本發(fā)明涉及植物化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種愈創(chuàng)木烷型倍半萜化合物及其制備方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)：
瓜馥木(Fissistigmaoldhamii(Hemsl.)Merr.)，別名小香花藤、藤龍眼、降香藤，是番荔枝科(Annonaceae)瓜馥木屬植物。該植物可做藥用，莖、葉可以治骨折水腫，全株可以治療風(fēng)濕骨痛、手足麻木等。從瓜馥木分離得到的愈創(chuàng)木烷型倍半萜類(lèi)化合物未見(jiàn)報(bào)道，也未見(jiàn)該類(lèi)化合物在抑制類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜細(xì)胞增殖中的應(yīng)用中的報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種從瓜馥木中提取分離的愈創(chuàng)木烷型倍半萜化合物。本發(fā)明解決的技術(shù)問(wèn)題是提供上述愈創(chuàng)木烷型倍半萜化合物的制備方法。本發(fā)明最后要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供上述愈創(chuàng)木烷型倍半萜化合物的應(yīng)用。為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：一種愈創(chuàng)木烷型倍半萜化合物，其結(jié)構(gòu)通式如下：其中R1、R2、R3、R4分別獨(dú)立選自為-OH或-CH2OH或-CH3或-H。上述愈創(chuàng)木烷型倍半萜化合物，優(yōu)選結(jié)構(gòu)式如下：上述優(yōu)選愈創(chuàng)木烷型倍半萜化合物的制備方法，它包括如下步驟：(1)制備瓜馥木提取物將瓜馥木干燥的莖用30～95％v/v的乙醇冷浸或者是熱提，得到提取液，減壓濃縮成膏狀，即為瓜馥木提取物；(2)分離純化將上述瓜馥木提取物用水稀釋制成懸浮液后，依次用石油醚、乙酸乙酯進(jìn)行萃取，將乙酸乙酯萃取液濃縮成浸膏，經(jīng)柱層析、薄層層析、分子篩層析分離得到，該化合物為新化合物且命名為FissistigmaterpeneA。步驟(1)中，減壓濃縮，溫度為30～70℃，壓力為-0.06～-0.15MPa，優(yōu)選溫度為45℃，優(yōu)選壓力為-0.095MPa。步驟(2)中，所述濃縮，溫度為30～70℃，壓力為-0.06～-0.15MPa，優(yōu)選溫度為45℃，優(yōu)選壓力為-0.095MPa。步驟(2)中，柱層析的條件為：用200～300目硅膠上柱，乙酸乙酯體積百分?jǐn)?shù)為20％的乙酸乙酯-石油醚混合溶劑為洗脫劑。步驟(2)中，薄層層析條件為：以乙酸乙酯體積百分?jǐn)?shù)為25％的乙酸乙酯-石油醚混合溶劑為展開(kāi)劑。步驟(2)中，分子篩層析條件為：分子篩為SephadexLH-20，以氯仿體積百分?jǐn)?shù)為40％的氯仿-甲醇混合溶劑為洗脫劑。上述愈創(chuàng)木烷型倍半萜化合物在制備抗類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎藥物中的應(yīng)用也在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。上述愈創(chuàng)木烷型倍半萜化合物在制備抑制類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用也在本發(fā)明的保護(hù)范圍之類(lèi)。其中，所述的滑膜細(xì)胞為原代大鼠滑膜細(xì)胞。有益效果：本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)了愈創(chuàng)木烷型倍半萜化合物在抑制類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜細(xì)胞增殖中的活性，可用于制備抗類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的藥物。具體實(shí)施方式根據(jù)下述實(shí)施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實(shí)施例所描述的內(nèi)容僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會(huì)限制權(quán)利要求書(shū)中所詳細(xì)描述的本發(fā)明。實(shí)施例1：倍半萜類(lèi)化合物的制備。瓜馥木干燥的莖10Kg按常規(guī)用75％v/v的乙醇浸提3次每次7天，得到提取液，將提取液減壓濃縮成膏狀，得到瓜馥木提取物1200g。將提取物用蒸餾水(3L)稀釋成懸浮液，依次用石油醚(3L×3次)、乙酸乙酯萃取(3L×3次)，將乙酸乙酯萃取液濃縮成浸膏(約250g)，進(jìn)行硅膠柱層析，以石油醚-乙酸乙酯混合溶劑(100:0―0:100,V/V)及乙酸乙酯-甲醇(100:0―0:100,V/V)按極性遞增進(jìn)行硅膠柱層析，并按每次約400mL收集餾分。通過(guò)TLC檢測(cè)合并相似流分分成8個(gè)組分，即Fr.1―8。Fr.3用200～300目硅膠上柱，乙酸乙酯體積百分?jǐn)?shù)為20％的乙酸乙酯-石油醚混合溶劑為洗脫劑進(jìn)行洗脫，以乙酸乙酯體積百分?jǐn)?shù)為25％的乙酸乙酯-石油醚混合溶劑為展開(kāi)劑進(jìn)行薄層層析，根據(jù)層析效果合并流分得到3個(gè)組分Fr.3-1,Fr.3-2以及Fr.3-3。Fr.3-2以氯仿體積百分?jǐn)?shù)為40％的氯仿-甲醇混合溶劑為洗脫劑進(jìn)行分子篩SephadexLH-20柱層析除去色素后得到組分Fr.3-2-1，F(xiàn)r.3-2-1用高效液相進(jìn)行分析制備，洗脫劑為乙腈和水其體積配比為2:3得到愈創(chuàng)木烷型倍半萜化合物FissistigmaterpeneA。愈創(chuàng)木烷型倍半萜化合物FissistigmaterpeneA的結(jié)構(gòu)鑒定結(jié)果如下：FissistigmaterpeneA：為淡黃色油狀物。紫外254nm有暗斑，5％硫酸-香草醛顯色顯紫紅色。旋光度為HR-ESI-MSm/z251.1642[M-H]-，結(jié)合1H-NMR和13CNMR可知分子式為C15H24O3，計(jì)算不飽和度為4。根據(jù)1H-NMR和DEPT可知化合物中含有3個(gè)甲基信號(hào)[δH0.79(d,J＝6.8Hz)、0.81(d,J＝6.8Hz)、0.83(s)]；根據(jù)13C-NMR和DEPT可知化合物中有3個(gè)甲基碳、6個(gè)次甲基，4個(gè)亞甲基2個(gè)季碳。因此，可知化合物1為倍半萜類(lèi)化合物。根據(jù)1H-1HCOSY可知：H-2/H-3/H-4/H-5相關(guān)，H-4/H-12/H-13相關(guān)，因此，可以確定片段C-2-C-3-C-4--C-5,C-4-C-11-C-12,C-11-C-3；H-8/H-9-H-10相關(guān)，可以確定C-8-C-9-C-10片段。這兩個(gè)片段的連接是通過(guò)HMBC來(lái)確認(rèn)的。在HMBC譜中，H-15與C-2/C-1/C-10/C-5相關(guān)，H-5與C-6/C-7相關(guān)說(shuō)明這兩個(gè)片段分別通過(guò)C-1和C-6-C-7連接的?；衔锏南鄬?duì)構(gòu)型是通過(guò)NOESY確定以及耦合常數(shù)來(lái)確定的，H-5的最大耦合常數(shù)為9.2Hz，表明H-4與H-5處于反軸位置，NOESY譜中H-5與H-10相關(guān)說(shuō)明這兩個(gè)氫處于同一側(cè)；H-4與H-15相關(guān)說(shuō)明H-4與H-15處于同一側(cè)。至此，確定該化合物為愈創(chuàng)木烷型的新倍半萜化合物。表1化合物1的1H-NMR和13C-NMR數(shù)據(jù)實(shí)施例2：藥理活性實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)材料細(xì)胞：滑膜細(xì)胞(原代大鼠滑膜細(xì)胞)。細(xì)胞培養(yǎng)液：原代大鼠滑膜細(xì)胞培養(yǎng)基。試劑：噻唑藍(lán)(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide，MTT，Sigma生產(chǎn))。乳酸脫氫酶(lactatedehydrogenase，LDH)試劑盒(購(gòu)自碧云天公司)。甲氨蝶呤(methotrexate，MTX，上海信宜藥廠有限公司，批號(hào)20140307)。1.4儀器：96孔細(xì)胞培養(yǎng)板；infinite200Pro多功能酶標(biāo)儀。實(shí)驗(yàn)方法MTT法測(cè)定藥物對(duì)滑膜細(xì)胞的抑制作用取對(duì)數(shù)期的滑膜細(xì)胞接種至96孔培養(yǎng)板(1×104個(gè)細(xì)胞/孔)，設(shè)置為空白組(不給予藥物)、甲氨蝶呤組(給予1μg/mL的甲氨蝶呤)、給藥組(給予10、50、100μg/mL濃度的藥物)，培養(yǎng)孵育過(guò)夜后用于實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞給予不同濃度的藥物培養(yǎng)48h后，每孔加入10μL濃度為5mg/mLMTT，繼續(xù)培養(yǎng)4h后，小心吸棄培養(yǎng)上清液，每孔加入100μL的DMSO溶解甲瓚結(jié)晶，室溫震搖5min，完全溶解后，用酶標(biāo)儀在570nm處檢測(cè)光密度(OD值)。根據(jù)OD值計(jì)算細(xì)胞存活率。LDH活性檢測(cè)法測(cè)藥物對(duì)滑膜細(xì)胞細(xì)胞活力的影響取對(duì)數(shù)期的滑膜細(xì)胞接種至96孔培養(yǎng)板(1×104個(gè)細(xì)胞/孔)，設(shè)置為空白組(不給予藥物)、甲氨蝶呤組(給予1μg/mL的甲氨蝶呤)、給藥組(給予10、50、100μg/mL濃度的藥物)，培養(yǎng)孵育過(guò)夜，各組細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束后，取細(xì)胞上清液，LDH檢測(cè)試劑盒檢測(cè)LDH活性。LDH的活力按照下述公式計(jì)算。統(tǒng)計(jì)方法采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用單因素方差(one-wayANOVA)分析組間差異。以P<0.05認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。實(shí)驗(yàn)結(jié)果MTT法測(cè)定藥物對(duì)滑膜細(xì)胞的抑制作用使用不同濃度藥物培養(yǎng)48h后，MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖作用結(jié)果見(jiàn)下表2。結(jié)果表明FissistigmaterpeneA對(duì)滑膜細(xì)胞具有很好的抑制作用。表2各藥物對(duì)滑膜細(xì)胞的抑制作用注：與空白組比較，*P﹤0.05，**P﹤0.01。LDH活性檢測(cè)法測(cè)藥物對(duì)滑膜細(xì)胞細(xì)胞活力的影響使用不同濃度藥物培養(yǎng)48h后，LDH活性檢測(cè)法檢測(cè)細(xì)胞活力結(jié)果見(jiàn)下表3。結(jié)果顯示不同濃度的藥物處理后，升高了細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH活性(P<0.05或P＜0.01)。表3各藥物對(duì)滑膜細(xì)胞LDH活性的作用注：與空白組比較，*P﹤0.05，**P﹤0.01。以上結(jié)果表明愈瘡木烷型倍半萜化合物FissistigmaterpeneA對(duì)滑膜細(xì)胞具有很好的抑制效果，能提高細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH活性。實(shí)驗(yàn)表明倍半萜化合物FissistigmaterpeneA具有良好的抗風(fēng)濕藥效，可以用于抗風(fēng)濕藥物的制備。