一種二萜化合物及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于藥物技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及從貓爪草的干燥塊根中分離得到的一種具有 治療前列腺癌作用的二祗化合物及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 貓爪草Ranunculi Ternati Radix為毛良科植物小毛良Ranunculus ternatus 化unb.的干燥塊根。本品呈紡鍵形，多5~6個(gè)簇生，形似貓爪，長3~10mm，直徑2~3mm，頂端 有黃褐色殘莖或莖痕。表面黃褐色或灰黃色，久存色澤變深，微有縱皺紋，并有點(diǎn)狀須根痕 和殘留須根。質(zhì)堅(jiān)實(shí)，斷面類白色或黃白色，空屯、或?qū)嵧?、，粉性。氣微，味微甘。貓爪草別名Ξ 散草(浙江）、貓爪兒草(河南）、貓爪子(河南）、鴨腳板(安徽）、金花草(廣西）。貓爪草性溫， 味甘、辛，入肝、肺經(jīng)，具有清熱解毒、消腫散結(jié)、止咳桂疲等功效，臨床用于治療肺結(jié)核、淋 己結(jié)結(jié)核、咽喉炎、追疾等癥。民間用貓爪草治療淋己結(jié)核，不論結(jié)核大小或是否化脈均有 較好的療效。近年來因其有較好的抗腫瘤效果而成為研究熱點(diǎn)。
[0003] 近年來針對貓爪草化學(xué)成分的研究較少，其主要含有黃酬類及巧類、生物堿、揮發(fā) 油、有機(jī)酸等化合物。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種從貓爪草的干燥塊根中分離得到的一種具有治療前列 腺癌作用的二祗化合物及其制備方法。
[0005] 本發(fā)明的上述目的是通過下面的技術(shù)方案得W實(shí)現(xiàn)的：
[0006] -種二祗化合物，具有下述結(jié)構(gòu)式的化合物(I)，
[0007]
[000引所述的化合物（I)的制備方法，包含W下操作步驟：（a)將貓爪草的干燥塊根粉碎， 用75~85 %乙醇熱回流提取，合并提取液，濃縮至無醇味，依次用石油酸、乙酸乙醋和水飽 和的正下醇萃取，分別得到石油酸萃取物、乙酸乙醋萃取物和正下醇萃取物；（b)步驟(a)中 乙酸乙醋萃取物用大孔樹脂除雜，先用15 %乙醇洗脫8個(gè)柱體積，再用75 %乙醇洗脫10個(gè)柱 體積，收集75%乙醇洗脫液，減壓濃縮得75%乙醇洗脫物浸膏；（C)步驟(b)中75%乙醇洗脫 浸膏用正相硅膠分離，依次用體積比為85:1、45:1、20:1、10:1和1:1的二氯甲燒-甲醇梯度 洗脫得到5個(gè)組分；（d)步驟(C)中組分3用正相硅膠進(jìn)一步分離，依次用體積比為25:1、20:1 和10:1的二氯甲燒-甲醇梯度洗脫得到3個(gè)組分；（e)步驟(d)中組分2用十八烷基硅烷鍵合 的反相硅膠分離，用體積百分濃度為75 %的甲醇水溶液等度洗脫，收集8~10個(gè)柱體積洗脫 液，洗脫液減壓濃縮得到純的化合物(I)。
[0009] 進(jìn)一步地，步驟(a)中，用80%乙醇熱回流提取，合并提取液。
[0010] 進(jìn)一步地，所述大孔樹脂為AB-8型大孔吸附樹脂。
[0011] 本發(fā)明化合物在醫(yī)藥領(lǐng)域，可W作為抗前列腺癌藥物，可W直接使用，或者W藥物 組合物的形式使用。該藥物組合物含有治療有效量的本發(fā)明化合物（I)，其余為藥物學(xué)上可 接受的、對人和動(dòng)物無毒和惰性的可藥用載體和/或賦形劑。體外試驗(yàn)證明該化合物對前列 腺癌細(xì)胞株P(guān)C3和DU145有抑制作用，且抑制作用具有濃度一一時(shí)間依賴性關(guān)系，因此，本發(fā) 明的上述化合物(I)可W用來開發(fā)成治療前列腺癌的藥物。
【附圖說明】
[0012] 圖1為化合物(I)結(jié)構(gòu)式；
[OOK]圖2為化合物（I)理論ECD值與實(shí)驗(yàn)ECD值比較；
[0014] 圖3為不同濃度化合物（I)作用7化后PC3和DU145存活率；
[0015] 圖4為10.0 mg/L化合物（I)作用不同時(shí)間后PC3和DU145存活率。
【具體實(shí)施方式】
[0016] 下面結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性內(nèi)容，但并不W此限定本發(fā)明保護(hù)范 圍。盡管參照較佳實(shí)施例對本發(fā)明作了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可W對 本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實(shí)質(zhì)和范圍。
[0017] 實(shí)施例1:化合物(I)分離制備及結(jié)構(gòu)確證
[0018] 試劑來源：乙醇、石油酸、乙酸乙醋、正下醇、二氯甲燒為分析純，購自上海凌峰化 學(xué)試劑有限公司，甲醇，分析純，購自江蘇漢邦化學(xué)試劑有限公司。
[0019]審I恪方法：（a)貓爪草的干燥塊根（10kg)粉碎，用80%乙醇熱回流提?。?f5LX 3 次），合并提取液，濃縮至無醇味(3L)，依次用石油酸(化X3次）、乙酸乙醋(化X3次)和水飽 和的正下醇(化X3次)萃取，分別得到石油酸萃取物、乙酸乙醋萃取物(398g)和正下醇萃取 物；（b)步驟(a)中乙酸乙醋萃取物用AB-8型大孔樹脂除雜，先用15%乙醇洗脫8個(gè)柱體積， 再用75%乙醇洗脫10個(gè)柱體積，收集75%乙醇洗脫液，減壓濃縮得75%乙醇洗脫物浸膏 (163g); (C)步驟(b)中75%乙醇洗脫浸膏用200-300目正相硅膠分離，依次用體積比為85:1 (10個(gè)柱體積）、45:1 (9個(gè)柱體積）、20:1 (8個(gè)柱體積）、10:1 (8個(gè)柱體積)和1:1 (5個(gè)柱體積） 的二氯甲燒-甲醇梯度洗脫得到5個(gè)組分；（d)步驟(C)中組分3(49g)用200-300目正相硅膠 進(jìn)一步分離，依次用體積比為25:1(8個(gè)柱體積）、20:1(10個(gè)柱體積)和10:1(5個(gè)柱體積）的 二氯甲燒-甲醇梯度洗脫得到3個(gè)組分；（e)步驟(d)中組分2(21g)用十八烷基硅烷鍵合的反 相硅膠0DS-C18分離，用體積百分濃度為75 %的甲醇水溶液等度洗脫，收集8~10個(gè)柱體積 洗脫液，洗脫液減壓濃縮得到純的化合物(I) (43mg)。
[0020] 結(jié)構(gòu)確證:HR-ESIMS顯示[M+Na]+為m/z 489.2808，結(jié)合核磁特征可得分子式為 C26H4207，不飽和度為6。核磁共振氨譜數(shù)據(jù)δκ(郵m，DMSO-ds，600MHz): H-1 (1.16，m)，H-1 (2.03，ddd，J=13.7,8.7，1.8)，H-2(4.21，m)，H-3(1.91，m)，H-3(1.28，m)，H-4(2.20，ddd，J = 14.9,7.2,3.6)，H-6(1.48，m)，H-6(1.64，dt，J=14.0,2.8)，H-7(1.31，m)，H-7(1.12，m)， H-8(1.45，m)，H-10(1.71，d，J=13.7)，H-ll(l.ll，m)，H-ll(1.34，m)，H-12(1.94，m)，H-14 (6.33，dd，J=17.6，10.9)，H-15(5.13，d，J=17.6)，H-15(4.93，d，J=10.8)，H-16(4.93， s)，H-16(4.82，s)，H-17(0.76，d，J = 6.8)，H-18(6.38，d，J = 7.2)，H-19(6.03，s)，H-20 (0.84，s)，H-2，（2.15，td，J = 7.3，1.4)，H-3，（1.52，J = 7.3)，H-4，（0.84，t，J = 7.3)，H-2，， (1.80，s);核磁共振碳譜數(shù)據(jù)Sc(ppm，DMSO-ds，150Hz): 29.1 (C出，1-C)，66.4 (CH，2-C)，29.4 (CH2,3-C)，45.3(CH，4-C)，49.2(C，5-C)，22.9(CH2,6-C)，27.0(Ol2,7-C)，36.9(CH，8-C)， 36.1(C，9-C)，34.7(CH，10-C)，32.3(CH2，ll-C)，26.3(Ol2，12-C)，144.4(C，13-C)，139.4 (邸，14-〇，111.3(邸2，15-〇，114.4(邸2，16-〇，14.6(細(xì)3，17-〇,97.2(邸，18-〇,99.2 (CH，19-C)，25.7(CH3,20-C)，171.2(C，r-C)，35.4(CH2,2，-C)，17.2(CH2,3，-C)，12.7(C 出， 4' -C)，168.8(C，Γ-C)，20.5(C出，2"-C);碳原子標(biāo)記參見圖1。13〇 NMR譜顯示有26個(gè)信號， 包含兩個(gè)甲基（5(：14.6，17-。25.7,20-〇，兩個(gè)共輛雙鍵（5(：144.4，13-。139.4，14-。 111.3，15-。114.4，16-〇，一個(gè)乙酷氧基（5(：168.8，1"-。20.5,2"-〇，一個(gè)下酷氧基（5 C171.2，Γ-C;35.4,2'-C;17.2,3'-C;12.7,4'-C)。綜合氨譜、碳譜、HMBC譜和N0ESY譜，W及 文獻(xiàn)關(guān)于相關(guān)類型核磁數(shù)據(jù)，可基本確定該化合物如圖1所示，絕對構(gòu)型依次為2R，4S，5R， 85,95，103，185，191?;立體構(gòu)型進(jìn)一步通過6〔0試驗(yàn)確定，理論值與實(shí)驗(yàn)值基本一致(圖2)。 [0021]實(shí)施例2:化合物(I)藥理作用試驗(yàn) [00剖一、材料和儀器
[0023] 前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C3(ArCC-C化-1435)、前列腺癌細(xì)胞株DU145(ATCC-HTB-81)。化 合物（I)自制，HPLC歸一化純度大于98%，用二甲基亞抓(DMS0)配制成濃度為l.Og/L的儲(chǔ)存 液備用。CCK-8試劑盒為日本同仁化學(xué)研究所產(chǎn)品。RPMI-1640培養(yǎng)基購自Gibco公司。胎牛 血清(FBS)購自Hyelone公司。青/鏈霉素為上海先鋒藥業(yè)產(chǎn)品。膜蛋白酶購自華美生物工程 公司。二甲基亞諷(DMS0)購自上海華舜生物工程公司。瓊脂(Agarose)、二硫蘇糖醇(DTT)、 苯甲基橫獻(xiàn)氣(PMSF)、四甲基乙二胺(TEMED)為Sigma公司產(chǎn)品。十二烷基橫酸鋼(S化）、Ξ 氯甲基烷基甲燒（T;ris)T;ris-Hcl、T;ritonx-100為Promega公司產(chǎn)品。丙締獻(xiàn)胺、過硫酸錢 (AP)購于蘇州化學(xué)試劑廠產(chǎn)品。
[0024] 0)2細(xì)胞培養(yǎng)箱(ShellLab)，倒置相差顯微鏡(化kon)，超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備 廠），流式細(xì)胞儀（BD)，F(xiàn)039300A型酶標(biāo)儀（Sunrise)，高壓蒸汽滅菌器(；Hirayama HA- 300MD)，低溫超速離屯、機(jī)化ubota 3740)，萬向搖床(江蘇牒麟醫(yī)用儀器廠TS