用于制備包含特異性結(jié)合靶的至少一種結(jié)合實體的抗體Fc區(qū)綴合物的方法及其用途
【專利摘要】本文報道了生產(chǎn)抗體Fc區(qū)綴合物的方法，所述方法使用用于將抗體Fc區(qū)酶促綴合至至少一個結(jié)合實體的轉(zhuǎn)肽酶，所述抗體Fc區(qū)綴合物包含抗體Fc區(qū)作為第一組分和特異性結(jié)合靶的至少一個結(jié)合實體作為第二組分。
【專利說明】用于制備包含特異性結(jié)合靶的至少一種結(jié)合實體的抗體 Fc區(qū)綴合物的方法及其用途
[0001] 本文報道了通過使用轉(zhuǎn)肽酶（例如分選酶A)酶促制備抗體Fc區(qū)綴合物的方法， 所述轉(zhuǎn)肽酶用于將至少一種特異性結(jié)合靶的結(jié)合實體共價連接至抗體Fc-區(qū)；以及這一方 法用于生成新的例如單特異性或雙特異性抗體的用途。
[0002] 發(fā)明背景
[0003] 單克隆抗體在當今的醫(yī)學領(lǐng)域中具有巨大治療潛能并且發(fā)揮重要作用。在最近十 年期間，制藥業(yè)中的一個明顯趨勢已經(jīng)是開發(fā)單克隆抗體(mAb)和抗體Fc-融合多肽（可結(jié) 晶片段-融合多肽）作為跨多樣臨床環(huán)境的治療劑，包括腫瘤學、慢性炎性疾病、移植、傳染 病、心血管醫(yī)學或眼科疾?。–arter, J.P·，Nature Reviews Immunology 6(2006)343-357; Chan, A. C.和 Carter, J.P·，Nature Reviews Immunology 10(2010)301-316)。
[0004] 治療性抗體的臨床效率主要依賴于兩種官能性：i)由Fv域介導(dǎo)的靶特異性結(jié)合， 和ii)免疫介導(dǎo)的效應(yīng)子功能如由抗體Fc區(qū)介導(dǎo)的ADCC (抗體依賴的細胞介導(dǎo)細胞毒 性）、CDC (補體依賴的細胞毒性）和ADCP (抗體依賴的細胞吞噬作用）。IgG類別的免疫球 蛋白的Fc區(qū)包含鉸鏈區(qū)和兩個恒定結(jié)構(gòu)域（CH2和CH3)。Fc區(qū)還與新生FcRn受體相互作 用并且因而決定抗體在體內(nèi)的半壽期。鉸鏈區(qū)是抗體分子的臂形成Y樣結(jié)構(gòu)的區(qū)域，所述 Y樣結(jié)構(gòu)使得分子中在此處的靈活性成為可能。一種或多種IgG亞類在二硫鍵數(shù)目和鉸鏈 區(qū)長度方面不同。
[0005] 與抗體Fc區(qū)相關(guān)的效應(yīng)子功能隨抗體類別和亞類變動并且包括例如抗體通過其 Fc區(qū)與細胞上特定Fc受體（FcR)結(jié)合，這觸發(fā)多種生物學反應(yīng)（參見例如Jiang，X. -R.等 人，Nature Reviews Drug Discovery 10 (2011)101-110 ；Presta, L. G. , Current Opinion in Immunology 20 (2008)460-470)〇
[0006] 構(gòu)成融合多肽或綴合物的抗體或Fe區(qū)的鉸鏈區(qū)參與至少部分的抗體功能如抗原 結(jié)合和Fc區(qū)介導(dǎo)的抗體效應(yīng)子功能。盡管抗原結(jié)合（尤其二價親合抗體結(jié)合）取決于特 定/天然鉸鏈區(qū)的靈活性、長度和空間取向，F(xiàn)c區(qū)介導(dǎo)的效應(yīng)子功能依賴于抗體的類別和 亞類。與其他IgG抗體的二價相比，對一些人IgG4抗體觀察到的功能性單價是顯示Fc區(qū) 參與抗原結(jié)合特性的另一個例子。
[0007] 在W02010/087994中，報道了用于連接的方法及其用途。在W02010/099536中，報 道了針對DOTA螯合物具有高親和性的改造的蛋白質(zhì)。
[0008] 發(fā)明簡沭
[0009] 已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)肽酶，例如分選酶A，催化的酶促綴合反應(yīng)中，副反應(yīng)產(chǎn)物的形成可 以被減少或者甚至被消除，如果使用特異性改造的分選酶基序與特異性改造的Fc區(qū)的組 合。
[0010] 特別地，
[0011] i)基于將產(chǎn)物綴合物中的LPXlTG(SEQ ID NO:01)氨基酸序列識別為底物的逆反 應(yīng)，和/或
[0012] ii)封端水解多肽片段（無/切割的LPXlTG識別序列的多肽，通過由水而非寡聚 甘氨酸親核體切割硫代?；?轉(zhuǎn)肽酶中間體而產(chǎn)生）的生成，
[0013] 可以在酶促綴合反應(yīng)中被減少甚至被消除如果使用
[0014] i)抗體Fc區(qū)，其至少在其N末端之一包含寡聚甘氨酸（Gm，m = 2,或3,或4,或 5)，以及
[0015] ii)特異性結(jié)合祀的結(jié)合實體，例如單鏈抗原結(jié)合多肽（例如scFc，scFab和 darpin)或多鏈抗原結(jié)合多肽（例如dsFv和Fab-抗體片段），其在其C末端區(qū)域中包含 GnSLPXlTG(SEQ ID N0:02，n = 1，2,或3,且其中Xl可以是任何氨基酸殘基）氨基酸序列。
[0016] 此外，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)通過使用上述C-末端和N-末端氨基酸序列的組合，可以獲得改善 的反應(yīng)產(chǎn)量。
[0017] 本文報道的一個方面是使用用于將抗體Fc區(qū)酶促綴合至至少一個結(jié)合實體的轉(zhuǎn) 肽酶，從專有地重組產(chǎn)生的起始多肽產(chǎn)生抗體Fc區(qū)綴合物的方法，所述抗體Fc區(qū)綴合物包 含含有抗體Fc區(qū)的第一重組組分和含有至少一個特異性結(jié)合靶的結(jié)合實體的第二重組組 分。
[0018] 在一個實施方案中,轉(zhuǎn)肽酶是分選酶A。在一個實施方案中，分選酶A是金黃色葡 萄球菌分選酶A。
[0019] 在一個實施方案中，結(jié)合實體彼此獨立地選自基于darpin結(jié)構(gòu)域的結(jié)合實體、基 于抗運載蛋白（anticalin)結(jié)構(gòu)域的結(jié)合實體、基于T細胞受體片段樣scTCR結(jié)構(gòu)域的結(jié) 合實體、基于駱駝VH結(jié)構(gòu)域的結(jié)合實體、基于第十纖連蛋白3結(jié)構(gòu)域的結(jié)合實體、基于生 腱蛋白結(jié)構(gòu)域的結(jié)合實體、基于鈣黏著蛋白結(jié)構(gòu)域的結(jié)合實體、基于ICAM結(jié)構(gòu)域的結(jié)合實 體、基于肌聯(lián)蛋白結(jié)構(gòu)域的結(jié)合實體、基于GCSF-R結(jié)構(gòu)域的結(jié)合實體、基于細胞因子受體 結(jié)構(gòu)域的結(jié)合實體、基于糖苷酶抑制劑結(jié)構(gòu)域的結(jié)合實體、基于超氧化物歧化酶結(jié)構(gòu)域的 結(jié)合實體，或抗體片段如Fab或scFv片段。
[0020] 在一個實施方案中，祀結(jié)合支架選自darpin、血液結(jié)合素樣分子和抗運載蛋白。
[0021] 在一個實施方案中，特異性結(jié)合靶的結(jié)合實體選自抗體、抗體片段、受體、受體配 體、和靶結(jié)合支架，條件是受體配體不是腸降血糖素受體配體多肽。
[0022] 在一個實施方案中，抗體片段選自包含？\?&13^&13'^ &13'-5!^(&13'）2，雙體抗 體，線性抗體，scFv, scFab,和dsFv的組。
[0023] 在一個實施方案中，受體選自T-細胞受體片段和scTCR。
[0024] 在一個實施方案中，抗體Fe區(qū)包含由至少一個二硫鍵連接的兩條多肽鏈。
[0025] 在一個實施方案中，抗體Fe區(qū)包含兩個二硫化物連接的全長重鏈抗體Fe區(qū)，或兩 個重鏈抗體Fe區(qū)片段，或與同族全長輕鏈配對的全長抗體重鏈，以及二硫化物連接的全長 重鏈抗體Fe區(qū)，或與全長抗體重鏈Fe區(qū)多肽二硫化物連接的全長抗體重鏈。
[0026] 在一個實施方案中，方法包括下列步驟：
[0027] -孵育i)特異性結(jié)合靶的結(jié)合實體，其在其20個C末端氨基酸殘基內(nèi)包含氨基 酸序列G nSLPXlTG(SEQ ID N0:02，n = l，2,或3,且其中Xl可以是任何氨基酸殘基，以及 ii)在至少一個N末端包含寡聚甘氨酸G111Oii = 1，2或3)的抗體Fe區(qū)，與酶分選酶A，并從 而產(chǎn)生抗體Fe區(qū)綴合物。
[0028] 在一個實施方案中，特異性結(jié)合靶的結(jié)合實體在20個C末端氨基酸殘基內(nèi)包含 氨基酸序列G nSLPXlTGGSGS(SEQ ID N0:03，n=l，2,或3,且其中Xl可以是任何氨基酸殘 基）。
[0029] 在一個實施方案中，特異性結(jié)合靶的結(jié)合實體在20個C末端氨基酸殘基內(nèi)包含氨 基酸序列X2GSLPX1TGGSGS(SEQ ID N0:04,其中Xl可以是任何氨基酸殘基），以此X2可以 是除甘氨酸之外的任何氨基酸殘基。
[0030] 在一個實施方案中，特異性結(jié)合靶的結(jié)合實體在20個C末端氨基酸殘基內(nèi)包含氨 基酸序列G nSLPXlTGGSGSX3(SEQ ID N0:05，n=l、2或3且其中Xl可以是任何氨基酸殘基， η = 1、2或3)，以此X3是氨基酸序列標簽。
[0031] 在一個實施方案中，特異性結(jié)合靶的結(jié)合實體在20個C末端氨基酸殘基內(nèi)包含氨 基酸序列X2GSLPX1TGGSGSX3(SEQ ID Ν0:06,其中Xl可以是任何氨基酸殘基），以此Χ2可 以是除甘氨酸之外的任何氨基酸殘基并且其中Χ3是氨基酸序列標簽。
[0032] 在一個實施方案中，特異性結(jié)合靶的結(jié)合實體在其C末端包含氨基酸序列SEQ ID NO: 2,或 SEQ ID NO: 3,或 SEQ ID NO: 4,或 SEQ ID NO: 05 或 SEQ ID NO: 06 作為 C 末端氨基 酸殘基。
[0033] 在一個實施方案中，抗體Fc區(qū)至少在其N末端之一包含兩個甘氨酸殘基。
[0034] 在一個實施方案中，抗體Fc區(qū)在其兩個N末端都包含兩個甘氨酸殘基。
[0035] 在一個實施方案中，抗體Fc區(qū)至少在其N末端之一包含氨基酸序列GGCPX4C (SEQ IDN0:07)，或氨基酸序列GGHTCPX4C(SEQIDN0:08)，其中X4是S或P。
[0036] 在一個實施方案中，抗體Fc區(qū)在其兩個N末端彼此獨立地都包含氨基酸序列 GGCPX4C(SEQIDN0:07)，或氨基酸序列GGHTCPX4C(SEQIDN0:08)，其中X4彼此獨立地是 S或P。
[0037] 在一個實施方案中，特異性結(jié)合靶的結(jié)合實體特異性結(jié)合第一表位或抗原且抗體 Fc區(qū)包含特異性結(jié)合不同于第一表位或抗原的第二表位或抗原的第二結(jié)合實體。
[0038] 本文報道的一個方面是通過本文報道的方法所獲得的抗體Fc區(qū)綴合物。
[0039] 本文報道的一個方面是抗體Fc區(qū)綴合物，其包含氨基酸序列GnSLPXlTGG (SEQ ID NO: 09, η = 1，2或3,且其中Xl可以是任何氨基酸殘基）。
[0040] 在一個實施方案中，抗體Fc區(qū)綴合物包含氨基酸序列GnSLPXlTGGCPX4C(SEQ ID NO: 10, η = 1，2或3)，其中Xl可以是任何氨基酸殘基，且其中X4是S或P。
[0041] 在一個實施方案中，抗體Fc區(qū)綴合物包含氨基酸序列X2GSLPX1TGGCPX4C(SEQ ID NO: 11)，其中Xl可以是任何氨基酸殘基，其中X4是S或P，且其中X2可以是除甘氨酸外的 任何氨基酸殘基。
[0042] 在一個實施方案中，抗體Fc區(qū)綴合物包含氨基酸序列GnSLPXlTGGHTCPX4C (SEQ ID NO: 12, η = 1，2或3)，其中Xl可以是任何氨基酸殘基，且其中X4是S或P。
[0043] 在一個實施方案中，抗體Fc區(qū)綴合物包含氨基酸序列X2GSLPX1TGGHTCPX4C(SEQ ID N0:13)，其中Xl可以是任何氨基酸殘基，其中X4是S或P，并且其中X2可以是除甘氨 酸外的任何氨基酸殘基。
[0044] 在一個實施方案中，抗體Fc區(qū)綴合物包含通過至少一個二硫鍵共價連接的第一 和第二多肽鏈。
[0045] 在一個實施方案中，抗體Fc區(qū)綴合物包含是全長抗體重鏈的第一多肽鏈和是包 含氨基酸序列G nSLPXlTGGCPX4C(SEQ ID NO: 10, η = 1，2或3)的抗體重鏈的第二多肽鏈， 以此第一和第二多肽鏈通過至少一個二硫鍵共價連接，其中Xl可以是任何氨基酸殘基，且 其中X4是S或P。
[0046] 在一個實施方案中，抗體Fc區(qū)綴合物包含是全長抗體重鏈的第一多肽鏈和是包 含氨基酸序列G nSLPXlTGGHTCPX4C(SEQ ID N0:12，n=l，2或3)的抗體重鏈的第二多肽鏈， 以此第一和第二多肽鏈通過至少一個二硫鍵共價連接，其中Xl可以是任何氨基酸殘基，并 且其中X4是S或P。
[0047] 在一個實施方案中，抗體Fc區(qū)綴合物包含兩條多肽鏈，其中每條是包含氨基酸序 列GnSLPXlTGGHTCPX4C(SEQ ID NO: 12, η = 1，2或3)的抗體重鏈，以此兩條多肽鏈通過至 少一個二硫鍵共價連接，其中Xl可以是任何氨基酸殘基，且其中Χ4是S或Ρ。
[0048] 在全部方面的一個實施方案中，Xl是Ε。
[0049] 在如本文中報道的全部方面的一個實施方案中，抗體Fc區(qū)是人抗體Fc區(qū)或其變 體。
[0050] 在一個實施方案中，人抗體Fc區(qū)是人IgGl亞類的，或人IgG2亞類的，或人IgG3 亞類的，或人IgG4亞類的。
[0051] 在一個實施方案中，抗體Fc區(qū)是人IgGl亞類的或人IgG4亞類的人抗體Fc區(qū)。
[0052] 在一個實施方案中，人抗體Fc區(qū)包含至少在以下氨基酸位置228、233、234、235、 236、237、297、318、320、322、329和/或331中一個處天然存在氨基酸殘基向不同殘基的突 變，其中抗體Fc區(qū)中的殘基根據(jù)Kabat的EU索引編號。
[0053] 在一個實施方案中，人抗體Fc區(qū)包含在第329位置處天然存在氨基酸殘基的突變 和至少一個氨基酸殘基向不同殘基的至少一個其他突變，所述至少一個氨基酸殘基選自包 含在第228、233、234、235、236、237、297、318、320、322和331位置的氨基酸殘基的組，其中 Fc區(qū)中的殘基根據(jù)Kabat的EU索引編號。與未修飾的（野生型）Fc區(qū)相比，這些特定氨基 酸殘基的變化導(dǎo)致Fc區(qū)的效應(yīng)子功能改變。
[0054] 在一個實施方案中，與包含相應(yīng)野生型IgGFc區(qū)的綴合物相比，人抗體Fc區(qū)針對 人Fe γ RIIIA、和/或Fe γ RIIA和/或Fe γ RI具有減低的親和力。
[0055] 在一個實施方案中，人抗體Fc區(qū)中第329位置處的氨基酸殘基用甘氨酸、或精氨 酸、或大到足以摧毀Fc區(qū)內(nèi)部脯氨酸夾層的氨基酸殘基置換。
[0056] 在一個實施方案中，人抗體Fc區(qū)中天然存在氨基酸殘基的突變是以下至少一種： S228P、E233P、L234A、L235A、L235E、N297A、N297D、P329G 和 / 或 P331S。
[0057] 在一個實施方案中，如果抗體Fc區(qū)屬于人IgGl亞類，則突變是L234A和L235A，或 如果抗體Fc區(qū)屬于人IgG4亞類，則突變是S228P和L235E。
[0058] 在一個實施方案中，抗體Fc區(qū)包含突變P329G。
[0059] 在一個實施方案中，抗體Fc區(qū)在第一重鏈Fc區(qū)多肽中包含突變T366W并且在第 二重鏈Fc區(qū)多肽中包含突變T366S、L368A和Y407V，其中根據(jù)Kabat的EU索引編號。
[0060] 在一個實施方案中，抗體Fc區(qū)在第一重鏈Fc區(qū)多肽中包含突變S354C并且在第 二重鏈Fc區(qū)多肽中包含突變Y349C。
[0061] 附圖描述：
[0062] 圖1 :使用分選酶A生成二價抗體的示意圖。
[0063] 圖2 :偶聯(lián)反應(yīng)流程的SDS-page分析。
[0064] 圖3 :具有不同的結(jié)合特異性的在VH-CHl重鏈Fab片段含有三種不同的C末端氨 基酸序列（分別為 LPETGGSGSHHHHHH(SEQ ID N0:14)，GSLPETGGSGSHHHHHH(SEQ ID N0:15) 和GGGSLPETGGSGSHHHHHH (SEQ ID NO: 16))的兩個Fab抗體片段與含有三種N末端不同的 Fc鏈（分別為GGCPPC(SEQIDN0:17)，GGHTCPPC(SEQIDN0:18)，和GGGDKTHTCPPC(SEQID N0:19))的三種不同的單臂抗體Fc區(qū)（ΟΑ-Fc抗體）的分選酶A催化的綴合的轉(zhuǎn)化的比較。 [0065] 圖4具有不同結(jié)合特異性的在VH-CHl重鏈Fab片段含有三種不同的C末端氨基 酸序列的兩個Fab抗體片段與含有三種N末端不同的Fc鏈的三種不同的單臂抗體Fc區(qū) (ΟΑ-Fc抗體）的分選酶A催化的綴合的轉(zhuǎn)化的比較，其被減少為4個時間點，其中對所有組 合的值平均以獲得結(jié)合特異性非依賴性（即Fab非依賴性）值，其中差異僅僅是基于不同 的組合。每個值包含4個測量。
[0066] 本發(fā)明的【具體實施方式】
[0067] I.定義
[0068] 在本說明書和權(quán)利要求中，免疫球蛋白重鏈Fc區(qū)中殘基的編號是Kabat的EU索 弓I編號（Kabat，E. A.等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest,第 5 版，Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD(1991), NIH Publication 91-3242,所述文獻通過引用的方式明確并入本文）。
[0069] 術(shù)語"改變"指例如至少包含F(xiàn)c區(qū)的FcRn結(jié)合部分的抗體或融合多肽的親本氨 基酸序列中突變、添加或缺失一個或多個氨基酸殘基以獲得變體抗體或融合多肽。
[0070] 術(shù)語"氨基酸突變"指在親本氨基酸序列的氨基酸序列中的修飾。示例性修飾包括 氨基酸置換、插入和/或缺失。在一個實施方案中，氨基酸突變是置換。術(shù)語"在某位置的 氨基酸突變"指置換或缺失指定的殘基或相鄰于指定的殘基插入至少一個氨基酸殘基。術(shù) 語"相鄰于指定的殘基插入"指在一個至兩個殘基內(nèi)部插入該殘基。插入可以相對于指定 的殘基是N末端或C末端。
[0071] 術(shù)語"氨基酸序列標簽"指通過具有特異性結(jié)合特性的肽鍵彼此連接的氨基 酸殘基的序列。在一個實施方案中，氨基酸序列標簽是親和標簽或純化標簽。在一個 實施方案中、氨基酸序列標簽選自Arg標簽、His標簽、FLAG標簽、3xFlag標簽、鏈霉 親和素標簽、納米標簽、SBP標簽、c-myc標簽、S標簽、鈣調(diào)蛋白結(jié)合肽、纖維素結(jié)合結(jié) 構(gòu)域、殼多糖結(jié)合結(jié)構(gòu)域、GST標簽或MBP標簽。在一個實施方案中，氨基酸序列標簽 選自 SEQ ID NO: 20 (RRRRR)，或 SEQ ID NO: 21 (RRRRRR)，或 SEQ ID NO: 22 (HHHHHH)， 或 SEQ ID N0:23(KDHLIHNVHKEFHAHAHNK),或 SEQ ID N0:24(DYKDDDDK),或 SEQ ID N0:25(DYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDK),或 SEQ ID N0:26(AWRHPQFGG),或 SEQ ID N0:27(WSHPQFEK),或SEQ ID N0:28(MDVEAWLGAR),或 SEQ ID N0:29(MDVEAWLGARVPLVET), 或 SEQ ID N0:30(MDEKTTGWRGGHVVEGLAGELEQLRARLEHHPQGQREP),或 SEQ ID N0:31(EQKLISEEDL),或 SEQ ID N0:32(KETAAAKFERQHMDS),或SEQ ID N0:33(KRRWKKNFIAV SAANRFKKISSSGAL),或SEQ ID N0:34(纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域），或SEQ ID N0:35(纖維素結(jié)合 結(jié)構(gòu)域），或SEQ ID N0:36(TNPGVSAWQVNTAYTAGQLVTYNGKTYKCLQPHTSLAGWEP SNVPALWQLQ), 或 SEQ ID NO: 37 (GST-標簽）或 SEQ ID NO: 38 (MBP-標簽）。
[0072] 術(shù)語"氨基酸置換"指將預(yù)先確定的親本氨基酸序列中的至少一個氨基酸殘基 替換為不同的"替換"氨基酸殘基。該替換殘基或多個殘基可以是"天然存在的氨基酸殘 基"（即由遺傳密碼編碼）并且選自：丙氨酸（Ala);精氨酸（Arg);天冬酰胺（Asn);天冬 氨酸（Asp);半胱氨酸（Cys);谷氨酰胺（Gln);谷氨酸（Glu);甘氨酸（Gly);組氨酸（His); 異亮氨酸（lie):亮氨酸（Leu);賴氨酸（Lys);甲硫氨酸（Met);苯丙氨酸（Phe);脯氨酸 (Pro);絲氨酸（Ser);蘇氨酸（Thr);色氨酸（Trp);酪氨酸（Tyr);和纈氨酸（Val)。在一個 實施方案中，替換殘基不是半胱氨酸。本文的氨基酸置換定義中還涵蓋用一種或多種非天 然存在的氨基酸殘基置換。"非天然存在的氨基酸殘基"指除上文所列的那些天然存在氨基 酸殘基之外，能夠共價結(jié)合多肽鏈中相鄰（一個或多個）氨基酸殘基的殘基。非天然存在 的氨基酸殘基的例子包括正亮氨酸、鳥氨酸、正纈氨酸、高絲氨酸、aib和其他氨基酸殘基類 似物，如在Ellman等人，Meth. Enzym. 202 (1991) 301-336中描述的那些。為了產(chǎn)生這類非 天然存在的氨基酸殘基，可以使用Noren等人（Science 244(1989) 182)和/或Ellman等 人（上文）的方法。簡而言之，這些方法涉及用非天然存在的氨基酸殘基化學活化激活阻 抑tRNA，隨后體外轉(zhuǎn)錄并翻譯RNA。也可以通過化學地合成肽并隨后使這些肽與重組產(chǎn)生 的多肽如抗體或抗體片段融合，將非天然存在的氨基酸摻入肽中。
[0073] 術(shù)語"氨基酸插入"指將至少一個額外的氨基酸殘基摻入預(yù)先確定的親本氨基酸 序列中。盡管插入通常將由插入一個或兩個氨基酸殘基組成，但是本申請構(gòu)思更大的"肽插 入"，例如插入約3個至約5個或甚至至多約10個氨基酸殘基。插入的（一個或多個）殘 基可以是如上文定義天然存在或非天然存在的。
[0074] 術(shù)語"氨基酸缺失"指在氨基酸序列中的預(yù)定位置處移除至少一個氨基酸殘基。
[0075] 在本申請范圍內(nèi)無論何時提到氨基酸改變，它總是人為的氨基酸改變并且不是隨 機氨基酸修飾。
[0076] 術(shù)語"抗體依賴的細胞介導(dǎo)細胞毒性"，簡寫為"ADCC"，指細胞介導(dǎo)的反應(yīng)，所述反 應(yīng)中表達FcR的非抗原特異性細胞毒細胞（例如天然殺傷細胞（NK細胞）、嗜中性粒細胞和 巨噬細胞）通過與免疫球蛋白Fc區(qū)結(jié)合識別靶細胞并隨后造成靶細胞溶解。用于介導(dǎo)ADCC 的主要細胞即NK細胞，僅表達Fe γ RIII，而單核細胞表達Fe γ RI、FcyRII和Fe γ RIII。 造血細胞上的 FcR 表達匯總于 Ravetch 和 Kinet，Annu. Rev. Tmmunol. 9 (1991) 457-492 的第 464頁上的表3中。
[0077] 術(shù)語"抗體依賴的細胞吞噬作用"，簡寫為短"ADCP"，指一種過程，其中通過與免疫 球蛋白Fc區(qū)結(jié)合的吞噬性免疫細胞（例如巨噬細胞、嗜中性粒細胞或樹突細胞）藉此完整 或部分地內(nèi)化抗體包覆的細胞。
[0078] 術(shù)語"抗體片段"指包含完整抗體的一部分的非完整抗體的分子，其結(jié)合與完整抗 體結(jié)合的抗原?？贵w片段的例子包括但不限于Fv、Fab、Fab'、Fab' _SH、F(ab'）2、雙體抗體、 線性抗體、單鏈抗體分子（例如scFv)、和從抗體片段形成的多特異性抗體。
[0079] 術(shù)語"與Fc受:體結(jié)合"指例如在BIAcorete)測定法（Pharmacia Biosensor AB, Uppsala,瑞典）中Fe區(qū)與Fe受體結(jié)合。
[0080] 在BIAcore?測定法中，F(xiàn)c受體與表面結(jié)合并且通過表面等離子體共振（SPR)測 量對分析物（例如包含F(xiàn)c區(qū)的融合多肽或抗體）的結(jié)合。結(jié)合的親和力由術(shù)語ka(締合 常數(shù)：Fc區(qū)融合多肽或綴合物締合以形成Fc區(qū)/Fe受體復(fù)合體的速率常數(shù)）、kd(解離常 數(shù)；Fc區(qū)融合多肽或綴合物從Fc區(qū)/Fe受體復(fù)合體解離的速率常數(shù)）和KD (kd/ka)定義。 備選地，可以就共振信號高度和解離行為方面，將SPR傳感圖的結(jié)合信號與參比物的響應(yīng) 信號直接比較。
[0081] 術(shù)語"Clq"指包含免疫球蛋白Fc區(qū)的結(jié)合位點的多肽。Clq連同兩種絲氨酸蛋白 酶Clr和Cl 一起形成復(fù)合物C1，補體依賴細胞毒性（⑶C)途徑的第一組分。人Clq可以例 如從加利福尼亞州圣迭戈Quidel商購。
[0082] 術(shù)語"CH2結(jié)構(gòu)域"指抗體重鏈多肽的約從EU位置231延伸至EU位置340的部 分（根據(jù)Kabat的EU編號體系）。在一個實施方案中，CH2結(jié)構(gòu)域具有氨基酸序列APELL GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQESTYRWSVLTVLHQDffLN GKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK(SEQ ID N0:39)。CH2結(jié)構(gòu)域的獨特性在于它不與另一個結(jié) 構(gòu)域緊密配對。相反，兩個N連接的分枝的糖鏈間插在完整天然Fc區(qū)的兩個CH2結(jié)構(gòu)域 之間。已經(jīng)推測糖可以提供結(jié)構(gòu)域-結(jié)構(gòu)域配對作用的替代并且有助于穩(wěn)定CH2結(jié)構(gòu)域。 Burton, Mol. Immunol. 22(1985) 161-206。
[0083] 術(shù)語"CH3結(jié)構(gòu)域"指抗體重鏈多肽的約從EU位置341延伸至EU位置446的部 分。在一個實施方案中，CH3結(jié)構(gòu)域具有氨基酸序列GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGF YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(SE Q ID NO:40)。
[0084] 術(shù)語抗體的"類別"指其重鏈擁有的恒定結(jié)構(gòu)域或恒定區(qū)的類型。人類中存在五 個主要類別的抗體：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且這些類別中的幾種可以進一步劃分成亞 類，例如，IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl和IgA2。對應(yīng)于不同類別免疫球蛋白的重鏈恒定結(jié) 構(gòu)域分別稱作α、δ、ε、γ和μ。
[0085] 術(shù)語"補體依賴的細胞毒性"，簡寫為"CDC"，指引起細胞死亡的機制，其中結(jié)合靶 的Fc區(qū)融合多肽或綴合物的Fc區(qū)激活一系列酶促反應(yīng)，以靶細胞膜中形成孔為終結(jié)。一 般，抗原-抗體復(fù)合物如抗體包覆的靶細胞上的那些，結(jié)合并激活補體組分Clq，后者轉(zhuǎn)而 激活補體級聯(lián)，導(dǎo)致靶細胞死亡。補體活化還可以導(dǎo)致補體組分沉積在靶細胞表面上，這通 過結(jié)合白細胞上的補體受體（例如，CR3)促進ADCC或ADCP。
[0086] 術(shù)語"效應(yīng)子功能"指歸因于抗體Fc區(qū)的那些生物活性，這些活性隨抗體亞類變 動?？贵w效應(yīng)子功能的例子包括：Clq結(jié)合和補體依賴的細胞毒性（CDC) ;Fc受體結(jié)合；抗 體依賴的細胞介導(dǎo)細胞毒性（ADCC);吞噬（ADCP);下調(diào)細胞表面受體（例如，B細胞受體）； 和B細胞活化。這種功能可以例如通過Fc區(qū)與具有吞噬活性或溶解活性的免疫細胞上的 Fc受體結(jié)合或通過Fc區(qū)與補體系統(tǒng)的組分結(jié)合來實現(xiàn)。
[0087] 術(shù)語"減少的效應(yīng)子功能"指與對照分子（例如具有野生型Fc區(qū)的多肽）相比， 減少與分子相關(guān)的特定效應(yīng)子功能（例如ADCC或CDC)至少20%。術(shù)語"強烈減少的效應(yīng) 子功能"指與對照分子相比，減少與分子相關(guān)的特定效應(yīng)子功能（例如ADCC或CDC)至少 50%。
[0088] 術(shù)語"Fc區(qū)"指免疫球蛋白的C末端區(qū)域。Fc區(qū)是包含兩個二硫鍵連接的抗體重 鏈片段（重鏈Fc區(qū)多肽鏈）的二聚體分子。Fc區(qū)可以通過木瓜蛋白酶消化或IdeS消化或 胰蛋白酶消化完整（全長）抗體產(chǎn)生或可以重組產(chǎn)生。
[0089] 從全長抗體或免疫球蛋白可獲得的Fc區(qū)至少包含全長重鏈的殘基226 (Cys)至C 末端，并且因此包含一部分鉸鏈區(qū)和2個或3個恒定結(jié)構(gòu)域，即CH2結(jié)構(gòu)域、CH3結(jié)構(gòu)域和 IgE類和IgM類抗體上的另外/額外的CH4結(jié)構(gòu)域。從US 5, 648, 260和US 5, 624, 821已 知，修飾Fe區(qū)中限定的氨基酸殘基產(chǎn)生表型效應(yīng)。
[0090] 構(gòu)成兩個相同或不相同抗體重鏈片段的二聚體Fe區(qū)的形成由所包含的CH3結(jié)構(gòu) 域的非共價二聚化介導(dǎo)（對于涉及的氨基酸殘基，參見例如Dali'Acqua, Biochem. 37 (1998 )9266-9273)。通過在鉸鏈區(qū)中形成二硫鍵，共價地穩(wěn)定Fe區(qū)（參見例如Huber等人，Nature 264 (1976) 415-420 ;Thies 等人，J. Mol. BioL 293 (1999) 67-79)。為 了破壞 CH3-CH3 結(jié)構(gòu)域 相互作用的二聚化而在CH3結(jié)構(gòu)域內(nèi)部引入氨基酸殘基變化并未不利地影響新生Fe受體 (FcRn)結(jié)合，原因在于參與CH3-CH3結(jié)構(gòu)域二聚化的殘基的位置在CH3結(jié)構(gòu)域的內(nèi)界面上， 而參與Fe區(qū)-FcRn相互作用的殘基位于CH2-CH3結(jié)構(gòu)域外部。
[0091] 與Fe區(qū)的效應(yīng)子功能相關(guān)的殘基位于如對全長抗體分子所測定的鉸鏈區(qū)、CH2結(jié) 構(gòu)域和/或CH3結(jié)構(gòu)域中。Fe區(qū)相關(guān)/介導(dǎo)的功能是：
[0092] (i)抗體依賴的細胞毒性（ADCC)，
[0093] (ii)補體（Clq)結(jié)合、激活和補體依賴的細胞毒性（CDC)，
[0094] (iii)吞噬/清除抗原-抗體復(fù)合物，
[0095] (iv)在一些情況下釋放細胞因子，和
[0096] (V)抗體和抗原-抗體復(fù)合物的半壽期/清除率。
[0097] 通過Fe區(qū)與效應(yīng)子功能特異性分子或受體相互作用，啟動Fe區(qū)相關(guān)的效應(yīng)子功 能。大多數(shù)情況下，IgGl亞類抗體可以實現(xiàn)受體激活，而IgG2亞類和IgG4亞類抗體不具 有效應(yīng)子功能或具有有限的效應(yīng)子功能。
[0098] 激發(fā)效應(yīng)子功能的受體是Fe受體類型（和亞型）Fe Y RI、Fe Y RII和Fe Y RIII。 可以通過在下部鉸鏈區(qū)中引入?yún)⑴cFe Y R和Clq結(jié)合的特定氨基酸變化如L234A和/或 L235A，減少與IgGl亞類相關(guān)的效應(yīng)子功能。另外，某些氨基酸殘基，尤其位于CH2結(jié)構(gòu)域 和/或CH3結(jié)構(gòu)域中的殘基，與抗體分子或Fe區(qū)融合多肽在血流中的循環(huán)半壽期相關(guān)。循 環(huán)半壽期由Fe區(qū)與新生Fe受體（FcRn)的結(jié)合決定。
[0099] Fe區(qū)糖結(jié)構(gòu)上存在的唾液酸殘基參與Fe區(qū)的抗炎介導(dǎo)活性（參見例如 Anthony, R.M.等人，Science 320(2008)373-376)。
[0100] 抗體恒定區(qū)中氨基酸殘基的編號根據(jù)Kabat的EU索引進行（Kabat，E. A.等 人，Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第 5 版，Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD(1991) , NIH Publication 913242)。
[0101] 術(shù)語"人抗體Fe區(qū)"指人源免疫球蛋白重鏈的C末端區(qū)域，其至少含有一部分的鉸 鏈區(qū)、CH2結(jié)構(gòu)域和CH3結(jié)構(gòu)域。在一個實施方案中，人IgG抗體重鏈Fe區(qū)從約Glu216、或從 約Cys226或從約Pro230延伸至重鏈的羧基端。然而，抗體Fe區(qū)的C末端賴氨酸（Lys447) 可以存在或可以不存在。
[0102] 術(shù)語"變體Fe區(qū)"指因至少一個"氨基酸改變/突變"而與"天然"或"野生型" Fe 區(qū)氨基酸序列不同的氨基酸序列。在一個實施方案中，與天然Fe區(qū)或與親本多肽的Fe區(qū) 相比，變體Fe區(qū)具有至少一個氨基酸突變，例如從約1個至約10個氨基酸突變，并且在一 個實施方案中，在天然Fe區(qū)中的或在親本多肽的Fe區(qū)中具有約1個至約5個氨基酸突變。 在一個實施方案中，（變體）Fe區(qū)與野生型Fe區(qū)和/或與親本多肽的Fe區(qū)具有至少約80% 同源性，并且在一個實施方案中，變體Fe區(qū)具有至少約90%同源性，在一個實施方案中，變 體Fe區(qū)具有至少約95%同源性。
[0103] 如本文中報道的變體Fe區(qū)由所含的氨基酸改變定義。因此，例如，術(shù)語P329G 指相對于親本（野生型）Fe區(qū)在氨基酸位置329處具有脯氨酸至甘氨酸突變的變體Fe 區(qū)。野生型氨基酸的身份可以是未指定的，在這種情況下前述變體稱作329G。對于在本 發(fā)明中討論的全部位置，根據(jù)EU索引進行編號。EU索引或如Kabat或EU編號方案中 的 EU 索引指 EU 抗體的編號（Edelman 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 63(1969)78-85， 因而通過引用的方式完整并入）。改變可以是添加、缺失或突變。術(shù)語"突變"指 天然存在氨基酸的變化以及非天然存在氨基酸的變化，參見例如US 6, 586, 207、 WO 98/48032、WO 03/073238、US 2004/0214988、WO 2005/35727、WO 2005/74524， Chin，J.W·等人，J. Am. Chem. Soc. 124(2002)9026-9027 ;Chin，J.W·和 Schultz，P.G.， ChemBioChem 11 (2002) 1135-1137 ;Chin，J.W.等人，PICAS United States of America 99 (2002) 11020-11024 ;以及 Wang，L.和 Schultz，P. G.，Chem. (2002) 1-10 (全部文獻均通 過引用的方式完整并入本文）。
[0104] IgGl亞類的野生型人Fc區(qū)的多肽鏈具有以下氨基酸序列：
[0105] CPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREE QYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK( SEQ ID NO :41).
[0106] 帶有突變L234A、L235A的IgGl亞類的變體人Fe區(qū)的多肽鏈具有以下氨基酸序 列：
[0107] CPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREE QYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK( SEQ ID NO :42) ·
[0108] 帶有T366S、L368A和Y407V突變的IgGl亞類的變體人Fe區(qū)的多肽鏈具有以下氨 基酸序列：
[0109] CPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAK TKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDEL TKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMH EALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID N0：43).
[0110] 帶有T366W突變的IgGl亞類的變體人Fe區(qū)的多肽鏈具有以下氨基酸序列：
[0111] CPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREE QYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK( SEQ ID NO :44).
[0112] 帶有L234A、L235A和T366S、L368A及Y407V突變的IgGl亞類的變體人Fe區(qū)的多 肽鏈具有以下氨基酸序列：
[0113] CPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREE QYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK( SEQ ID NO ：45).
[0114] 帶有L234A、L235A和T366W突變的IgGl亞類的變體人Fe區(qū)的多肽鏈具有以下氨 基酸序列：
[0115] CPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREE QYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK( SEQ ID NO :46).
[0116] 帶有P329G突變的IgGl亞類的變體人Fe區(qū)的多肽鏈具有以下氨基酸序列：
[0117] CPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREE QYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK( SEQ ID NO :47) ·
[0118] 帶有L234A、L235A和P329G突變的IgGl亞類的變體人Fe區(qū)的多肽鏈具有以下氨 基酸序列：
[0119] CPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREE QYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK( SEQ ID NO :48) ·
[0120] 帶有P239G和T366S、L368A和Y407V突變的IgGl亞類的變體人Fe區(qū)的多肽鏈具 有以下氨基酸序列：
[0121] CPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREE QYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK( SEQ ID NO :49) ·
[0122] 帶有P329G和T366W突變的IgGl亞類的變體人Fe區(qū)的多肽鏈具有以下氨基酸序 列：
[0123] CPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREE QYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK( SEQ ID NO :50).
[0124] 帶有 L234A、L235A、P329G 及 T366S、L368A 和 Y407V 突變的 IgGl 亞類的變體人 Fe 區(qū)的多肽鏈具有以下氨基酸序列：
[0125] CPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREE QYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK( SEQ ID NO :51).
[0126] 帶有L234A、L235A、P329G和T366W突變的IgGl亞類的變體人Fe區(qū)的多肽鏈具有 以下氨基酸序列：
[0127] CPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREE QYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK( SEQ ID NO ：52).
[0128] IgG4亞類的野生型人Fe區(qū)的多肽鏈具有以下氨基酸序列：
[0129] CPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREE QFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK( SEQ ID NO :53).
[0130] 帶有S228P和L235E突變的IgG4亞類的變體人Fe區(qū)的多肽鏈具有以下氨基酸序 列：
[0131] CPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREE QFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK( SEQ ID NO :54).
[0132] 帶有S228P、L235E和P329G突變的IgG4亞類的變體人Fe區(qū)的多肽鏈具有以下氨 基酸序列：
[0133] CPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLM ISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPRE EQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLGSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVK GFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (SEQ ID NO ：55).
[0134] 術(shù)語"Fc受體"，簡寫為"FeR"，指與Fe區(qū)結(jié)合的受體。在一個實施方案中， FcR是天然序列人FeR。另外，在一個實施方案中，F(xiàn)cR是結(jié)合IgG抗體的FcR(Fe γ受 體）并且包括受體Fe γ RI、Fe γ RII、和Fe γ RIII亞類，包括其等位變體及備選地包括 其剪接形式。FcyRII受體包括Fcy RIIA( "激活性受體"）和Fe γ RIIB( "抑制性受 體"），它們具有主要在其胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域內(nèi)不同的相似氨基酸序列。激活性受體Fe γ RIIA 在其胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域中含有基于免疫受體酪氨酸的激活基序（ITAM)。抑制性受體Fe γ RIIB 在其胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域中含有基于免疫受體酪氨酸的抑制基序（ITIM)(參見例如DaSiOn， M. , Annu. Rev. Tmmunol. 15 (1997)203-234)。FcR 綜述于 Ravetch 和 Kinet，Annu. Rev. Immunol. 9 (1991) 457-492，Capel 等人，Immunomethods 4 (1994) 25-34，de Haas 等人， J. Lab. Clin. Med. 126 (1995) 330-341中。本文中的術(shù)語"FeR"涵蓋其他FeR，包括將來待鑒 定的那些。該術(shù)語還包括新生兒受體，F(xiàn)cRn，其負責母源IgG轉(zhuǎn)移至胎兒（參見例如Guyer 等人，J. Immunol. 117 (1976) 587 ;Kim 等人，J. Immunol. 24 (1994) 249)。
[0135] 術(shù)語"Fc Y受體"，簡寫為"Fc Y R"，指結(jié)合IgG抗體Fe區(qū)并且由Fe Y R基因編碼 的蛋白家族的任何成員。在人類中，這個家族包括但不局限于Fe γ RI (CD64)，包括同工型 Fe γ RIA、Fe γ RIB 和 Fe γ RIC ;Fc γ RII (CD32)，包括同工型 Fe γ RIIA(包括同種異型 H131 和 R131)、Fc γ RIIB (包括 Fe γ RIIB-I 和 Fe γ RIIB-2)和 Fe γ RIIC，以及 Fe γ RIII (CD16)， 包括同工型Fe γ RIIIA(包括同種異型V158和F158)和Fe γ RIIIB(包括同種異型 Fe γ RIIB-NAl 和 Fe γ RIIB-NA2)(參見例如 Jefferis 等人，Immunol. Lett. 82 (2002) 57-65， 通過引用的方式完整并入），以及任何未發(fā)現(xiàn)的人Fe γ Rs或Fe γ R同工型或同種異型。 Fe γ R可以來自任何生物，包括但不限于人、小鼠、大鼠、兔和猴。小鼠 Fe γ R包括但不限 于 Fe yRI(CD64)、Fe yRII(CD32)、Fe yRIII(CD16)和 Fe yRIII-2(CD16-2)以及任何未 發(fā)現(xiàn)的小鼠 Fe YR或Fe YR同工型或同種異型。參與Fe區(qū)-Fe YR相互作用的氨基酸 殘基是 234-239 (下部鉸鏈區(qū)）、265-269 (B/C 環(huán)）、297-299 (D/E 環(huán)）和 327-332 (F/G)環(huán) (Sondermann 等人，Nature 406 (2000) 267-273)。導(dǎo)致 Fe γ RI、Fc γ RIIA、Fc γ RIIB 和 / 或 Fcyriiia的結(jié)合/親和力降低的氨基酸突變包括N297A(同時伴隨降低的免疫原性和延 長的半壽期結(jié)合 / 親和力）（Routledge 等人，Transplantation 60(1995)847 ;Friend 等 人，Transplantation 68 (1999) 1632 !Shields 等人，J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604)、 殘基 233-236 (Ward 和 Ghetie，Ther. Immunol. 2 (1995) 77 ;Armour 等人，Eur. J. Immunol. 29 (1999) 2613-2624)。US 7, 355, 008 和 US 7, 381，408 中描述了一些示例性氨 基酸置換。
[0136] 術(shù)語"新生Fe受體"，簡寫為" FcRn "，指結(jié)合I gG抗體Fe區(qū)并且至少部分地 由FcRn基因編碼的蛋白質(zhì)。FcRn可以來自任何生物，包括但不限于人、小鼠、大鼠、兔 和猴。如本領(lǐng)域已知，有功能的FcRn蛋白包含兩種多肽，經(jīng)常稱作重鏈和輕鏈。輕鏈是 β -2-微球蛋白并且重鏈由FcRn基因編碼。除非本文中另外指出，否則FcRn或FcRn蛋白 指FcRn重鏈與β -2-微球蛋白的復(fù)合物。Fe區(qū)與FcRn的相互作用的氨基酸殘基在CH2 結(jié)構(gòu)域和CH3結(jié)構(gòu)域的交界附近。Fe區(qū)-FcRn接觸殘基均在單條IgG重鏈內(nèi)部。涉及的 氨基酸殘基是 248、250-257、272、285、288、290-291、308-311 和 314(全部在 CH2 結(jié)構(gòu)域 中）和氨基酸殘基385-387、428和433-436(全部在CH3結(jié)構(gòu)域中）。導(dǎo)致對FcRn的結(jié) 合/親和力增加的氨基酸突變包括T256A、T307A、E380A和N434A(Shields等人，181〇1· Chem. 276(2001)6591-6604)。
[0137] 術(shù)語"全長抗體"指具有與天然抗體結(jié)構(gòu)基本上相同的結(jié)構(gòu)和氨基酸序列的抗體 以及包含如本文中報道的Fe區(qū)的多肽。
[0138] 術(shù)語"全長抗體重鏈"指以N末端至C末端方向包含抗體可變結(jié)構(gòu)域、第一恒定結(jié) 構(gòu)域、抗體重鏈鉸鏈區(qū)、第二恒定結(jié)構(gòu)域和第三恒定結(jié)構(gòu)域的多肽。
[0139] 術(shù)語"全長抗體輕鏈"指以N末端至C末端方向包含抗體可變結(jié)構(gòu)域和恒定結(jié)構(gòu) 域的多肽。
[0140] 術(shù)語"鉸鏈區(qū)"指抗體重鏈多肽的部分，所述部分在野生型抗體重鏈中連接CHl 結(jié)構(gòu)域和CH2結(jié)構(gòu)域，例如根據(jù)Kabat的EU編號體系從約位置216至約位置230,或根據(jù) Kabat的EU編號體系從約位置226至約位置230?？梢酝ㄟ^與IgGl亞類序列的鉸鏈區(qū)半 胱氨酸殘基比對，確定其他IgG亞類的鉸鏈區(qū)。
[0141] 鉸鏈區(qū)正常情況下是由具有相同氨基酸序列的兩條多肽組成的二聚體分子。 鉸鏈區(qū)通常包含約25個氨基酸殘基并且是柔性的，允許抗原結(jié)合區(qū)獨立地移動。鉸 鏈區(qū)可以再劃分成三個結(jié)構(gòu)域：上部、中部和下部鉸鏈結(jié)構(gòu)域（參見例如Roux等人， J. Immunol. 161(1998)4083)。
[0142] 在一個實施方案中，鉸鏈區(qū)具有氨基酸序列DKTHTCPX4CP(SEQ ID N0:56)，其中X4 是S或P。在一個實施方案中，鉸鏈區(qū)具有氨基酸序列HTCPX4CP(SEQ ID N0:57)，其中X4 是S或P。在一個實施方案中，鉸鏈區(qū)具有氨基酸序列CPX4CP(SEQ ID N0:58)，其中X4是 S或P。
[0143] 術(shù)語Fe區(qū)的"下部鉸鏈區(qū)"指C末端緊鄰于鉸鏈區(qū)的一段氨基酸殘基，即根據(jù) Kabat的EU編號Fe區(qū)殘基233至239。
[0144] 術(shù)語"野生型Fe區(qū)"指與自然界中存在的Fe區(qū)的氨基酸序列相同的氨基酸序列。 野生型人Fe區(qū)包含天然人IgGlFc區(qū)（非A同種異型和A同種異型），天然人IgG2Fc區(qū)、天 然人IgG3Fc區(qū)和天然人IgG4Fc區(qū)及其天然存在的變體。
[0145] 相對于參考多肽序列的"氨基酸序列同一性百分數(shù)"定義為比對序列并根據(jù) 需要引入空位以實現(xiàn)最大序列同源性百分數(shù)并且不考慮任何保守性置換作為序列同一性 的部分之后，候選序列中與參考多肽序列中的氨基酸殘基相同的氨基酸殘基的百分數(shù)。為 了確定氨基酸序列同一性百分數(shù)的比對可以按本領(lǐng)域能力范圍內(nèi)的多種方式實現(xiàn)，例如， 使用可公開獲得的計算機軟件如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign (DNASTAR)軟件。本 領(lǐng)域技術(shù)人員可以確定用于比對序列的適宜參數(shù)，包括為實現(xiàn)正在比較的全長序列范圍內(nèi) 最大比對所需要的任何算法。然而，出于本文目的，使用序列比較計算機程序ALIGN-2產(chǎn) 生氨基酸序列同一性％值。ALIGN-2序列比較計算機程序由Genentech，Inc.授權(quán)，并且 源代碼已經(jīng)隨用戶文檔提交至華盛頓特區(qū)美國版權(quán)辦公室，在那里它以美國版權(quán)登記號 TXU510087 登記。ALIGN-2 程序從 Genentech, Inc. ,South San Francisco,加利福尼亞州 可公開獲得或可以從源代碼匯編。應(yīng)當將ALIGN-2程序匯編在UNIX操作系統(tǒng)（包括數(shù)字 式UNIX V4. 0D)上使用。全部序列比較參數(shù)由ALIGN-2程序設(shè)定并且不變動。
[0146] 在使用ALIGN-2比較氨基酸序列的情況下，如下計算給定氨基酸序列A與、同或針 對給定氨基酸序列B (這可以備選地描述為與、同或針對給定氨基酸序列B具有或包含某個 氨基酸序列同一性％的給定氨基酸序列A)的氨基酸序列同一性％是：
[0147] 100乘以分數(shù)X/Y
[0148] 其中X是由序列比對程序ALIGN-2在該程序的A和B比對結(jié)果中評定為相同匹配 的氨基酸殘基的數(shù)目，并且其中Y是B中氨基酸殘基的總數(shù)。將可以理解在氨基酸序列A 的長度不等于氨基酸序列B的長度時，A相對于B的氨基酸序列同一性％將不等于B相對 于A的氨基酸序列同一性％。除非另外特別聲明，否則本文所用的全部氨基酸序列同一性 值％如緊接前段中所述那樣使用ALIGN-2計算機程序獲得。
[0149] 術(shù)語"位置"指氨基酸殘基在多肽的氨基酸序列中的位置?？梢詫⑽恢靡来位蚋?據(jù)建立的格式（例如用于抗體編號的Kabat的EU索引）編號。
[0150] 術(shù)語"改變的"FcR結(jié)合親和力或ADCC活性指與親本多肽（例如包含野生型Fe區(qū) 的多肽）相比，具有增強或削弱的FcR結(jié)合活性和/或ADCC活性的多肽。與FcR "具有增 加的結(jié)合"的變體多肽以比親本或野生型多肽更低的解離常數(shù)（即更好/更高的親和力） 結(jié)合至少一種FeR。與FcR "具有降低的結(jié)合"的變體多肽以比親本或野生型多肽更高的解 離常數(shù)（即更差/更低的親和力）結(jié)合至少一種FeR。顯示降低的FcR結(jié)合的這類變體可 以擁有極少或不可評估的FcR結(jié)合，例如，與野生型或親本IgG Fe區(qū)相比0 - 20%的FcR結(jié) 合。
[0151] 與親本或野生型多肽相比以"減少的親和力"結(jié)合FcR的多肽是當多肽變體和親 本多肽的量在結(jié)合測定法中（基本上）大致相同時，與親本多肽相比，以（實質(zhì)地）減少的 結(jié)合親和力結(jié)合上文鑒定的任一種或多種FcR的多肽。例如，與其中測定FcR結(jié)合親和力 的親本多肽相比，F(xiàn)cR結(jié)合親和力減少的多肽變體可以在FcR結(jié)合親和力方面顯示I. 15倍 至約100倍、例如1. 2倍至約50倍減少。
[0152] 在人效應(yīng)細胞存在下比親本多肽更低效地"介導(dǎo)抗體依賴的細胞介導(dǎo)細胞毒性 (ADCC) "的包含變體Fc區(qū)的多肽是這樣的多肽，其中當測定法中所用的變體多肽和親本多 肽的量（基本上）大致相同時，所述多肽在體外或在體內(nèi)在介導(dǎo)ADCC方面（實質(zhì)地）更 低效。通常，將使用如本文中公開的體外ADCC測定法鑒定這類變體，但是構(gòu)思了用于確定 ADCC活性的其他測定法或方法，例如在動物模型中確定等。在一個實施方案中，變體在介導(dǎo) ADCC方面（例如在本文中公開的體外測定法中）比親本更低效約1. 5倍至約100倍，例如 約2倍至約50倍。
[0153] 術(shù)語"受體"指能夠結(jié)合至少一種配體的多肽。在一個實施方案中，受體是具有胞 外配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域和任選地其他結(jié)構(gòu)域（例如跨膜結(jié)構(gòu)域、胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域和/或膜錨定物） 的細胞表面受體。本文所述的測定法中待評價的受體可以是完整受體或者其片段或衍生物 (例如包含受體的結(jié)合結(jié)構(gòu)域與一種或多種異源多肽融合的融合蛋白）。另外，待評價其結(jié) 合特性的受體可以存在于細胞中或是分離的并任選地包被在測定法平板或某些其他固體 相上。
[0154] 術(shù)語"藥物制劑"指一種制備物，所述制備物處于這類形式從而允許其中所含的活 性成分的生物活性有效，并且不含有對于將會施用該制劑的對象不可接受地有毒的額外組 分。
[0155] "可藥用載體"指藥物制劑中除活性成分之外的對對象無毒的成分?？伤幱幂d體包 括但不限于緩沖劑、賦形劑、穩(wěn)定劑或防腐劑。
[0156] II.用于生產(chǎn)如本文報道的抗體Fc區(qū)綴合物的方法
[0157] 本文報道了用于產(chǎn)生包含抗體Fc區(qū)和特異性結(jié)合靶的結(jié)合實體的抗體Fc區(qū)綴合 物的方法，其包括下列步驟：
[0158] 一孵育i)特異性結(jié)合靶的結(jié)合實體，其在20個C末端氨基酸殘基內(nèi)包含氨基酸 序列G nSLPXlTG(SEQ ID Ν0:02, η = 1，2,或3，X1可以是任何氨基酸殘基，以及ii)在至少 一個N末端包含寡聚甘氨酸（Gm ;m = 1，2或3)的抗體Fc區(qū)，與酶分選酶A，并從而產(chǎn)生抗 體Fc區(qū)綴合物。
[0159] 本發(fā)明是基于這樣的發(fā)現(xiàn)，通過使用（i)特異性結(jié)合靶的結(jié)合實體，其在其C末端 區(qū)內(nèi)包含氨基酸序列G nSLPXlTG(SEQ ID N0:02，n=l，2,或3,且其中Xl可以是任何氨基 酸殘基），以及ii)至少在其N末端之一包含寡聚甘氨酸（Gni ;m = 1，2或3)的抗體Fc區(qū)， 與（iii)酶分選酶A，可以在酶促綴合中以高產(chǎn)量獲得包含抗體Fc區(qū)和特異性結(jié)合靶的結(jié) 合實體的綴合物。
[0160] 利用試劑的這一組合，在增加的反應(yīng)時間中通常發(fā)生的
[0161] i)將產(chǎn)物綴合物中的LP)(1TG(SEQ ID N0:01)氨基酸序列識別為底物的逆反應(yīng)，和 /或
[0162] ii)封端水解多肽片段（具有/沒有切割的LPX1TG(SEQ ID N0:01)識別序列的多 肽,通過由水而非Gm-抗體Fc區(qū)親核體切割硫代?；Y(jié)合實體分選酶A中間體而產(chǎn)生）的 生成，
[0163] 可以被減少甚至被消除。
[0164] 已經(jīng)測試了 C末端和N末端氨基酸序列組合的不同組合（參見例如圖3)。
[0165] 更詳細地，作為示例性結(jié)合實體，使用抗體Fab片段，并且作為示例性抗體Fc區(qū)， 使用單臂抗體Fc區(qū)（ΟΑ-Fc區(qū)=一對全長抗體重鏈及其同族輕鏈和重鏈抗體Fc區(qū)多肽）。 使用示例性轉(zhuǎn)肽酶分選酶A分別在抗體Fab片段VH-CHl重鏈的C末端和在OA-Fc區(qū)N末 端綴合三種不同序列。獲得9種不同綴合物。在不同時間點確定偶聯(lián)反應(yīng)的進程/效率。 為此目的，通過SDS-PAGE分析轉(zhuǎn)肽反應(yīng)的等分試樣。在72h反應(yīng)時間時從凝膠以密度測定 方式估計連接的效率。下表1中給出結(jié)果。
[0166] 表 L
[0167]
【權(quán)利要求】
1. 生產(chǎn)抗體Fc區(qū)綴合物的方法，所述方法使用用于將抗體Fc區(qū)酶促綴合至至少一個 結(jié)合實體的分選酶A，所述抗體Fc區(qū)綴合物包含重組抗體Fc區(qū)作為第一組分和特異性結(jié)合 靶的至少一個重組結(jié)合實體作為第二組分。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于包括下列步驟： 一孵育i)特異性結(jié)合靶的結(jié)合實體，所述結(jié)合實體在其20個C末端氨基酸殘基內(nèi)包 含氨基酸序列GnSLPXlTG(SEQ ID N0:02, n = 1、2,或3,其中XI可以是任何氨基酸殘基）， 以及ii)包含至少一個N末端寡聚甘氨酸6111〇11 = 2、3、4,或5)的抗體Fc區(qū)，與酶分選酶A， 并 從而生產(chǎn)抗體Fc區(qū)綴合物。
3. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項的方法，其特征在于特異性結(jié)合靶的結(jié)合實體在20個C 末端氨基酸殘基內(nèi)包含氨基酸序列GnSLPXlTGGSGS(SEQ ID勵:03，11 = 1、2，或3，且其中父1 可以是任何氨基酸殘基）。
4. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項的方法，其特征在于特異性結(jié)合靶的結(jié)合實體在20個C 末端氨基酸殘基內(nèi)包含氨基酸序列X2GSLPX1TGGSGS(SEQ ID N0:04,其中XI可以是任何氨 基酸殘基），以此X2可以是除甘氨酸之外的任何氨基酸殘基。
5. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項的方法，其特征在于特異性結(jié)合靶的結(jié)合實體在20個C 末端氨基酸殘基內(nèi)包含氨基酸序列GnSLPXlTGGSGSX3(SEQ ID N0:05，n=l、2或3且其中 XI可以是任何氨基酸殘基），以此X3是氨基酸序列標簽。
6. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項的方法，其特征在于特異性結(jié)合靶的結(jié)合實體選自包含 Fv、Fab、Fab'、Fab' -SH、F(ab'）2、雙體抗體、線性抗體、scFv、scFab、dsFv 的組。
7. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項的方法，其特征在于抗體Fc區(qū)至少在其N末端之一包含 兩個甘氨酸殘基。
8. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項的方法，其特征在于抗體Fc區(qū)至少在其N末端之一包含 氨基酸序列GGCPX4C(SEQ ID勵:07)，其中乂4是3或卩。
9. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項的方法，其特征在于抗體Fc區(qū)在其兩個N末端均包含氨 基酸序列GGCPX4C(SEQ ID勵:07)，其中乂4是3或卩。
10. 抗體Fc區(qū)綴合物，其通過根據(jù)權(quán)利要求1-9中任一項的方法獲得。
11. 抗體Fc區(qū)綴合物，其包含氨基酸序列GnSLPXlTGG(SEQ ID N0:09，n = 1、2或3并 且其中XI可以是任何氨基酸殘基）。
12. 藥物制劑，其包含根據(jù)權(quán)利要求10或11的抗體Fc區(qū)綴合物以及任選地可藥用載 體。
13. 根據(jù)權(quán)利要求10或權(quán)利要求11的抗體Fc區(qū)綴合物，其用作藥物。
14. 根據(jù)權(quán)利要求10或權(quán)利要求11的抗體Fc區(qū)綴合物在制備藥物中的用途。
【文檔編號】C07K16/00GK104411718SQ201380033529
【公開日】2015年3月11日 申請日期:2013年6月25日 優(yōu)先權(quán)日:2012年6月27日
【發(fā)明者】S·芬, E·科佩茨基 申請人:弗·哈夫曼-拉羅切有限公司