本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及疏葉崖豆葉子中的查耳烷類化合物及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

疏葉崖豆(Millettia pulchra Kurz var-laxior(Dunn)Z.Wei)是豆科(Leguminosae)崖豆藤屬(Millettia)植物。崖豆藤屬植物在我國有40種，主要分布于廣西、廣東、云南等地。

疏葉崖豆的干燥根又稱為玉郎傘、龍眼參等，壯語稱其為“捧吞”(廣西靖西)、“肥藥”(那坡)等；瑤醫(yī)稱其為“莽臺”(人薯)、“木茯苓”(廣西金秀)、“土茯神”(廣西巴馬)。具有補虛潤肺、舒筋活絡(luò)的功能，民間常用于高血壓、跌打損傷、腰腿痛、風(fēng)濕痛、慢性肝炎和結(jié)核的治療，也可用于消化不良、營養(yǎng)不良和病后虛弱，還可以用于治療再生障礙性貧血等。此外，本品還具有補氣、補血、提高免疫力和改善大腦學(xué)習(xí)記憶等功效?，F(xiàn)代藥理研究表明該屬植物具有抗腫瘤、保肝和抗雌性激素等多種藥理活性。

査耳酮類天然產(chǎn)物在植物中分布廣泛，具有顯著的抗癌、抗炎、抗氧化、抗菌等生物活性。同時査耳酮類化合物是天然的邁克爾反應(yīng)受體分子，參與體內(nèi)多個代謝反應(yīng)，對二相代謝酶的表達具有重要調(diào)控作用，是潛在的天然來源癌癥化學(xué)預(yù)防劑。前期研究中我們發(fā)現(xiàn)查耳酮類化合物是疏葉崖豆地上部分的主要化學(xué)成分，結(jié)構(gòu)類型豐富、含量高、且具有顯著的體外癌癥預(yù)防活性。本發(fā)明中描述了5個新查耳烷類化合物，具有顯著的醌還原酶誘導(dǎo)活性，有可能用于制備預(yù)防和治療癌癥的藥物。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一系列新的查耳烷及其制備方法和醫(yī)藥用途。具體提供了5個新的查耳烷millpuline B(1)、millpuline C(2)、millpuline D(3)、millpuline E(4)和millpuline F(5)；

本發(fā)明所提供的查耳烷化合物的結(jié)構(gòu)通式為：

(I)

其中，R₁＝H、OH、C₁-C₄烷氧基或OC_nH_2nOH(n＝1-4)；

R₂＝H、OH、C₁-C₄烷氧基或OC_nH_2nOH(n＝1-4)；

R₃＝H、OH、C₁-C₄烷氧基或OC_nH_2nOH(n＝1-4)；

R₄＝H、OH、C₁-C₄烷氧基；

R₅＝H、OH、C₁-C₄烷氧基。

本發(fā)明具體公開了如下五個具體化合物：

本發(fā)明還提供了所述新的查耳烷1～5的制備方法，該方法包括如下步驟：

(1)疏葉崖豆(Millettia pulchra Kurz var-laxior(Dunn)Z.Wei)干燥地上部分用50％～95％乙醇提取，回收提取液得粗提物；

(2)步驟(1)所得粗提物經(jīng)大孔吸附樹脂色譜法分離，以體積比為30:70～90:10乙醇-水或甲醇-水的混合溶劑梯度洗脫，得到不同極性部位的醇洗脫物；

(3)上述步驟(2)中所得的洗脫物經(jīng)硅膠柱色譜，用石油醚/乙酸乙酯，石油醚/丙酮，二氯甲烷/丙酮，二氯甲烷/甲醇，氯仿/丙酮或氯仿/甲醇的混合溶劑梯度洗脫；

(4)上述步驟(3)中所得的流分經(jīng)ODS柱色譜，用甲醇-水混合溶劑或乙腈-水混合溶劑梯度洗脫；

(5)上述步驟(4)所得流分，經(jīng)HPLC-UV色譜分離，以甲醇-水混合溶劑，或乙腈-水溶劑為流動相洗脫，得到查耳烷1～5；

本發(fā)明提供的新的查耳烷1～5的制備方法，所述的疏葉崖豆葉子為豆科(Leguminosae)崖豆藤屬(Millettia)疏葉崖豆(Millettia pulchra Kurz var-laxior(Dunn)Z.Wei)的干燥地上部分。

本發(fā)明提供的所述的新的查耳烷1～5的制備方法，步驟(1)中所述的提取方法為加熱回流或加熱超聲提取1～3次。所用溶劑為50％～95％乙醇，優(yōu)選70％～95％乙醇。藥材：溶劑的重量體積為1:8～1:20，優(yōu)選1:10～1:15。

本發(fā)明提供的所述新的查耳烷1～5的制備方法，步驟(2)中所述乙醇-水混合溶劑，或甲醇-水的混合溶劑中，混合溶劑的比例為甲醇：水或乙醇：水為30:70～90:0。

本發(fā)明提供的所述新的查耳烷1～5的制備方法，上述步驟(2)中所述的大孔樹脂吸附法，采用丙酮溶解拌樣的方法，將粗提物溶解于丙酮中(粗提物與丙酮的重量體積比W/V,1:1～1:6，優(yōu)選為1:2～1:4)得該粗提物的丙酮溶液，加入1:2～1:10(優(yōu)選1:3～1:5)倍量的大孔樹脂攪拌均勻，減壓濃縮至干。

本發(fā)明提供的所述新的查耳烷1～5的制備方法，步驟(3)中所述的石油醚/乙酸乙酯，石油醚/丙酮的混合溶劑體積比例為100:0～1:1，優(yōu)選100:2～100:10；二氯甲烷/丙酮，氯仿/丙酮的混合溶劑的體積比例為100:0～2:1，優(yōu)選100:1～100:8；二氯甲烷/甲醇，氯仿/甲醇的混合溶劑的體積比例為100:0～5:2，優(yōu)選100:1～100:5。

本發(fā)明提供的所述新的查耳烷1～5的制備方法，步驟(4)中所述的甲醇-水的混合溶劑體積比例為30:70～100:0，優(yōu)選50:50～90：10，乙腈-水的混合溶劑的體積比例為10:90～70:30，優(yōu)選20:80～60:40。

本發(fā)明提供的所述新的查耳烷1～5的制備方法，步驟(5)中所述甲醇-水的混合溶劑的體積比例為50:50～95:5，優(yōu)選70:30～90:10，乙腈-水的混合溶劑的體積比例為30:70～60:40，優(yōu)選35:75～45:55。

本發(fā)明以體外Hepa 1c1c7細胞進行了醌還原酶[NQO1,NAD(P)H quinine oxidoreductase 1]誘導(dǎo)活性測試，對制備得到的新查耳烷1～5的NQO1活性進行 了評價。結(jié)果顯示，這些新查耳烷具有顯著NQO1誘導(dǎo)活性，可用于開發(fā)癌癥化學(xué)預(yù)防劑或癌癥治療藥物。

本發(fā)明首次提供了以疏葉崖豆地上部分為原料，制備、鑒定5個新查耳烷的方法，并且系統(tǒng)評價了NQO1誘導(dǎo)方面的活性，闡述了其在開發(fā)癌癥化學(xué)預(yù)防、治療藥物方面的應(yīng)用。

附圖說明

圖1查耳烷1-5的ECD譜；

a.為查爾烷1的ECD譜；b.為查爾烷2的ECD譜；c.為查爾烷3的ECD譜；

d.為查爾烷4的ECD譜；e.為查爾烷5的ECD譜

圖2查耳烷1的¹H NMR譜；

圖3查耳烷1的¹³C NMR譜；

圖4查耳烷1的HMBC譜；

圖5查耳烷2的¹H NMR譜；

圖6查耳烷2的¹³C NMR譜；

圖7查耳烷2的HMBC譜；

圖8查耳烷3的¹H NMR譜；

圖9查耳烷3的¹³C NMR譜；

圖10查耳烷3的HMBC譜；

圖11查耳烷4的¹H NMR譜；

圖12查耳烷4的¹³C NMR譜；

圖13查耳烷4的HMBC譜；

圖14查耳烷5的¹H NMR譜；

圖15查耳烷5的¹³C NMR譜；

圖16查耳烷5的HMBC譜。

具體實施方式

下面的實施例將對本發(fā)明予以進一步的說明，但并不因此限制本發(fā)明。

實施例1

(1)疏葉崖豆干燥地上部分500g用70％乙醇提取1次(用量為10L)，減壓回收提取液的粗提物；

(2)上述步驟(1)所得70％乙醇粗提物經(jīng)大孔樹脂吸附(粗提物:丙酮＝1:1，粗提物:大孔樹脂＝1:3)，用水、30％乙醇、60％乙醇和90％乙醇梯度洗脫，得到不同極性部位的洗脫物；

(3)步驟(2)中90％乙醇洗脫物，經(jīng)硅膠柱色譜分離，依次以石油醚和乙酸乙酯混合溶劑100:0，100:3，100:8，100:10洗脫；

(4)上述步驟(3)中所得的石油醚：乙酸乙酯100:3～100:8流分經(jīng)ODS色譜，用30:70，50:50，70:30，90:10甲醇-水的混合溶劑梯度洗脫；

(5)上述步驟(4)中所得甲醇-水(50:50～90:10)流分經(jīng)HPLC-UV色譜分離制備，210nm檢測，流速為4mL/min，流動相為甲醇：水＝78:22，得到查耳烷1(t_R＝110min)(收率為0.00033％)，得到查耳烷2(t_R＝84min)(收率為0.0017％)，得到查耳烷3(t_R＝94min)(收率為0.0035％)。

(6)上述步驟(4)中所得甲醇-水(50:50～90:10)流分經(jīng)HPLC-UV色譜分離，210nm檢測，流速為4mL/min，以70:30甲醇-水的混合溶劑為流動相，得到查耳烷4(t_R＝95min)(收率為0.0004％)和5(t_R＝64min)(收率為0.0003％)。

根據(jù)查耳烷1～5的理化性質(zhì)和波譜數(shù)據(jù)鑒定了其結(jié)構(gòu)(查耳烷1～5的ECD和HMBC、HMQC及其¹H-¹HCOSY相關(guān)圖見附圖1-10)。

查耳烷1的結(jié)構(gòu)鑒定數(shù)據(jù)如下：

黃色油狀物(MeOH)，HR-ESI-MS給出準(zhǔn)分子離子峰m/z 319.1297[M+Na]⁺：(calcd.for 319.1305,C₁₉H₂₀O₃Na)，得其分子式為C₁₉H₂₀O₃，不飽和度為10。¹H NMR和¹³C NMR數(shù)據(jù)見表1和2。HMBC和¹H-¹HCOSY相關(guān)信號見圖8。該化合物的絕對構(gòu)型通過運用TDDFT(時間依賴的密度泛函理論)方法進行ECD計算確定，將實驗測出的譜圖和計算得到的α′R的ECD圖譜進行比較，圖譜相吻合，表現(xiàn)在在190-195nm區(qū)域有正Cotton效應(yīng)，在200-240nm區(qū)域有負Cotton效應(yīng)(見附圖7)。因此，確定該化合物的絕對構(gòu)型為α′R。

查耳烷2的結(jié)構(gòu)鑒定數(shù)據(jù)如下：

黃色油狀物(MeOH)，HR-ESI-MS給出準(zhǔn)分子離子峰m/z 349.1414[M+Na]⁺：(calcd for 349.1410,C₂₀H₂₂O₄Na)，給出分子式為C₂₀H₂₂O₄，不飽和度為10。采用與1相同的方法確定其絕對構(gòu)型，2的ECD實 測值與差向異構(gòu)體(α′R,βR)的計算值ECD圖譜相吻合，表現(xiàn)在210-220nm和220-240nm區(qū)域有正Cotton效應(yīng)，所以確定化合物的絕對構(gòu)型為(α′R,βR)。

查耳烷3的結(jié)構(gòu)鑒定數(shù)據(jù)如下：

黃色油狀物(MeOH)，HR-ESI-MS給出準(zhǔn)分子離子峰m/z 349.1415[M+Na]⁺：(calcd for 349.1410,C₂₀H₂₂O₄Na)，給出分子式為C₂₀H₂₂O₄，不飽和度為10。該化合物的絕對構(gòu)型采用與查耳烷1相同的ECD計算方法，查耳烷3的ECD實測值與(α′S,βR)的計算值ECD圖譜相吻合，表現(xiàn)為200-220nm區(qū)域有負Cotton效應(yīng)，225-235nm區(qū)域有正Cotton效應(yīng)，確定查耳烷3的絕對構(gòu)型為(α′S,βR)。

查耳烷4的結(jié)構(gòu)鑒定數(shù)據(jù)如下：

黃色油狀物(MeOH)，HR-ESI-MS給出準(zhǔn)分子離子峰m/z 379.1503[M+Na]⁺(cacl for 379.1516,C₂₁H₂₄O₅Na)，推測出分子式為C₂₁H₂₄O₅，不飽和度為10。該化合物的絕對構(gòu)型采用與查耳烷1相同的ECD計算方法，查耳烷4的ECD實測值與(α′R,βR)的計算值ECD圖譜相吻合，表現(xiàn)為180-190nm和195-205nm區(qū)域有負Cotton效應(yīng)，220-250nm區(qū)域有正Cotton效應(yīng)。因此確定查耳烷4的絕對構(gòu)型為(α′R,βR)。

查耳烷5的結(jié)構(gòu)鑒定數(shù)據(jù)如下：

黃色油狀物(MeOH)，HR-ESI-MS給出準(zhǔn)分子離子峰m/z 379.1517[M+Na]⁺(cacl for 379.1516)，推測出分子式為C₂₁H₂₄O₅Na，不飽和度為10。該化合物的絕對構(gòu)型采用與查耳烷1相同的ECD計算方法，查耳烷5的ECD實測值與(α′S,βR)的計算值ECD圖譜相吻合，表現(xiàn)為205-215nm和220-230nm區(qū)域有正Cotton效應(yīng)，180-190nm和195-205nm區(qū)域有負Cotton效應(yīng)，所以查耳烷5的絕對構(gòu)型為(α′S,βR)。

查耳烷1～5的NMR數(shù)據(jù)歸屬見表1和2

表1查耳烷1～5的¹H NMR(400MHz,CDCl₃)數(shù)據(jù)

表2查耳烷1～5的¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)數(shù)據(jù)

實施例2

(1)疏葉崖豆葉子1000g用95％乙醇提取3次(用量為8L)，減壓回收提取液的粗提物；

(2)上述步驟(1)中所得乙醇粗提物經(jīng)大孔樹脂吸附(丙酮：粗提物＝1:2，粗提物:大孔樹脂＝1:5)，用50％乙醇和90％乙醇梯度洗脫，得到不同極性部位的洗脫物；

(3)上述步驟(2)中90％乙醇洗脫物，經(jīng)硅膠柱色譜分離，依次以石油醚和丙酮混合溶劑100:2，100:3，100:5，100:8，100:10洗脫；

(4)上述步驟(2)中所得的石油醚：丙酮100:2～100:10流分經(jīng)ODS色譜，用10:90，30:70，50:50，70:30乙腈-水的混合溶劑梯度洗脫；

(5)上述步驟(4)中所得乙腈-水(50:50)流分經(jīng)HPLC-UV色譜分離制備，210nm檢測，流速為4mL/min，流動相為乙腈：水＝40:60，得到查耳烷1(t_R＝100min)(收率為0.00038％)，得到查耳烷2(t_R＝75min)(收率為0.0019％)，得到查耳烷3(t_R＝89min)(收率為0.0037％)。

(6)上述步驟(4)中所得乙腈-水(70:30)流分經(jīng)HPLC-UV色譜分離，210nm檢測，流速為4mL/min，以35:65乙腈-水的混合溶劑為流動相，得到查耳烷4(t_R＝90min)(收率為0.0004％)和5(t_R＝59min)(收率為0.0003％)。實施例3

(1)疏葉崖豆葉子800g用50％乙醇提取2次(用量為9.6L)，減壓回收提取液的粗提物；

(2)上述步驟(1)所得乙醇粗提物經(jīng)大孔樹脂吸附(粗提物:丙酮＝1:6，粗提物:大孔樹脂＝1:10)，用30％乙醇、50％乙醇和80％乙醇梯度洗脫，得到不同極性部位的洗脫物；

(3)步驟(2)中80％乙醇洗脫物，經(jīng)硅膠柱色譜分離，依次以二氯甲烷：丙酮混合溶劑100:1，100:3，100:5，100:8洗脫；

(4)上述步驟(3)中所得的二氯甲烷：丙酮100:3～100:8流分經(jīng)ODS色譜，用50:50，70:30，90:10甲醇-水的混合溶劑梯度洗脫；

(5)上述步驟(4)中所得甲醇-水(90:10)流分經(jīng)HPLC-UV色譜分離制備，210nm檢測，流速為4mL/min，流動相為甲醇：水＝82：18，得到查耳烷1 (t_R＝101min)(收率為0.00035％)，得到查耳烷2(t_R＝76min)(收率為0.0014％)，得到查耳烷3(t_R＝93min)(收率為0.0032％)。

(6)上述步驟(4)中所得甲醇-水(70:30)流分經(jīng)HPLC-UV色譜分離，210nm檢測，流速為4mL/min，以甲醇-水(77:23)的混合溶劑為流動相，得到查耳烷4(t_R＝65min)(收率為0.00037％)和5(t_R＝50min)(收率為0.00029％)。實施例4

(1)疏葉崖豆葉子1200g用75％乙醇提取2次(用量為18L)，減壓回收提取液的粗提物；

(2)上述步驟(1)所得乙醇粗提物經(jīng)大孔樹脂吸附(粗提物:丙酮＝1:4，粗提物:大孔樹脂＝1:2)，用35％和75％乙醇-水的混合溶劑梯度洗脫，得到不同極性部位的乙醇洗脫物；

(3)步驟(2)中75％乙醇洗脫物，經(jīng)硅膠柱色譜分離，依次以二氯甲烷/甲醇混合溶劑100:1，100:3，100:5，100:8，100:10，3:1洗脫；

(4)上述步驟(2)中所得的二氯甲烷：甲醇100:1～100:5流分經(jīng)ODS色譜，用30:70，50:50，90:10甲醇-水的混合溶劑梯度洗脫；

(5)上述步驟(4)中所得甲醇-水(90:10)流分經(jīng)HPLC-UV色譜分離制備，210nm檢測，流速為4mL/min，流動相為乙腈：水＝42:58，得到查耳烷1(t_R＝92min)(收率為0.00030％)，得到查爾烷2(t_R＝69min)(收率為0.0020％)，得到查耳烷3(t_R＝80min)(收率為0.0031％)。

(6)上述步驟(4)中所得甲醇-水(50:50)流分經(jīng)HPLC-UV色譜分離，210nm檢測，流速為4mL/min，以36:64乙腈-水的混合溶劑為流動相，得到查耳烷4(t_R＝85min)(收率為0.00038％)和5(t_R＝55min)(收率為0.00027％)。實施例5

(1)疏葉崖豆葉子600g用80％乙醇提取3次(用量為10L)，減壓回收提取液的粗提物；

(2)上述步驟(1)所得乙醇粗提物經(jīng)大孔樹脂吸附(粗提物:丙酮＝1:5，粗提物:大孔樹脂＝1:10)，用30％、60％和90％甲醇-水的混合溶劑梯度洗脫，得到不同極性部位的甲醇洗脫物；

(3)步驟(2)中90％甲醇洗脫物，經(jīng)硅膠柱色譜分離，依次以氯仿/丙酮混合溶劑100:1，100:2，100:3，100:5，100:6，100:8，100:10，3:1梯度洗脫；

(4)上述步驟(2)中所得的氯仿：丙酮100:3～100:8流分經(jīng)ODS色譜，用5:95，15:85，25:75，35:65，40:60，45:55，60:40乙腈-水的混合溶劑梯度洗脫；

(5)上述步驟(4)中所得乙腈-水(40:60)流分經(jīng)HPLC-UV色譜分離制備，210nm檢測，流速為4mL/min，流動相為乙腈：水＝45:55，得到查耳烷1(t_R＝89min)(收率為0.00029％)，得到查爾烷2(t_R＝65min)(收率為0.0025％)，得到查耳烷3(t_R＝75min)(收率為0.0030％)。

(6)上述步驟(4)中所得乙腈-水(35:65)流分經(jīng)HPLC-UV色譜分離，210nm檢測，流速為4mL/min，以40:60乙腈-水的混合溶劑為流動相，得到查耳烷4(t_R＝75min)(收率為0.00035％)和5(t_R＝48min)(收率為0.00024％)。實施例6

(1)疏葉崖豆葉子300g用,65％乙醇提取2次(用量為3L)，減壓回收提取液的粗提物；

(2)上述步驟(1)所得乙醇粗提物經(jīng)大孔樹脂吸附(粗提物:丙酮＝1:4，粗提物:大孔樹脂＝1:8)，用30％、50％和70％和90％乙醇-水的混合溶劑梯度洗脫，得到不同極性部位的乙醇洗脫物；

(3)步驟(2)中90％乙醇洗脫物，經(jīng)硅膠柱色譜，依次以氯仿/甲醇混合溶劑100:0，100:1，100:3，100:5，100:10，5:2梯度洗脫；

(4)上述步驟(2)中所得的氯仿/甲醇100:1～100:5流分經(jīng)ODS色譜，用20:80，30:70，50:50，60:40乙腈-水的混合溶劑梯度洗脫；

(5)上述步驟(4)中所得乙腈-水(60:40)流分經(jīng)HPLC-UV色譜分離制備，210nm檢測，流速為4mL/min，流動相為甲醇：水＝90:10，得到查耳烷1(t_R＝88min)(收率為0.00029％)，得到查爾烷2(t_R＝63min)(收率為0.0025％)，得到查耳烷3(t_R＝72min)(收率為0.0030％)。

(6)上述步驟(4)中所得乙腈-水(60:40)流分經(jīng)HPLC-UV色譜分離，210nm檢測，流速為4mL/min，以72:28甲醇-水的混合溶劑為流動相，得到查耳烷4(t_R＝88min)(收率為0.00035％)和5(t_R＝57min)(收率為0.00024％)。 實施例7實施例1中制備所得新查耳烷1-5的醌還原酶誘導(dǎo)活性研究

(1)實驗原理

鼠肝癌細胞系Hepa lclc7細胞可用于簡單測NQO1的誘導(dǎo)活性。當(dāng)存在NADP時，葡萄糖-6-磷酸可以被葡萄糖-6-磷酸脫氫酶分解，產(chǎn)生NADPH，其可以作為電子供體，使甲萘醌變?yōu)榧纵翚漉?。甲萘氫醌可以使MTT轉(zhuǎn)變?yōu)榧着H(formazan)，在550nm下用于定量測定。

(2)實驗方法

將Hepa lclc7細胞養(yǎng)于96孔板中，當(dāng)細胞長滿80％時給藥。給藥培養(yǎng)24h后，棄去培養(yǎng)基，每孔加入50μL細胞裂解液(0.8％w/v洋地黃皂苷，含2mM EDTA)。振搖裂解10min后加入200μL現(xiàn)配的“完全反應(yīng)液”(40mL反應(yīng)液組成：2mL0.5M Tris-HCL(PH 7.4)，0.27mL1.5％Tween-20，0.027mL 7.5mLflavin adenine dinucletide，0.27mL150Mm 6-磷酸葡萄糖，0.024mL50mM NADP，26.7mg牛血清白蛋白，12mg的MTT，0.04mLof 50mM甲苯醌，80units葡萄糖-6-磷酸脫氫酶，加去離子水補充至40mL)。搖勻，5min后，酶標(biāo)儀550nm下測定吸光值。

將樣品儲備液溶于DMSO中，給藥時DMSO濃度保持在0.5％(v/v)。4'-溴黃酮(終濃度4μM)與DMSO分別作為陽性與陰性對照，兩者DMSO濃度均保持為0.5％(v/v)。計算IR值(相對于陰性水平的NQO1誘導(dǎo)倍數(shù))與CD值(NQO1誘導(dǎo)活性二倍于陰性水平時的給藥濃度)作為NQO1誘導(dǎo)活性。

(3)實驗結(jié)果

實驗結(jié)果見表3

表3化合物1～5的細胞毒活性和NQO1誘導(dǎo)活性(濃度10μM)