本發(fā)明屬于藥物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及從裸花紫珠的干燥地上部分中分離得到的一種新的半日花烷型二萜類化合物及其制備方法和醫(yī)藥用途。

背景技術(shù)：

裸花紫珠Callicarpa nudiflora Hook.et Arn.為馬鞭草科紫珠屬植物，生于平地至海拔1200m的山坡、路旁、谷地、溪邊或灌木林叢中，在年平均溫度15～25℃、濕度較大的環(huán)境生長(zhǎng)良好，國(guó)內(nèi)主要分布于廣東、廣西、海南等地，在海南產(chǎn)于定安、儋州、澄邁、白沙、昌江、東方、三亞、陵水、保亭、瓊中等地，其中以海南五指山的為上品；國(guó)外主要分布于印度、中南半島、馬來半島及新加坡等。

裸花紫珠藥用部位為地上干燥部分，是一種海南大宗性地道藥材，同時(shí)也是海南黎族醫(yī)生常用藥材之一。裸花紫珠全年均可采收，除去雜質(zhì)，曬干，枝葉有抗菌止血、消炎解毒、散瘀消腫、驅(qū)風(fēng)祛濕之功效，主治化膿性炎癥、急性傳染性肝炎、呼吸道及消化道出血、創(chuàng)傷出血等癥，外用治燒、燙傷及外傷出血等。

近年來，國(guó)內(nèi)外對(duì)裸花紫珠化學(xué)成分的研究報(bào)道較少，從中分離的成分主要有黃酮類、萜類、揮發(fā)油和酚類等。裸花紫珠中黃酮類化合物主要有木犀草素及其配糖體。裸花紫珠所含萜類化合物主要有：環(huán)烯醚萜類化合物，二萜類化合物和三萜類化合物等。

裸花紫珠的藥理活性有止血、抗炎、抑菌、細(xì)胞毒活性、增強(qiáng)免疫等。我國(guó)醫(yī)藥市場(chǎng)上有裸花紫珠片、裸花紫珠栓劑等制劑，在皮膚科、婦科炎癥的治療和術(shù)后止血等方面具有較好的治療效果。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種從裸花紫珠的干燥地上部分中分離得到的一種新的半日花烷型二萜類化合物及其制備方法和醫(yī)藥用途。

本發(fā)明的上述目的是通過下面的技術(shù)方案得以實(shí)現(xiàn)的：

一種新的半日花烷型二萜化合物，其特征在于：所述化合物具有下述結(jié)構(gòu)式，

所述的化合物的制備方法，包含以下操作步驟：(a)將裸花紫珠的干燥地上部分粉碎，用70～80％乙醇熱回流提取，合并提取液，濃縮至無醇味，依次用石油醚、乙酸乙酯和水飽和的正丁醇萃取，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；(b)步驟(a)中乙酸乙酯萃取物用大孔樹脂除雜，先用10％乙醇洗脫8個(gè)柱體積，再用80％乙醇洗脫10個(gè)柱體積，收集80％乙醇洗脫液，減壓濃縮得80％乙醇洗脫物浸膏；(c)步驟(b)中80％乙醇洗脫浸膏用正相硅膠分離，依次用體積比為75:1、45:1、25:1、15:1和1:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到5個(gè)組分；(d)步驟(c)中組分4用正相硅膠進(jìn)一步分離，依次用體積比為20:1、15:1和8:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到3個(gè)組分；(e)步驟(d)中組分2用十八烷基硅烷鍵合的反相硅膠分離，用體積百分濃度為70％的甲醇水溶液等度洗脫，收集10～12個(gè)柱體積洗脫液，洗脫液減壓濃縮得到純的化合物。

進(jìn)一步地，所述大孔樹脂為D101大孔吸附樹脂。

進(jìn)一步地，所述用乙醇熱回流提取采用的乙醇濃度為75％。

一種藥物組合物，其中含有治療有效量的所述的化合物和藥學(xué)上可接受的載體。

所述的化合物在制備治療胰腺癌的藥物中的應(yīng)用。

所述的藥物組合物在制備治療胰腺癌的藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明化合物用作藥物時(shí)，可以直接使用，或者以藥物組合物的形式使用。

該藥物組合物含有治療有效量的本發(fā)明化合物，其余為藥物學(xué)上可接受的、對(duì)人和動(dòng)物無毒和惰性的可藥用載體和/或賦形劑。

所述的可藥用載體或賦形劑是一種或多種選自固體、半固體和液體稀釋劑、填料以及藥物制品輔劑。將本發(fā)明的藥物組合物以單位體重服用量的形式使用。本發(fā)明藥物可通過口服或注射的形式施用于需要治療的患者。用于口服時(shí)，可將其制成片劑、緩釋片、控釋片、膠囊、滴丸、微丸、混懸劑、乳劑、散劑或顆粒劑、口服液等；用于注射時(shí)，可制成滅菌的水性或油性溶液、無菌粉針、脂質(zhì)體或乳劑等。

附圖說明

圖1為一種新的半日花烷型二萜化合物的結(jié)構(gòu)式；

圖2為一種新的半日花烷型二萜化合物的理論ECD值與實(shí)驗(yàn)ECD值比較。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性內(nèi)容，但并不以此限定本發(fā)明保護(hù)范圍。盡管參照較佳實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實(shí)質(zhì)和范圍。

實(shí)施例1：一種新的半日花烷型二萜化合物分離制備及結(jié)構(gòu)確證

試劑來源：乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、二氯甲烷為分析純，購(gòu)自上海凌峰化學(xué)試劑有限公司，甲醇，分析純，購(gòu)自江蘇漢邦化學(xué)試劑有限公司。

制備方法：(a)將裸花紫珠的干燥地上部分(10kg)粉碎，用75％乙醇熱回流提取(25L×3次)，合并提取液，濃縮至無醇味(3L)，依次用石油醚(3L×3次)、乙酸乙酯(3L×3次)和水飽和的正丁醇(3L×3次)萃取，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物(431g)和正丁醇萃取物；(b)步驟(a)中乙酸乙酯萃取物用D101大孔樹脂除雜，先用10％乙醇洗脫8個(gè)柱體積，再用80％乙醇洗脫10個(gè)柱體積，收集80％乙醇洗脫液，減壓濃縮得80％乙醇洗脫物浸膏(161g)；(c)步驟(b)中80％乙醇洗脫浸膏用正相硅膠分離，依次用體積比為75:1(8個(gè)柱體積)、45:1(8個(gè)柱體積)、25:1(8個(gè)柱體積)、15:1(10個(gè)柱體積)和1:1(5個(gè)柱體積)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到5個(gè)組分；(d)步驟(c)中組分4(52g)用正相硅膠進(jìn)一步分離，依次用體積比為20:1(8個(gè)柱體積)、15:1(10個(gè)柱體積)和8:1(8個(gè)柱體積)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到3個(gè)組分；(e)步驟(d)中組分2(26g)用十八烷基硅烷鍵合的反相硅膠分離，用體積百分濃度為70％的甲醇水溶液等度洗脫，收集10-12個(gè)柱體積洗脫液，洗脫液減壓濃縮得到純的化合物(237mg)。

結(jié)構(gòu)確證：白色粉末；HR-ESIMS顯示[M+Na]⁺為m/z 389.2708，結(jié)合核磁特征可得分子式為C₂₂H₃₈O₄，不飽和度為4。核磁共振氫譜數(shù)據(jù)δ_H(ppm，DMSO-d₆，500MHz)：H-1(1.21，m)，H-1(1.57，dt，J＝13.5，5.0)，H-2(1.31，m)，H-2(1.46，m)，H-3(1.11，m)，H-3(1.35，m)，H-5(0.91，d，J＝11.6)，H-6(1.23，m)，H-6(1.59，m)，H-7(1.37，m)，H-7(1.78，dt，J＝12.8，4.3)，H-9(1.07，m)，H-11(1.18，m)，H-11(1.36，m)，H-12(1.27，m)，H-12(1.43，m)，H-14(2.95，br，d，J＝6.8)，H-15(4.05，dd，J＝11.5，8.6)，H-15(4.26，dd，J＝11.5，2.5)，H-16(1.14，s)，H-17(1.10，s)，H-18(0.87，s)，H-19(0.87，s)，H-20(0.81，s)，15-OAc(2.02，s)；核磁共振碳譜數(shù)據(jù)δ_C(ppm，DMSO-d₆，125MHz)：39.4(CH₂，1-C)，18.7(CH₂，2-C)，41.2(CH₂，3-C)，32.6(C，4-C)，55.7(CH，5-C)，19.8(CH₂，6-C)，43.4(CH₂，7-C)，75.3(C，8-C)，61.1(CH，9-C)，38.5(C，10-C)，18.7(CH₂，11-C)，38.3(CH₂，12-C)，64.3(C，13-C)，61.7(CH，14-C)，62.4(CH₂，15-C)，22.1(CH₃，16-C)，24.6(CH₃，17-C)，32.2(CH₃，18-C)，21.1(CH₃，19-C)，15.8(CH₃，20-C)，170.8(C，15-OAC)，20.7(CH₃，15-OAC)；碳原子標(biāo)記參見圖1。紅外光譜表明該化合物含有羥基和酯基(3421cm^-1和1738cm^-1)。¹H-NMR譜顯示了五個(gè)甲基信號(hào)δH0.81(s，H₃-20)，0.87(s，H₃-18)，0.87(s，H₃-19)，1.10(s，H₃-17)和1.14(s，H₃-16)，一個(gè)乙酰氧基δH2.02(3H，s)，一個(gè)含氧亞甲基信號(hào)δH4.05(dd，J＝11.5，8.6Hz，H-15)和4.26(dd，J＝11.5，2.5Hz，H-15)，一個(gè)含氧次甲基信號(hào)δH2.95(br，d，J＝6.8Hz，H-14)。此外，¹³C-NMR譜顯示出22個(gè)碳信號(hào)，包括六個(gè)甲基(一個(gè)甲氧基)，八個(gè)亞甲基(一個(gè)含氧亞甲基)，三個(gè)次甲基(一個(gè)含氧次甲基)，以及五個(gè)季碳(一個(gè)羰基碳，兩個(gè)含氧季碳)。兩個(gè)含氧碳信號(hào)(δC61.7和64.3)，及含氧次甲基信號(hào)(δH2.95)表明該化合物含有一個(gè)13,14-環(huán)氧基團(tuán)。HMBC譜中H₂-15(δH4.05和4.26)和甲基質(zhì)子信號(hào)(δH2.02)與羰基碳(δC170.8)的相關(guān)性表明乙酰氧基位于C-15位。NOESY譜中，Me-20(δH0.81)，Me-17(δH1.10)與H-11β(δH1.36)；H-11β，Me-16(δH1.14)與Me-17；以及Me-17與H-7β(δH1.78)的相關(guān)性表明Me-17，Me-20和Me-16為β構(gòu)型。綜合氫譜、碳譜、H MBC譜和NOESY譜，以及文獻(xiàn)關(guān)于相關(guān)類型核磁數(shù)據(jù)，可基本確定該化合物如圖1所示，立體構(gòu)型進(jìn)一步通過ECD試驗(yàn)確定，理論值與實(shí)驗(yàn)值基本一致(圖2)。

實(shí)施例2：一種新的半日花烷型二萜化合物藥理作用試驗(yàn)

一、材料和儀器

人胰腺癌MiaPaCa-2細(xì)胞由天津醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所惠贈(zèng)?；衔镒灾?，HPLC歸一化純度大于98％。FBS、胰蛋白酶-EDTA消化液購(gòu)于美國(guó)Hyclone公司。PBS粉購(gòu)于天津潤(rùn)泰科技發(fā)展有限公司。DMEM低糖培養(yǎng)液購(gòu)于美國(guó)Gibco公司。MTT購(gòu)于美國(guó)Sigam公司。DMSO購(gòu)于北京化工廠。注射用青霉素鈉購(gòu)于哈藥集團(tuán)制藥總廠。注射用硫酸鏈霉素購(gòu)于大連美羅大藥廠。

超凈工作臺(tái)、細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo公司)，4℃冰箱、-20℃冰箱(山東青島海爾公司)，-80℃冰箱(FormaScientific)，電熱鼓風(fēng)干燥箱(天津?qū)嶒?yàn)儀器廠)，光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司)，倒置相差顯微鏡(德國(guó)leica公司)，超速低溫離心機(jī)(日本日立公司)，酶標(biāo)儀(上?？迫A生物工程股份有限公司)，E-Centrifuge(Wealtec)，微量加樣器(德國(guó)Eppendorf)，電子恒溫水浴鍋(余姚市東方電工儀器廠)，高壓滅菌鍋(山東新華醫(yī)療器械有限公司)，電子天平(上海天平儀器廠)。

二、試驗(yàn)方法

1、細(xì)胞培養(yǎng)：

(1)常氧培養(yǎng)：將人胰腺癌MiaPaCa-2細(xì)胞放入5％CO₂、37℃、飽和濕度的CO₂孵箱中貼壁培養(yǎng)，適時(shí)換培養(yǎng)液，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)融合至80％～90％時(shí)傳代。

(2)缺氧培養(yǎng)：將人胰腺癌MiaPaCa-2細(xì)胞放在5％CO₂、94％N₂、1％O₂、37℃、飽和濕度的缺氧小室中培養(yǎng)。缺氧小室建立：缺氧裝置為可調(diào)式培養(yǎng)容器，有一進(jìn)氣孔和一出氣孔。實(shí)驗(yàn)時(shí)，將缺氧培養(yǎng)的細(xì)胞放入可調(diào)式培養(yǎng)容器內(nèi)，由進(jìn)氣孔充入低氧混合氣體(5％CO₂+95％N₂+1％O₂)，測(cè)得小室內(nèi)氧氣濃度維持在1％后密閉，移入細(xì)胞培養(yǎng)箱中，37℃培養(yǎng)。每24h再?zèng)_氣和換氣一次后置37℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，分別在24h、48h、72h后收集各組細(xì)胞，用于MTT實(shí)驗(yàn)。

2、細(xì)胞增殖的檢測(cè)

(1)收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期MiaPaCa-2細(xì)胞，制備成單細(xì)胞懸液進(jìn)行計(jì)數(shù)，調(diào)整濃度以每孔5×l0³個(gè)細(xì)胞接種96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔總體積100μL(邊緣孔用同體積的無菌PBS填充)，于5％CO₂、37℃、飽和濕度的CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞形成單層后棄上清給予不同濃度化合物處理。

(2)分空白對(duì)照組(不加藥物處理的等體積培養(yǎng)液)和化合物藥物20μmol/L、40μmol/L、80μmol/L)，每組設(shè)6個(gè)平行孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，置入37℃，5％CO₂、94％N₂、1％O₂的缺氧小室中分別培養(yǎng)24h、48h、72h。

(3)用PBS輕輕沖洗96孔細(xì)胞培養(yǎng)板2次后，每孔加入l0μL MTT(5mg/mL)，繼續(xù)培養(yǎng)4h后離心棄上清，每孔加入15μL的DMSO，放在搖床上振蕩15min，使結(jié)晶物充分溶解。

(4)酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀于570nm處測(cè)量各孔的吸光度值(A值)，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。

(5)抑制率(％)＝(空白對(duì)照組平均A值-藥物組平均A值)/空白對(duì)照組平均A值×100％。

(6)以濃度為橫軸，抑制率(％)為縱軸繪制抑制率直方圖。

3、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料計(jì)量資料符合正態(tài)分布的，以均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差表示，均數(shù)間比較采用單因素方差分析或t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

三、結(jié)果及結(jié)論

MTT結(jié)果顯示：(1)一種新的半日花烷型二萜化合物干預(yù)人胰腺癌MiaPaCa-2細(xì)胞同等時(shí)間(24h、48h、72h)時(shí)，隨著化合物濃度(在實(shí)驗(yàn)濃度范圍間內(nèi))的增加，其所對(duì)應(yīng)的OD值越小，表明在缺氧條件下化合物對(duì)人胰腺癌MiaPaCa-2細(xì)胞干預(yù)時(shí)間相同時(shí)，隨著藥物濃度的增加，細(xì)胞存活率降低。結(jié)果見表1(注：^aP<0.01VS對(duì)照組；^bP<0.01VS 20μmol/L組；^cP<0.01VS 40μmol/L組)。

(2)不同濃度的(20μmol/L、40μmol/L、80μmol/L)化合物干預(yù)人胰腺癌MiaPaCa-2細(xì)胞48h后，不同濃度作用下細(xì)胞增殖抑制率分別為(20.13±0.80)％、(34.83±0.66)％、(45.68±1.45)％，抑制率隨藥物濃度增加呈上升趨勢(shì)，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。80μmol/L的化合物干預(yù)胰腺癌MiaPaCa-2細(xì)胞24h、48h、72h后，MiaPaCa-2細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率分別為(38.78±0.92)％、(45.68±1.45)％、(55.95±2.20)％，呈時(shí)間依賴性增高，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果見表2(注：^aP<0.01VS對(duì)照組；^bP<0.01VS 20μmol/L組；^cP<0.01VS 40μmol/L組)。

結(jié)論，化合物對(duì)缺氧培養(yǎng)條件下人胰腺癌MiaPaCa-2細(xì)胞有明顯的增殖抑制作用，隨著化合物濃度的增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，抑制作用愈明顯，即在一定濃度范圍內(nèi)存在時(shí)間——?jiǎng)┝恳蕾囆?。這可能成為胰腺癌治療的另一新思路。

表1化合物對(duì)人胰腺癌MiaPaCa-2細(xì)胞生長(zhǎng)的影響(n＝6，)

表2化合物對(duì)人胰腺癌MiaPaCa-2細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率的影響(n＝6，)

實(shí)施例3

片劑的制備：按實(shí)施例1方法先制得化合物，以及利用有機(jī)酸如酒石酸、或檸檬酸或甲酸或乙二酸等、無機(jī)酸如鹽酸或硫酸或磷酸制成的鹽，按其與賦形劑重量比為1:7的比例加入賦形劑，制粒壓片。

實(shí)施例4

口服液制備：按實(shí)施例1方法先制得化合物，以及利用有機(jī)酸如酒石酸、或檸檬酸或甲酸或乙二酸等、無機(jī)酸如鹽酸或硫酸或磷酸制成的鹽，按常規(guī)口服液制法制成口服液。

實(shí)施例5

膠囊劑或顆粒劑的制備：按實(shí)施例1方法先制得化合物，以及利用有機(jī)酸如酒石酸、或檸檬酸或甲酸或乙二酸等、無機(jī)酸如鹽酸或硫酸或磷酸制成的鹽，按其與賦形劑重量比為1:7的比例加入賦形劑，制成膠囊或顆粒劑。

實(shí)施例6

注射液的制備：按實(shí)施例1方法先制得化合物，以及利用有機(jī)酸如酒石酸、或檸檬酸或甲酸或乙二酸等、無機(jī)酸如鹽酸或硫酸或磷酸制成的鹽，按常規(guī)加注射用水，精濾，灌封滅菌制成注射液。

實(shí)施例7

無菌粉針的制備：按實(shí)施例1方法先制得化合物，以及利用有機(jī)酸如酒石酸、或檸檬酸或甲酸或乙二酸等、無機(jī)酸如鹽酸或硫酸或磷酸制成的鹽，將其溶于無菌注射用水中，攪拌使溶，用無菌抽濾漏斗過濾，再無菌精濾，分裝于安瓿中，低溫冷凍干燥后無菌熔封得粉針劑。

上述實(shí)施例的作用在于說明本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性內(nèi)容，但并不以此限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實(shí)質(zhì)和保護(hù)范圍。