一種新的貝殼杉烷類二萜化合物及其制備方法和醫(yī)藥用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于藥物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及從南方紅豆杉的干燥枝葉中分離得到的一種 具有血管保護(hù)作用的貝殼杉烷類二萜化合物及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 南方紅豆杉（Taxus chinensis var. mairei)又稱美麗紅豆杉，系紅豆杉目 (Taxales)紅豆杉科（Taxaceae S. F. Gery)紅豆杉屬（Taxus Linn)植物，特產(chǎn)于我國(guó)，主要 分布于長(zhǎng)江流域、南嶺山脈山區(qū)以及河南、陜西（秦嶺）、甘肅等省的山地或溪谷，是紅豆杉 屬中生長(zhǎng)最快、分布最廣的植物。南方紅豆杉為常綠喬木，葉螺旋狀著生，基部扭轉(zhuǎn)呈二列 狀，條形，微彎或近鐮刀狀，長(zhǎng)2~3cm，寬3~4mm，先端漸尖，邊緣不卷曲，上面中脈突起， 雌雄異株，球花單生葉腋；雌球花的胚珠單生于花軸上部側(cè)生短軸的頂端，基部托以圓盤(pán)狀 假種皮。種子倒卵形或?qū)捖研?，長(zhǎng)約5~6_，徑4~5_，微扁，生于紅色肉質(zhì)杯狀假種皮 中，成熟時(shí)假種皮紅色。外種皮骨質(zhì)堅(jiān)硬，種臍橢圓形。在我國(guó)傳統(tǒng)中醫(yī)藥中以紅豆杉植物 的枝葉入藥，處方名為紫杉、赤柏松，具有通經(jīng)止痛、利尿、降血糖和治療腎臟病的效用。《本 草推陳》中記載"紫杉"可入藥，"用皮易引起嘔吐，用木部及葉則不吐"。民間用紅豆杉果實(shí) 和枝葉煎湯可潤(rùn)燥、通經(jīng)、利尿和驅(qū)蟲(chóng)。
[0003] 南方紅豆杉主要化學(xué)成分為二萜類化合物、留體類化合物、木脂素以及黃酮類化 合物等，其中最重要的化學(xué)成分是其二萜類化合物紫杉醇（taxol)?？鼓[瘤藥物紫杉醇最 初從紅豆杉屬植物短葉紅豆杉（Taxus brevifolia Nutt)樹(shù)皮中分離得到。紫杉醇的臨床 研究于1981年展開(kāi)，1992年美國(guó)FDA批準(zhǔn)了紫杉醇用于對(duì)晚期卵巢癌的治療，1994年又批 準(zhǔn)了對(duì)乳腺癌的治療。目前，紫杉醇的臨床應(yīng)用范圍已經(jīng)擴(kuò)展到肺癌、前列腺癌等，被譽(yù)為 是"晚期癌癥的最后一道防線"，是臨床應(yīng)用的最為優(yōu)秀的天然抗腫瘤藥物。由于其顯著的 抗癌活性和獨(dú)特的抗癌作用機(jī)制，紫杉醇及紅豆杉屬植物引起了全世界廣泛關(guān)注。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種從南方紅豆杉的干燥枝葉中分離得到的一種具有血管 保護(hù)作用的貝殼杉烷類二萜化合物及其制備方法。
[0005] 本發(fā)明的上述目的是通過(guò)下面的技術(shù)方案得以實(shí)現(xiàn)的：
[0006] 具有下述結(jié)構(gòu)式的化合物（I )，
[0007]
[0008] 所述的化合物（I )的制備方法，包含以下操作步驟：(a)將南方紅豆杉的干燥枝 葉粉碎，用75~85%乙醇熱回流提取，合并提取液，濃縮至無(wú)醇味，依次用石油醚、乙酸乙 酯和水飽和的正丁醇萃取，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；(b) 步驟（a)中乙酸乙酯萃取物用大孔樹(shù)脂除雜，先用15%乙醇洗脫8個(gè)柱體積，再用75%乙 醇洗脫12個(gè)柱體積，減壓濃縮得75%乙醇洗脫物浸膏；（c)步驟（b)中75%乙醇洗脫浸膏 用正相硅膠分離，依次用體積比為80:1、55:1、35:1、10:1和1:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗 脫得到5個(gè)組分；（d)步驟（c)中組分4用正相硅膠進(jìn)一步分離，依次用體積比為15:1、10:1 和5:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到3個(gè)組分；（e)步驟（d)中組分2用十八烷基硅烷 鍵合的反相硅膠分離，用體積百分濃度為75%的甲醇水溶液等度洗脫，收集8~10個(gè)柱體 積洗脫液，洗脫液減壓濃縮得到純的化合物（I )。
[0009] 進(jìn)一步地，所述大孔樹(shù)脂為AB-8型大孔吸附樹(shù)脂。
[0010] 進(jìn)一步地，所述用乙醇熱回流提取采用的乙醇濃度為80%。
[0011] -種藥物組合物，其中含有治療有效量的所述的化合物（I )和藥學(xué)上可接受的 載體。
[0012] 所述的化合物（I )在制備血管保護(hù)的藥物中的應(yīng)用。
[0013] 所述的藥物組合物在制備血管保護(hù)的藥物中的應(yīng)用。
[0014] 本發(fā)明化合物用作藥物時(shí)，可以直接使用，或者以藥物組合物的形式使用。
[0015] 該藥物組合物含有治療有效量的本發(fā)明化合物（I )，其余為藥物學(xué)上可接受的、 對(duì)人和動(dòng)物無(wú)毒和惰性的可藥用載體和/或賦形劑。
[0016] 所述的可藥用載體或賦形劑是一種或多種選自固體、半固體和液體稀釋劑、填料 以及藥物制品輔劑。將本發(fā)明的藥物組合物以單位體重服用量的形式使用。本發(fā)明藥物可 通過(guò)口服或注射的形式施用于需要治療的患者。用于口服時(shí)，可將其制成片劑、緩釋片、控 釋片、膠囊、滴丸、微丸、混懸劑、乳劑、散劑或顆粒劑、口服液等；用于注射時(shí)，可制成滅菌的 水性或油性溶液、無(wú)菌粉針、脂質(zhì)體或乳劑等。
【附圖說(shuō)明】
[0017] 圖1為化合物（I )結(jié)構(gòu)式；
[0018] 圖2為化合物（I )理論E⑶值與實(shí)驗(yàn)E⑶值比較。
【具體實(shí)施方式】
[0019] 下面結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性內(nèi)容，但并不以此限定本發(fā)明保護(hù)范 圍。盡管參照較佳實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作了詳細(xì)說(shuō)明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對(duì) 本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實(shí)質(zhì)和范圍。
[0020] 實(shí)施例1 :化合物（I )分離制備及結(jié)構(gòu)確證
[0021] 藥材和試劑來(lái)源：乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、二氯甲烷為分析純，購(gòu)自上海 凌峰化學(xué)試劑有限公司，甲醇，分析純，購(gòu)自江蘇漢邦化學(xué)試劑有限公司。紅豆杉的枝葉購(gòu) 自安徽亳州中藥材市場(chǎng)。
[0022] 制備方法：（a)南方紅豆杉的干燥枝葉（IOkg)粉碎，用80 %乙醇熱回流提取 (25LX3次），合并提取液，濃縮至無(wú)醇味（6L)，依次用石油醚（6LX3次）、乙酸乙酯（6LX3 次）和水飽和的正丁醇（6LX3次）萃取，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物（355g) 和正丁醇萃取物；(b)步驟（a)中乙酸乙酯萃取物用AB-8型大孔樹(shù)脂除雜，依次用15%乙 醇（8L)和75 % (12L)乙醇洗脫，收集75 %乙醇洗脫液，減壓濃縮得75 %乙醇洗脫物浸膏 (154g) ;(c)步驟（b)中75%乙醇洗脫浸膏用正相硅膠分離，依次用體積比為80:1(8個(gè)柱 體積）、55:1 (8個(gè)柱體積）、35: U6個(gè)柱體積）、10:1 (8個(gè)柱體積）和1:1 (5個(gè)柱體積）的 二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到5個(gè)組分；（d)步驟（c)中組分4 (46g)用正相硅膠進(jìn)一步分 離，依次用體積比為15:1 (8個(gè)柱體積）、10:1 (10個(gè)柱體積）和5: U6個(gè)柱體積）的二氯甲 烷-甲醇梯度洗脫得到3個(gè)組分；（e)步驟（d)中組分2 (27g)用十八烷基硅烷鍵合的反相 硅膠分離，用體積百分濃度為75%的甲醇水溶液等度洗脫，收集8-10個(gè)柱體積洗脫液，洗 脫液減壓濃縮得到純的化合物（I ) (35mg)。
[0023] 結(jié)構(gòu)確證：HR-ES頂S顯示[M+Na]+為m/z 387. 1816,結(jié)合核磁特征可得分子式為 C2dH28O6,不飽和度為 7。核磁共振氫譜數(shù)據(jù) δ H(ppm，DMS0-d6, 500MHz) :H-1 (4.78, dd，J = 10. 8,6. 2)，H-2 (I. 79, m)，H-3 (I. 25, m)，H-5 (3. 07, br，s)，H-6 (5. 65, br，s)，H-9 (3. 74， d，J = 9. 7)，33, m)，H-12(2. 61，m)，H-12(2. 14, dd，J = 14. 5,6. 3)，H-13(2. 39， overlap)，H-14 (3. 37, overlap)，H-14 (2. 06, d，J = 10. 3)，H-15 (5. 55, s)，H-17 (I. 67, s)， H-18 (0· 98, s)，H-19 (0· 97, s)，H-20 (4. 38, d，J = 8. 6)，H-20 (4. 09, d，J = 8. 6);核磁共振碳 譜數(shù)據(jù) δ c (ppm，DMS0-d6,125MHz) :76. I (CH，1-C)，24. 0 (CH2, 2-C)，36. 9 (CH2, 3-C)，31. 3 (C， 4-C)，54. 2 (CH，5-C)，206. 0 (CH，6-C)，175. 6 (C，7-C)，55. 7 (C，8-C)，45. 3 (CH，9-C)，50. 8 (C， 10-C)，63. I (CH，11-C)，36. 9 (CH2,12-C)，46. 0 (CH，13-C)，34. I (CH2,14-C)，83. 8 (CH，15-C)， 80. 4 (C，16-C)，23. I (CH3,17-C)，33. 0 (CH3,18-C)，23. I (CH3,19-C)，72. 9 (CH2, 20-C);碳原 子標(biāo)記參見(jiàn)圖U13C NMR和DEPT譜顯示20個(gè)碳信號(hào)，包括三個(gè)甲基，五個(gè)亞甲基（一個(gè)連氧 亞甲基），七個(gè)次甲基（三個(gè)連氧碳以及一個(gè)醛基碳），五個(gè)季碳（一個(gè)連氧碳以及一個(gè)內(nèi) 酯羰基碳）。HMBC 譜中，H-15 ( δ H5. 55)與 C-8 ( δ C55. 7)，C-9 ( δ C45. 3)和 C-16 ( δ C80. 4) 的相關(guān)性表明C-15位上連有羥基。ROESY譜中，Η-15與Η-13 β的相關(guān)性表明C-15-OH為 〇構(gòu)型。腿8(：譜中，!12-14(3!13.37和2.06)，!1-13(3!12.39)，!1 2-12(3!12.61和2.14)和 Μθ-17(δΗ1.67)與連氧季碳C-16〇C80. 4)的相關(guān)性表明C-16位上連有一個(gè)羥基基團(tuán)。 ROESY譜中，H-9與Me-17和Η-12α的相關(guān)性表明C-16-OH為β構(gòu)型。綜合氫譜、碳譜、 HMBC譜和ROESY譜，以及文獻(xiàn)關(guān)于相關(guān)類型核磁數(shù)據(jù)，可基本確定該化合物如圖1所示，立 體構(gòu)型進(jìn)一步通過(guò)E⑶試驗(yàn)確定，理論值與實(shí)驗(yàn)值基本一致（圖2)。
[0024] 實(shí)施例2 :化合物（I )藥理作用試驗(yàn)
[0025] 一、材料和儀器
[0026] 血管內(nèi)皮細(xì)胞（ECV-304)由山東大學(xué)醫(yī)學(xué)院免疫教研室饋贈(zèng)。化合物（I )自制， 制備方法見(jiàn)實(shí)施例1，HPLC歸一化純度大于98%。RPMI-1640干粉培養(yǎng)基、胰蛋白酶購(gòu)于美 國(guó)Gibeo公司。胎牛血清購(gòu)于天津TBD公司。MTT、瓊脂糖、AnnexinV-FITC購(gòu)于美國(guó)Sigma 公司。LDH、MDA、SOD、GSH-Px測(cè)定試劑盒購(gòu)于南京建成生物工程研究所。DMSO購(gòu)于中國(guó)醫(yī) 藥（集團(tuán)）上?；瘜W(xué)試劑有限公司。蘇木素購(gòu)于福州邁新生物技術(shù)有限公司。Rhodamine 123購(gòu)于美國(guó)Solarbic公司。陽(yáng)性藥川考嗪購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司。
[0027] 倒置光學(xué)顯微鏡（日本OlymPus公司），二氧化碳培養(yǎng)箱（美國(guó)Forma Scientific 公司），電子分析天平（ER-182A型）（日本A&D公司），超凈工作臺(tái)（ZHJH-1209型）（上海 智城分析儀器制造有限公司），流式細(xì)胞儀（FACS Vantage型）（美國(guó)Beeton Diehnson公 司），恒溫振蕩器（江蘇太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠），1420Vietor3多標(biāo)記分析儀（美國(guó)PerkinElmer Lifescience公司），721型可見(jiàn)紫外光柵分光光度計(jì)（上海精密科學(xué)有限公司），電熱 恒溫水浴箱（上海醫(yī)療儀器三廠生產(chǎn)），酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀（MK3Multiskan)(上海Thermo Labsystem分析儀器公司）。
[0028] 二、試驗(yàn)方法
[0029] 1、細(xì)胞培養(yǎng)
[0030] ECV-304細(xì)胞以RPMI-1640培養(yǎng)基于37°C，5% CO2培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)。鏡下觀察， 待細(xì)胞匯合率達(dá)到70%以上時(shí)用胰蛋白酶消化傳代，以生長(zhǎng)穩(wěn)定的第3-5代細(xì)胞制備細(xì)胞 懸液。
[0031] 2、細(xì)胞分組及處理
[0032] 取生長(zhǎng)良好的ECV-304細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，接種于96孔、24孔、6孔細(xì)胞培養(yǎng)板或 培養(yǎng)皿中，37°