一種藥用二萜化合物及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于藥物技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及從裸花紫珠的干燥地上部分中分離得到的一 種二祗類化合物及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 裸花紫珠化Ilicarpa nudiflora Hook.et Arn.為馬鞭草科紫珠屬植物，生于平 地至海拔1200m的山坡、路旁、谷地、溪邊或灌木林叢中，在年平均溫度15~25°C、濕度較大 的環(huán)境生長良好，國內(nèi)主要分布于廣東、廣西、海南等地，在海南產(chǎn)于定安、僱州、澄邁、白 沙、昌江、東方、=亞、陵水、保亭、瓊中等地，其中W海南五指山的為上品；國外主要分布于 印度、中南半島、馬來半島及新加坡等。
[0003] 裸花紫珠藥用部位為地上干燥部分，是一種海南大宗性地道藥材，同時也是海南 黎族醫(yī)生常用藥材之一。裸花紫珠全年均可采收，除去雜質(zhì)，曬干，枝葉有抗菌止血、消炎解 毒、散疲消腫、驅(qū)風(fēng)桂濕之功效，主治化脈性炎癥、急性傳染性肝炎、呼吸道及消化道出血、 創(chuàng)傷出血等癥，外用治燒、燙傷及外傷出血等。
[0004] 近年來，國內(nèi)外對裸花紫珠化學(xué)成分的研究報(bào)道較少，從中分離的成分主要有黃 酬類、祗類、揮發(fā)油和酪類等。裸花紫珠中黃酬類化合物主要有木犀草素及其配糖體。裸花 紫珠所含祗類化合物主要有:環(huán)締酸祗類化合物，二祗類化合物和=祗類化合物等。
[0005] 裸花紫珠的藥理活性有止血、抗炎、抑菌、細(xì)胞毒活性、增強(qiáng)免疫等。我國醫(yī)藥市場 上有裸花紫珠片、裸花紫珠栓劑等制劑，在皮膚科、婦科炎癥的治療和術(shù)后止血等方面具有 較好的治療效果。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種從裸花紫珠的干燥地上部分中分離得到的一種二祗類 化合物，含其的藥物組合物及其制備方法和應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明的上述目的是通過下面的技術(shù)方案得W實(shí)現(xiàn)的：
[000引一釉親田^祀化會物I.々且右下冰結(jié)均式的化合物（I):
[0009]
[0010] 所述的化合物（I)的制備方法，包含W下操作步驟：（a)將裸花紫珠的干燥地上部 分粉碎，用70~80%乙醇熱回流提取，合并提取液，濃縮至無醇味，依次用石油酸、乙酸乙醋 和水飽和的正下醇萃取，分別得到石油酸萃取物、乙酸乙醋萃取物和正下醇萃取物；（b)步 驟(a)中乙酸乙醋萃取物用大孔樹脂除雜，先用10%乙醇洗脫6個柱體積，再用70%乙醇洗 脫8個柱體積，收集70%洗脫液，減壓濃縮得70%乙醇洗脫濃縮物；（C)步驟(b)中70 %乙醇 洗脫濃縮物用正相硅膠分離，依次用體積比為40:1、20:1、10:1和5:1的二氯甲燒-甲醇梯度 洗脫得到4個組分；（d)步驟(C)中組分4用正相硅膠進(jìn)一步分離，依次用體積比為8:1、5:1和 2:1的二氯甲燒-甲醇梯度洗脫得至Ij3個組分；（e)步驟(d)中組分2用十八烷基硅烷鍵合的反 相硅膠分離，用體積百分濃度為70 %的甲醇水溶液等度洗脫，收集8~12個柱體積洗脫液， 洗脫液減壓濃縮得到純的化合物(I)。
[0011] 進(jìn)一步地，所述用乙醇熱回流提取采用的乙醇濃度為75%。
[0012] 進(jìn)一步地，所述大孔樹脂為AB-8型大孔吸附樹脂。
[0013] 本發(fā)明化合物用作藥物時，可W直接使用，或者W藥物組合物的形式使用。直接使 用時，化合物（I)通過抑制細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)細(xì)胞調(diào)亡發(fā)揮對人腦惡性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤U251細(xì) 胞的抑制作用。W藥物組合物的形式使用時，該藥物組合物含有治療有效量的本發(fā)明化合 物（I)，其余為藥物學(xué)上可接受的、對人和動物無毒和惰性的可藥用載體和/或賦形劑。所述 的可藥用載體或賦形劑是一種或多種選自固體、半固體和液體稀釋劑、填料W及藥物制品 輔劑。將本發(fā)明的藥物組合物W單位體重服用量的形式使用。本發(fā)明藥物可通過口服或注 射的形式施用于需要治療的患者。用于口服時，可將其制成片劑、緩釋片、控釋片、膠囊、滴 丸、微丸、混懸劑、乳劑、散劑或顆粒劑、口服液等；用于注射時，可制成滅菌的水性或油性溶 液、無菌粉針、脂質(zhì)體或乳劑等。研究表明，化合物（I)作為有效成分制備的藥物組合物副作 用將大大減小，而且在治療膠質(zhì)瘤的臨床藥物提供一種新的選擇。
【附圖說明】
[0014] 圖1為化合物(I)結(jié)構(gòu)式；
[0015] 圖2為化合物（I)計(jì)算ECD和實(shí)驗(yàn)ECD圖；
[0016] 圖3為化合物（I)處理后U251細(xì)胞桐調(diào)亡率的變化。
【具體實(shí)施方式】
[0017] 下面結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性內(nèi)容，但并不W此限定本發(fā)明保護(hù)范 圍。盡管參照較佳實(shí)施例對本發(fā)明作了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可W對 本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實(shí)質(zhì)和范圍。
[0018] 主要材料、試劑來源及儀器類型：
[0019] 乙醇、石油酸、乙酸乙醋、正下醇、二氯甲燒為分析純，購自上海凌峰化學(xué)試劑有限 公司，甲醇，分析純，購自江蘇漢邦化學(xué)試劑有限公司。
[0020] 實(shí)施例1:化合物(I)分離制備及結(jié)構(gòu)確證
[002。 （a)裸花紫珠的干燥地上部分（IOkg)粉碎，用75 %乙醇熱回流提取偵L X 3次），合 并提取液，濃縮至無醇味(6L)，依次用石油酸(化X3次）、乙酸乙醋(化X3次)和水飽和的正 下醇(化X3次)萃取，分別得到石油酸萃取物、乙酸乙醋萃取物(377g)和正下醇萃取物；（b) 步驟(a)中乙酸乙醋萃取物用AB-8大孔樹脂除雜，先用10%乙醇洗脫6個柱體積，再用70% 乙醇洗脫8個柱體積，收集70%洗脫液，減壓濃縮得70%乙醇洗脫濃縮物（129g); (C)步驟 (b)中70%乙醇洗脫濃縮物用正相硅膠分離，依次用體積比為40:1(8個柱體積）、20:1(8個 柱體積）、10:1(8個柱體積)和5:1(10個柱體積）的二氯甲燒-甲醇梯度洗脫得到4個組分； (d)步驟（C)中組分4(24g)用正相硅膠進(jìn)一步分離，依次用體積比為8:1(8個柱體積）、5:1 (10個柱體積)和2:1(8個柱體積)的二氯甲燒-甲醇梯度洗脫得到3個組分；（e)步驟(d)中組 分2 (15g)用十八烷基硅烷鍵合的反相硅膠分離，用體積百分濃度為70 %的甲醇水溶液等度 洗脫，收集8~12個柱體積洗脫液，洗脫液減壓濃縮得到純的化合物(I) (42mg)。
[0022] 結(jié)構(gòu)確證:HR-ESIMS顯示[M+Na]+為m/z 449.1608,結(jié)合核磁特征可得分子式為 C2姐26〇7，不飽和度為 12。核磁共振氨譜數(shù)據(jù)Sh(郵m，DMSO-ds，600MHz): H-I (5.58，S)，H-3 (2.18，m)，H-3(1.96，m)，H-6C.47，d，J = 6.0)，H-7(5.12，d，J = 6.0)，H-ll(6.92，s)，H-15 (6.74，d，J = 2.4)，H-16(7.58，d，J = 2.4)，H-17(2.45，s)，H-18(l.ll，s)，H-19(l.ll，s)，H-20(1.47，s)，l-OCOC曲（1.91，S)，6-OCOC曲（2.14，S);核磁共振碳譜數(shù)據(jù)Sc(ppm，DMSO-ds， 125MHz):91.7(CH，1-C)，201.3(C，2-C)，43.7(CH2,3-C)，30.1(C，4-C)，99.7(C，5-C),81.2 (CH，6-C)，79.6(CH，7-C)，128.6(C，8-C)，140.1(C，9-C)，46.4(C，10-C)，104.2(CH，11-C)， 155.3(C，12-C)，131.0(C，13-C)，131.9(C，14-C)，105.8(CH，15-C)，145.8(CH，16-C),16.8 (CH3，17-C)，29.3(CH3，18-C)，24.2(C出，19-C) ,29.1 (CH3,20-C)，171.1 (C，1-0C0CH3) ,20.7 (C出，I-OCOC曲），172.8 (C，6-OCOC出），21.9 (C出，6-OCOC出）；碳原子標(biāo)記參見圖I。紅外光譜 表明該化合物含有芳香碳(3012皿和1613皿）</H NMR譜顯示4個甲基信號姐1.1UH-18和H-19)，1.47化-20)，2.45巧-17)。兩個相互禪合的締控質(zhì)子信號如6.74化-15，(1^ = 2.4)和 7.58化-16，d，J = 2.4Hz)表明該化合物含有一個稠合巧喃環(huán)。I3C NMR顯示24個碳信號，其中 包括6個芳香族碳信號SC104.2,128.6,131.0,131.9,140.1和155.3。運(yùn)些數(shù)據(jù)表明，該化合 物為與巧喃環(huán)稠合的二祗類化合物。HMBC譜中，H-Il (化6.92，s)與C-12(SC155.3)和C-13(S 0131.0);曲-17(如2.45,3)與(：-8(5(：128.6)，(：-13(5(：131.0)，(：-14(5(：131.9)和(：-15(5 C105.8)的相關(guān)性驗(yàn)證了苯環(huán)與巧喃環(huán)共輛運(yùn)一推論。此外，C-I (SC91.7)和C-6(SC81.2)與 相應(yīng)的乙酷氧基（SC171.1，姐1.91和SC172.8,姐2.14)的相關(guān)性表明C-I和C-6位各連有一 個乙酷氧基。歷BC譜中H-7和C-5的相關(guān)性說明該化合物含有氧雜環(huán)下燒部分。NOESY譜中， H-I和H-6與出-20的相關(guān)性表明H-I和H-6為0-構(gòu)型。綜合氨譜、碳譜、HMBC譜和NOESY譜，W 及文獻(xiàn)關(guān)于相關(guān)類型核磁數(shù)據(jù)，可基本確定該化合物如圖1所示，立體構(gòu)型進(jìn)一步通過ECD 試驗(yàn)確定，理論值與實(shí)驗(yàn)值基本一致(圖2)。
[0023] 實(shí)施例2:化合物(I)藥理作用試驗(yàn)
[0024] 一、材料和儀器
[0025] 本實(shí)驗(yàn)采用人腦惡性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤U251細(xì)胞株，購自美國模式菌種收集中屯、。 DMEM高糖培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司;氯化鋼、氨氧化鋼、氯化鐘、氯化氧、氨氧化鋼、憐酸 氨二鋼、憐酸二氨鋼、憐酸二氨鐘、甲醇購自南京化工廠?；衔铮↖)自制，HPLC歸一化純度 大于98%。甘氨酸、T;ris、Tween20、二甲基亞諷(DMEM)購自美國Sigma公司;Aimexin-V/PI細(xì) 胞調(diào)亡試劑盒購自美國Invitrogen公司；細(xì)胞裂解液、0.25 %膜蛋白酶、Cell Counting Kit-8試劑盒、青霉素、鏈霉素、Hoechs口3258、細(xì)胞核染料DAPI、PMSF、Western blot凝膠配 制試劑盒、細(xì)胞核蛋白提取試劑盒、考馬斯亮藍(lán)染色液、標(biāo)準(zhǔn)蛋白、5X蛋白質(zhì)變性緩沖液盒、 E化超敏發(fā)光液、顯影定影試劑盒、X線膠片、硝酸纖維素膜、抗巧光澤滅封片液購自江蘇碧 云天生物研巧所。胎牛血清購自杭州四季青生物科技公司；兔抗人P65抗體購自美國NOVUS 公司；兔抗人化StonH3抗體購自美國CST公司；山羊抗兔皿P二抗購自美國SantaCruz公司； 山羊抗兔巧光二抗購自美國公司。
[0026] -20°C低溫冰箱(海爾青島），-80°C低溫冰箱(海爾青島），低溫冰箱(海爾青島），高 速離屯、機(jī)（飛鶴上海），培養(yǎng)皿/板(Coming美國），離屯、管(Coming美國），細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo 美國），倒置顯微鏡(Olympus日本），巧光倒置相差顯微鏡(ZEISS德國），多用途恒溫水浴箱 (躍進(jìn)上海），電子天平儀(上海機(jī)密科學(xué)儀器），超凈工作臺（ARITECH日本），微量移液器 (Dragon芬蘭），酶標(biāo)儀(Bio-RAD德國），流式細(xì)胞儀(BDAc州riC6美國）。
[0027] 二