現(xiàn)有的白內(nèi)障基因檢測方法相結(jié)合，可以有效的降低白內(nèi)障基因檢測漏檢率。文檔編號C12Q1/68GK101168775SQ20071014450公開日2008年4月30日申請日期2007年10月29日優(yōu)先權(quán)日2007年10月29日發(fā)明者傅松濱,平劉,璐張申請人:哈爾濱醫(yī)科大學(xué)